著者は、パーキンソン病、英国研究員（助成F1002）です。この作品は、メンバーが神経のUCL大学、シェフィールド大学とMRCのタンパク質リン酸化のユニットでからのものである英国パーキンソン病のコンソーシアムへの神経変性賞でウェルカムトラスト/ MRCジョイントコール（WT089698）（UKPDC）によって部分的にサポートされていましたダンディーの大学。

安全性 以下に記述されたプロトコルは、ATPがLRRK2のキナーゼ活性に従うようにγのリン酸の位置にある放射性32 Pで標識利用しています。それは材料と正確な条件は機器やプロトコルなどのガイドとして取られるべきである我々の研究室で使用される標準のプロトコルに基づいており、そのゲルの実行などの処理の手順の多くに関して、 とceteraウェスタンブロットされこれらのプロセスで使用されるには、研究室から研究室に異なります。電離放射線放出する同位元素を含む化合物は、機関と国レベルで人間の健康と厳格なライセンシングと規制への潜在的に有害であり、その使用を制御します。このプロトコルでの実験は、（ガイドラインAVA大学での安全性サービスによって提供された優良試験所の診療ガイドラインカレッジロンドン大学のオープンソースの放射線利用の訓練に続いて、以下を実施したでilable <a href="http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf">http://www.ucl.ac.uk/estates/safetynet/training/glp_hurs.pdf</a> ）。オープンソースの放射線の使用は、適切な訓練と規制当局の承認の前に実行しないでください。実験室研究におけるオープンソースの放射線の責任規制機関は、国によって異なる。これらの例は次のとおりです。イギリスで、安全衛生執行（ <a href="http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm">http://www.hse.gov.uk/radiation/ionising/index.htm</a>米国では）、原子力規制委員会は、（ <a href="http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html">http://のwww.nrc.gov /素材/ミオー/ regsは-ガイド- comm.html</a> ）、カナダカナダ原子力安全委員会（で<a href="http://nuclearsafety.gc.ca/eng/">http://nuclearsafety.gc.ca/eng/</a> ）、およびドイツダスBundesamtこだわりStrahlenschutzで（ <a href="http://www.bfs.de/de/bfs">HTTP ：/ / www.bfs.de /解除/ BFS</a> ）。他の国のユーザーはそれらの放射線安全管理者とローカルルール、規制とライセンシング機関を確認する必要があります。このプロトコルに関連する安全上の注意は、放射性三つ葉形のシンボルを強調表示、テキストに記載されている（ <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="シンボル1" /> ）。 1。キナーゼ反応の準備<img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="シンボル1" />すべての反応混合物は、放射能のまん延を防ぐために、Oリングが含まれているスクリューキャップと1.5ミリリットルのサンプルチューブに用意。 <ol><li>氷上で融解蛋白質 - LRRK2野生型、D1994A、G2019S。 </li><li>氷上で反応を作る - 10nmのLRRK2、水で50μlのために作ら0.5μg/μlMBP、10 ×キナーゼバッファーの5UL、。 </li></ol> 2。アッセイを実行する<img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="シンボル1" /> 32 P ATPを利用するすべてのステップは、pを取る必要があります指定された放射線地域でのレース。 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="シンボル1" />適切な個人用保護具を着用してください - 私たちの研究室での標準業務手順書の下で、これらは白衣、二重手袋および保護眼鏡を含む。 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="シンボル1" /> 32 P ATPを含む試料を曝露を最小限にするために、6ミリメートルパースペックスの画面でユーザから遮蔽する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="シンボル1" />適用可能な、個人的な監視装置を使用する必要がどこに - UCL内で、任意の認定されたオープンソースの放射線のユーザーは、実験中の放射線被ばくを監視するためのフィルムバッジを持っている必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="シンボル1" />すべての実験的な面は、芸を使って使用前と使用後の放射能汚染のために評価すべきであるドイツカウンタ。 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="シンボル1" />すべての汚染の可能性のある消耗品は、放射性廃棄物処分のための制度のガイドラインを厳守で処分されるべきである。 <ol><li>アッセイを始める前に、° Cおよび100 ° Cをそれぞれ30に加熱ブロックを設定する</li><li> -20フリーザー（保管条件は、往復32 P ATPが使用されてradionucleotidesの供給者またはタイプによって異なる場合があることに注意）から32 P ATPを削除します。 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="シンボル1" />パースペックス画面の後ろに解凍、使用前に容器の外にスキャンする。 </li><li>氷上で反応して、冷たいATPの10μMと共に、それぞれに32 P ATPの1μlを加える。 </li><li>ピペットでよく混ぜる。 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="シンボル1" />パルスは、汚染のリスクを最小限に抑え、チューブの底に液体持って遠心。 </li><li>ゼロ時間のポイントの15μlアリコートを削除するD 100 4X SDSサンプルバッファーと変性5μlの添加による一定量の反応℃で10分間を終了。 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="シンボル1" />パルスは、汚染のリスクを最小限に抑え、チューブの底に液体持って遠心。 </li><li>残りのサンプルでは、​​加熱ブロック内に配置し、60分間30℃でインキュベート。 </li><li> 15μlの100 4X SDSサンプルバッファーと変性5μlの中に加え℃で10分間で終了して60分の時点と反応で除去する。 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="シンボル1" />パルスは、汚染のリスクを最小限に抑え、チューブの底に液体持って遠心。 </li></ol> 3。サンプルを免疫ブロッティングし、結果を分析<ol><li> SDS - PAGE上で動作するサンプル<ol><li> 10も4から12パーセントビス - トリスのポリアクリルアミドゲルは、MOPS泳動バッファーを用いて電気泳動のために準備。 </li><li>各サンプルの20μlのはシャープの7μlと一緒にゲル上にロードTainのタンパク質標準はしご。 </li><li>ゲルは、90分間160Vで動作、または色素フロントがゲルの端に達するまで。 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="シンボル1" />放射性同位体と接触するすべての液体は、放射性廃棄物として扱われ、制度的なガイドラインに従って廃棄してください。液体放射性廃棄物が大量の水で指定された放射性廃棄ヒートシンクを下に注ぐことによって破棄されなければなりませんUCL規制状態。 </li></ol></li><li>タンパク質はウェスタンブロットを経由して PVDF膜に転写した。 <ol><li>転送バッファは、1 ×トリスグリシンを加えた20％のメタノールを準備した。 PVDFメンブレン、ろ紙、ゲルのサイズを修正するためにカットし、ろ紙の場合の転送バッファを有する膜またはプリウェットの場合には氷河のメタノールで活性化。膜は、配向性の識別を可能にするためにボールペンインクであらかじめ標識する必要があります。 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495symbol1.jpg" alt="シンボル1" />ゲルプラストから削除ICケーシングと過剰アクリルアミドは、放射性廃棄物として除去し、処分。 </li><li>ゲルは、気泡が膜とゲルの間に存在しないことを確実に、メンブレンおよびフィルターペーパーでサンドイッチ状に形成し、ゲルとアノードとの間の膜とウェスタンブロット装置内に配置する必要があります。 </li><li>転送は、16時間25Vで実施。 </li></ol></li><li> PVDFに蛋白質の転送に続いて、メンブレンを室温で乾燥させる。最後に、乾燥した膜は酢酸セルロースシートの間に分離し、蛍光体の画面または放射性標識タンパク質の検出を可能にするためにX線フィルムのいずれかに公開される必要があります。露光時間は、使用される放射性同位元素と反応の酵素反応速度の比活性に応じて週にわたって、数時間から実行することができます。 </li><li> Phosphoscreenは、処理/フィルムをスキャン。蛍光体の画面を使用している場合、画像はフィルムを使用する場合はその後結果トランジェント、高解像度のTIFFまたはビットマップファイルとして保存する必要がありますsparencyは、デスクトップスキャナを使用してスキャンし、高解像度のTIFFまたはビットマップファイルとして保存する必要があります。イメージは、ImageJの、健康のウェブサイトの国立研究所（上で利用可能なフリーウェアのプログラムで解析することができます<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ）。 </li></ol> 4。代表的な結果図1は、アッセイの一般的なリン酸受容体基質としてミエリン塩基性タンパク質と野生型、G2019SとD1994A LRRK2を用いて行うための代表的な結果を示しています。 LRRK2の自己リン酸化は20 - 40kDaから見えるリン酸化MBPを表す複数のバンドで、≈200kDaで表示されます。 D1994A（キナーゼデッド）レーンでの自己リン酸化の有無に注意してください、と原因G2019S変異にリン酸化を増加。キナーゼデッド車線でもMBPの残留リン酸化に注意してください。これは、D1994A変異によるLRRK2のキナーゼ活性の不完全なアブレーションによるものやプレゼンスOを反映しているのかもしれないfは反応の汚染キナーゼをトレース。 <img src="/files/ftp_upload/3495/3495fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。

<ol>
	<li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+ROCO+proteins+in+health+and+disease.">The function of ROCO proteins in health and disease.</a> Biol. Cell. 101, 183-191 (2009).</li><li>Paisan-Ruiz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson's+disease.">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44, 595-600 (2004).</li><li>Zimprich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology.">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44, 601-607 (2004).</li><li>West, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease-associated+mutations+in+leucine-rich+repeat+kinase+2+augment+kinase+activity.">Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 16842-16847 (2005).</li><li>Gloeckner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson+disease+causing+LRRK2+mutation+I2020T+is+associated+with+increased+kinase+activity.">The Parkinson disease causing LRRK2 mutation I2020T is associated with increased kinase activity.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 223-232 (2006).</li><li>Lewis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+R1441C+mutation+of+LRRK2+disrupts+GTP+hydrolysis.">The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 668-671 (2007).</li><li>Greggio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+activity+is+required+for+the+toxic+effects+of+mutant+LRRK2/dardarin.">Kinase activity is required for the toxic effects of mutant LRRK2/dardarin.</a> Neurobiol. Dis. 23, 329-341 (2006).</li><li>Smith, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinase+activity+of+mutant+LRRK2+mediates+neuronal+toxicity.">Kinase activity of mutant LRRK2 mediates neuronal toxicity.</a> Nat. Neurosci. 9, 1231-1233 (2006).</li><li>Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+selective+inhibitor+of+the+Parkinson's+disease+kinase+LRRK2.">Characterization of a selective inhibitor of the Parkinson's disease kinase LRRK2.</a> Nat. Chem. Biol. 7, 203-205 (2011).</li><li>Lee, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+leucine-rich+repeat+kinase-2+protect+against+models+of+Parkinson's+disease.">Inhibitors of leucine-rich repeat kinase-2 protect against models of Parkinson's disease.</a> Nat. Med. 16, 998-1000 (2010).</li><li>Nichols, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+inhibitors+of+LRRK2,+a+protein+kinase+mutated+in+Parkinson's+disease.">Substrate specificity and inhibitors of LRRK2, a protein kinase mutated in Parkinson's disease.</a> The Biochemical Journal. 424, 47-60 (2009).</li><li>Anand, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+leucine-rich+repeat+kinase+2:+enzymological+properties+and+novel+assays.">Investigation of leucine-rich repeat kinase 2: enzymological properties and novel assays.</a> FEBS. J. 276, 466-478 (2009).</li><li>Daniels, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+mode+of+action+of+the+LRRK2+Y1699C+pathogenic+mutant.">Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant.</a> Journal of Neurochemistry. 116, 304-315 (2011).</li><li>Jaleel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRK2+phosphorylates+moesin+at+Thr558;+characterisation+of+how+Parkinson's+disease+mutants+affect+kinase+activity.">LRRK2 phosphorylates moesin at Thr558; characterisation of how Parkinson's disease mutants affect kinase activity.</a> Biochem. J. , (2007).</li><li>Qing, H., Wong, W., McGeer, E. G., McGeer, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lrrk2+phosphorylates+alpha+synuclein+at+serine+129:+Parkinson+disease+implications.">Lrrk2 phosphorylates alpha synuclein at serine 129: Parkinson disease implications.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 387, 149-152 (2009).</li><li>Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+4E-BP+by+LRRK2+affects+the+maintenance+of+dopaminergic+neurons+in+Drosophila.">Phosphorylation of 4E-BP by LRRK2 affects the maintenance of dopaminergic neurons in Drosophila.</a> Embo. J. 27, 2432-2443 (2008).</li><li>Greggio, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson+disease-associated+leucine-rich+repeat+kinase+2+(LRRK2)+is+a+dimer+that+undergoes+intramolecular+autophosphorylation.">The Parkinson disease-associated leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a dimer that undergoes intramolecular autophosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 283, 16906-16914 (2008).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome.">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

本論文では、in vitroの系で使用してLRRK2のキナーゼ活性を測定するための基本的なプロトコルを説明しています。簡潔の利益のために、これは一般的な基板を使用して1時間のエンドポイントのテンプレートに限らず、一般的なプロトコルは、潜在的な基質の範囲に適用し、LRRK2のキナーゼ活性の動態を調べる、より高度な分析に適しているされています。これは、このようなタンパク質のキナーゼの挙動を調べるためにin vitroの系で使用しての重要な利点の一つに焦点を当てています。酵素と基質の濃度を完全に制御があるので、それは運動データを生成し、K mを計算することが可能です。反応のためとVmax値。より詳細な速度論的評価のためにまたは推定される阻害剤の影響を評価する、より高いスループットのシステムは、（そのようなLRRKtide基板を使用することによって与えられるものと、Invitrogen社から入手可能）に優れalternatiですここで説明したアプローチにVEの使い方。 それが重要である、しかし、in vitroでのキナーゼアッセイでで提供される還元主義モデルシステムであることを認識するが、1つのツールでは、キナーゼおよび潜在的な基質との関係の生物学を検討する。このようなアッセイからのデータは、キナーゼは、in vitroおよび細胞の文脈でどのように動作するかの包括的な画像を得るために他のアプローチと組み合わせて使用する必要があります。例えば、in vitroでリン酸化推定基板は、その後、機能を調べるために標的特異的変異誘発（ 例えば、。などアラニンなどなし-リン酸化可能な残基にセリンまたはスレオニンリン酸受容体の残基を変換する）ことによって操作できる可能phosphositesを識別するために、質量分析によって解析することができますリン酸化のex vivoでの結果。 このようなin vitroでのアッセイシステムからデータの解釈に重要な考慮事項は、eitheの可能性です。RタイプIまたはタイプII（偽陽性または偽陰性）のエラー。このシステムの還元主義の性質が、残念ながら両方にそれを破棄する - 前者の場合には、精製された推定上の基質を有する人工的に近く、かつ高濃度（細胞環境と比較して）でのキナーゼを精製することartefactualリン酸化事象が発生する可能性があります。逆に、多くのキナーゼは、細胞のコンテキスト内で複合体の一部として機能し、発生する特定の基質のリン酸化のために補助因子を必要とする。上述したように、推定上の基質のリン酸化から肯定的な結果は 、in vitro のアッセイ系で使用しては、その結果を検証するためのセルラーシステムでテストする必要があります、と否定的な結果は慎重に解釈されるべきである。 これに照らして、それは興味のあるキナーゼの活性の比較研究を可能にするために、正と負の両方のコントロールを持つことが可能どこが重要です。正のcontroの慎重な選択あなたの推定上の基質をリン酸化する可能性は低いネガティブコントロールと一緒に、目的のタンパク質に向かって、既知の活性を有するLは、非常に貴重です。 LRRK2のための一つの候補のコントロールは、LRRK2のキナーゼドメインに密接に関連する一次配列を持っているが、非常に異なる全体的なドメイン構造18を有するキナーゼ3を、相互作用する受容体です。これは、Invitrogenから組換えタンパク質として利用可能であり、当研究室で標準のコントロールとして使用されます。 これは、LRRK2の市販の形態は、タンパク質のN末端を欠いているとグルタチオン- S -トランスフェラーゼとは、このタグ付けされているこのタンパク質をキナーゼアッセイを行う際に、潜在的な交絡因子として考慮されるべきであることにも留意する必要があるそれが知られていないとして、LRRK2のN末端は、このタンパク質の正常な機能にどのような役割を果たす可能性があります。例えば、タンパク質には存在しないLRRK2のN末端部分は、このプロトコルで使用する場合、その後、これは上述のin vitroの系で基板を前記観測されたリン酸化に大きな影響を与えるLRRK2のキナーゼドメインに特異的な基質の動員に重要である。 てもこれらの点に注意し、しかし、パーキンソン病研究にLRRK2の生物学に接続されている重要性は、in vitroでの設定でこの蛋白質の動作を調べるための貴重なツールとして、このプロトコルの有用性を強調。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> LRRK2野生型</td><td>インビトロジェン</td><td> PV4873 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2のG2019S </td><td>インビトロジェン</td><td> PV4881 </td><td></td></tr><tr><td> LRRK2 D1994A </td><td>インビトロジェン</td><td> PV6051 </td><td></td></tr><tr><td>キナーゼバッファー</td><td>細胞シグナリング</td><td> 9802S </td><td></td></tr><tr><td> MBP </td><td>シグマ</td><td> M1891 </td><td></td></tr><tr><td> 32PグラムATP </td><td>パーキンエルマー</td><td> BLU002X500UC </td><td> 500μCi、30Ci /ミリモル</td></tr><tr><td> 4X LDSサンプルバッファー</td><td>インビトロジェン</td><td> NP0007 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td>シグマ</td><td> M6250 </td><td></td></tr><tr><td>タンパク質の基準</td><td>インビトロジェン</td><td> LC5800 </td><td></td></tr><tr><td>バッファを実行MOPS </td><td> Invitrogen </td><td> NP0001 </td><td></td></tr><tr><td>ビス - トリスアクリルアミドゲル</td><td>インビトロジェン</td><td> NP0321 </td><td> 4〜12パーセント1ミリメートル10well </td></tr><tr><td> PVDF膜</td><td>ミリポア</td><td> IPVH00010 </td><td></td></tr><tr><td>転送バッファ</td><td>インビトロジェン</td><td> NP0006 </td><td></td></tr></tbody></table>表1。試薬蒸留および脱イオン水は、すべての希釈のステップのために使用された<table border="1"><tbody><tr><td> 機器のタイプ </td><td> 会社 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ガイガーカウンター</td><td>ミニ楽器</td><td></td></tr><tr><td> SDS PAGEタンク</td><td>インビトロジェン</td><td></td></tr><tr><td>転送タンク</td><td>インビトロジェン</td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック（2） </td><td>エッペンドルフ</td><td></td></tr><tr><td>蛍光スクリーン</td><td> GE </td><td> X線フィルムで代用することができます</td></tr><tr><td>蛍光体Iマーガー</td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td>露出カセット</td><td> GE </td><td></td></tr><tr><td>遠心</td><td>エッペンドルフ</td><td></td></tr><tr><td>パースペックスシールド</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1.5ミリリットルチューブ</td><td> VWR </td><td> Oリング付きのスクリュートップ</td></tr></tbody></table>表2。機器の

assaying the kinase activity of lrrk2 in vitro

ロイシンリッチリピートキナーゼ2（LRRK2）はGTPaseドメイン（複合タンパク質のRasのために、ROCと呼ばれる）とキナーゼドメイン1を含む複雑な、マルチドメイン構造を有する、タンパク質のROCOファミリーの2527アミノ酸のメンバーです。パーキンソン病（PD）を引き起こすLRRK2の突然変異の2004年の発見は、その正常な機能の研究の膨大な量の焦点であることLRRK2をもたらし、どのようにタンパク質が病気の状態2,3でゆがんで行く。 LRRK2の機能への初期の調査では、その酵素活性4-6焦点を当てた。鮮明な画像が変異によりこれらの一貫した変化の出現にまだあるが、グループの数のデータは、突然変異7,8にリンクされている細胞死におけるLRRK2のキナーゼ活性の重要性を強調している。最近の出版物は、主要な実験ツール9-11を提供し、LRRK2のキナーゼ活性を標的とする阻害剤を報告している。これらのデータに照らして、それ彼らはパーキンソン病のための潜在的な創薬ターゲットであるかどうか議論の余地があるがLRRK2の酵素的性質は、このタンパク質の生物学への私たちに重要なウィンドウを買う余裕がいる可能性があります。 異なるアプローチの数は、アッセイLRRK2のキナーゼ活性をするために使用されている。当初は、アッセイはアッセイで、哺乳動物細胞株で過剰発現し、免疫エピトープタグ融合タンパク質を用いて実施されたアガロースビーズ4,5,7に固定化されたこのタンパク質を用いて行った。その後、溶液中のLRRK2の組み換え断片を精製することもLRRK2 12の2527年に残基970を含む昆虫細胞から精製されたGSTタグ付きフラグメントは、例えば、使用されている。最近、ダニエルらヒト胚性腎細胞からのソリューションの完全な長さのLRRK2の分離を報告した、しかし、この蛋白質は13広く利用されていないです。対照的に、LRRK2のGST融合切断型が市販さavailablですE（Invitrogen社から、詳細は表1を参照）、およびLRRK2のキナーゼ活性のアッセイを実証するための便利なツールを提供しています。 LRRK2のキナーゼ活性のためのいくつかの異なる出力が報告されている。モエシンにおけるスレオニン558のリン酸化に基づいて名付けられたLRRKtide、 - - LRRK2自体の自己リン酸化、人工基質の一般的なキナーゼの基質とリン酸化などのミエリン塩基性タンパク質（MBP）のリン酸化は、すべての推定生理学的基質のシリーズを持っているとして、使用されているα-シヌクレイン、モエシンと4 - EBP 14-17など。 LRRK2の基質として、これらのタンパク質の状態は不明のままである、とそのようなプロトコルは以下に説明するようにすると、潜在的な基質の範囲に対して向けられたアッセイLRRK2のキナーゼ活性には、このシステムの有用性を指摘し、汎用的な基質としてMBPを使って焦点を当てます。

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Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

ロイシンリッチリピートキナーゼ2は、大規模なマルチドメインのキナーゼ、パーキンソン病の最も一般的な遺伝的原因であるの変異です。このタンパク質のキナーゼ活性の分析は、このタンパク質の生物学と機能障害を理解する上で重要なツールであることが証明されている。本論文では、<em&gt; in vitroで</em&gt; LRRK2のキナーゼ活性のアッセイおよびその変異体の選択は、推定上の基質と疾患におけるLRRK2の潜在的な機能不全のリン酸化を調べるために実験システムを提供し、説明しています。

LRRK2のキナーゼ活性を測定する in vitroで</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

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Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

22.4K ビュー.  UCL Institute of Neurology. ロイシンリッチリピートキナーゼ2は、大規模なマルチドメインのキナーゼ、パーキンソン病の最も一般的な遺伝的原因であるの変異です。このタンパク質のキナーゼ活性の分析は、このタンパク質の生物学と機能障害を理解する上で重要なツールであることが証明されている。本論文では、 in vitroで LRRK2のキナーゼ活性のアッセイおよびその?...

ビデオ: Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals. Here, we describe an in vitro assay, "the reorientation assay", that has been used extensively to study the effect of extrinsic and intrinsic signals on the orientation of commissural axons2. This assay was developed by numerous people in the laboratories of Jane Dodd, Thomas Jessell and Andrew Lumsden (see acknowledgements for more details) and versions of this assay were used to demonstrate the reorientation activities of key axon guidance molecules, including the BMP chemorepellent in the roof plate3,4 and the chemoattractive activities of Netrin15 and Sonic Hedgehog (Shh)6 in the floor plate in the spinal cord.
Explants comprising 2-3 segments of the dorsal two-thirds of spinal cord are dissected from embryonic day (E) 11 rats and cultured in three dimensional collagen gels7. E11 dorsal spinal explants contain newly born commissural neurons, which can be identified by their axonal expression of the glycoprotein, Tag18. Over the course of 30-40 hours in culture, the commissural axon trajectory is recapitulated in these dorsal explants with a time course similar to that seen in vivo. This axonal trajectory can be challenged by placing either test tissues or a COS cell aggregate expressing a candidate signaling molecule in contact with one of the lateral edges of the dorsal explant. Commissural axons extending in the vicinity of the appended tissue will grow under the influence of both the endogenous roof plate and signals from the ectopic lateral tissue. The degree to which commissural axons are reoriented under these circumstances can be quantified. Using this assay, it is possible both to examine the sufficiency of a particular signal to reorient commissural axons3,4 as well the necessity for this signal to direct the commissural trajectory9.

This assay assesses the ability of a signaling molecule, here Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), to reorient commissural axons. An explant of embryonic dorsal spinal cord is cultured adjacent to an aggregate of COS cells secreting the candidate growth factors. Reoriented commissural axons growing within the explant are visualized by immunohistochemistry.

胚脊髄交連軸索アンテナの向きに拡散性のシグナル伝達分子の能力を検定する

Dorsal commissural axons in the vertebrate spinal cord1 have been an invaluable model system in which to identify axon guidance signals.  Here, we ...

生物学

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

アクティブT.の試験管内再構成でcastaneumのテロメラーゼ

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

酵素酢酸キナーゼのアセテート形成活性の直接検出

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

天然のタンパク質からアミロイドの迅速な生成<em&gt;インビトロ</em

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

植物では無細胞系でプロテアソームによる分解をアッセイ

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This protocol repurposes an instrument often used to measure adult activity, the TriKinetics Drosophila activity monitor (MB5 Multi-Beam Activity Monitor) to study larval activity. The instrument can monitor the movements of animals in 16 individual 8 cm glass assay tubes, using 17 infrared detection beams per tube. Logging software automatically saves data to a computer, recording parameters such as number of moves, times sensors were triggered, and animals&#8217; positions within the tubes. The data can then be analyzed to represent overall locomotion and/or position preference as well as other measurements. All data are easily accessible and compatible with basic graphing and data manipulation software. This protocol will discuss how to use the apparatus, how to operate the software and how to run a larval activity assay from start to finish.

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

This report describes a method for measuring Drosophila larval activity using the TriKinetics Drosophila Activity Monitor. The device employs infrared beams to detect movements of up to 16 individual animals. Data can be analyzed to represent motion parameters including rates and the positions of the animals within the assay chambers.

幼虫活性の測定<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アクティビティモニタ

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.