この作品は、教育研究（NeurotechnologyためのバーンスタインフォーカスT.モーザーに、01GQ0810を付与し、MED-ELドイツ）ドイツ連邦省によってサポートされていました。脳のナノスケール顕微鏡および分子生理学のためのセンターでドイツ研究財団（FZ​​T 103、T.モーザー）とSFB889を通して、）N. Strenzke及びT.モーザーする。

この作品で提示全ての実験は、実験動物の保護のためにドイツの法律で定義された倫理基準を用いて行った。動物福祉のための大学ゲッティンゲンのボードとニーダーザクセン州の状態の動物福祉事務所は実験を承認した。 μLED-刺激剤の調製<ol><li> μLEDs、最初μLED-刺激装置を準備します。 200μmの活性表面200と青色LEDを使用してください（μLED、材料表を参照のこと）。 </li><li> μLEDへのはんだワイヤー。その後、μLEDとエポキシ接着剤を使用して接続をカプセル化します。エポキシ硬化をできるように、デバイスを一晩にしておきます。 </li><li>機械的安定性及び電気的絶縁のために、薄いガラスキャピラリーを通してワイヤを漏斗1ミリメートル、外径のホウケイ酸の毛細管を使用し、エポキシ（ 図1D）との接合部を密封するキャピラリー機械的マニピュレーターに取り付けることができるようになっている。 注：Tここでは（刺激アーチファクトを回避する）良好な電気的絶縁を得るために十分な厚さのカプセルを作る、トレードオフがありますが、十分薄いLEDはブラの中に自由に移動できるようにし、蝸牛にそれを見つけること。これは、複数のLEDを用意することをお勧めします。 </li><li>良好な電気的絶縁を確認するには、最初の液体中に、0.9％NaClおよびディップ3裸終了銅線とペトリ皿を準備します。これは、ABR電極を有する動物をシミュレートするのに役立つ。 ABR-アンプに、そこからオシロスコープへの配線を接続します。 </li><li>その後、刺激装置にLEDを接続し、それが完全に覆われるまで溶液中にそれを浸す。 20分以上のための現在の許容される最大で（ステップ3.1.1を参照）パルスでLEDを駆動し、刺激アーティファクトを確認してください。彼らが表示される場合は、LEDを破棄し、新しいものを試してみてください。 </li></ol> 2外科的手技<ol><li> Thy1.2プロモーター下にChR2を発現している4-10週齢のトランスジェニックマウス（9行を使用してください）Wang ら 13。動物を操作し、手術を行うためには、常に清潔で特定された手術器具を使用しています。 </li><li>ウレタン（1.32ミリグラム/ kg）を、キシラジン（5mg / kgの）の混合物の腹腔内注射で動物を麻酔し、ブプレノルフィンは0.1μg/ gで、0.9％滅菌NaCl溶液中に希釈し、身体を維持するための加熱プレートの上にマウスを置き37℃での温度。この用量では、全身麻酔は、通常、全体の実験プロトコル持続します。 <ol><li>足引っ込め反射による覚醒の兆候が最初の麻酔導入確認後の10分の開始。動きの場合には、（キシラジンなし）0.9％滅菌NaCl溶液で希釈したウレタン（0.66ミリグラム/ kg）およびブプレノルフィン（0.05μgの/ g）での維持用量を適用する。ここでも足引っ込め反射をチェックして、反射が存在しない場合にのみ進みます。 </li></ol></li><li>慎重に切開の製造における耳介の領域を剃る。耳介を使用してください水疱（空気含有中耳腔）に到達するためのアプローチ。 <ol><li>マイクロピンセットで慎重に解剖および/ ​​または首の筋肉の一部を除去、 たとえば、広頸筋、胸鎖乳突筋、およびscalenes。 </li><li>検索と水疱（ 図1A）を露出。鼓膜（ 図1A）の挿入を示しているブラ表面上のリングを有する特徴的な球状の形状を有する骨構造としてブラを識別します。ちょうどこのリング下のインスリン針の先端の穴を作る。蝸牛の岬角（ 図1B）が露出されるように、細かい骨鉗子（齧歯動物）またはマイクロピンセットで水疱を覆っている骨を取り除く、そこに開始します。 </li></ol></li><li>無傷の膜迷路（ 図1B）を残すように注意しながら、：蝸牛のために、静かに小さなウィンドウを開きます（〜500〜800ミクロン蝸牛）を骨のカプセルを剃り落とす。第二蝸牛に蝸牛を実行しますそれはあぶみ骨動脈からと頂点から十分離れているようにしてください。頂点を開くと、蝸牛軸の破断などの蝸牛の破裂を作り出すことができる。 </li><li>鼓室階への光ファイバやμLEDインプラントの丸窓の挿入のため、慎重に鋭利な外科用メス（ブレード番号11は良いオプションです）の先で骨のニッチを引っ掻くことで丸い窓の隙間を拡大する。常に新しいブレードまたは外科用メスを使用しています。あぶみ骨動脈が丸いウィンドウ（ 図1B）に非常に近い動作するように十分注意してください。 </li></ol> 2つのアプローチを使用して3。光刺激<ol><li> transcochlearの刺激のために、μLEDsやファイバ結合レーザを使用しています。 <ol><li>機械式マニピュレータ上μLEDを運ぶ毛細血管をマウントし、慎重に蝸牛にμLEDを配置。利用oABR、位置を最適化するための手段として、1〜5 Hzの電流源（2.7 Vで、通常、5〜40ミリアンペア）から3-10ミリ秒の長い刺激によって誘発されると、またはμLEDのientation。 </li><li>レーザー刺激のために、473nmの連続波レーザと250μmの光ファイバ（材料を参照）を使用しています。カップルが理想的（光学的刺激を定義するために音響光学素子や高速シャッターを使用する他の）電力の高速なアナログ制御を提供しています青色レーザ光源と光ファイバ。マイクロマニピュレーターを使用して、蝸牛に直接ファイバの先端を見つけ、歯科用セメント（transcochlear刺激）を使用して、そこにそれを修正。 </li></ol></li><li>蝸牛内刺激のために、鼓室階の丸窓からファイバーを挿入します。その後oABRを引き出すために1-5 Hzで10〜30 mWの（ファイバ出力のパワー）の3-10ミリ秒のレーザーパルスを使用しています。 oABRの大きな振幅は、読み出しとしてoABR振幅を用いて、エミッタ（μLEDまたはファイバ）の位置と方向を最適化するために、オシロスコープ上で単一の刺激により惹起さoABRを観察する実験を可能にします。 </li><li>良いoABRが達成されたら、cyanoacrを有する繊維を修正ラート接着剤又は歯科用セメントや接着剤が固体になるまで待ちます。 注：それは、蝸牛から出てくるいくつかの液体を観察するようにするのが普通です。しかし、セメントの重合に伴う問題を回避するためには、上質なコットン芯を使用してリージョンを枯渇することをお勧めします。 </li></ol> oABR 4。録音<ol><li>頂点に、足に近い背中に、耳介の下に針電極を挿入し、アンプに接続します。 </li><li>頂点間の差電位を増幅し、皮下注射針を乳様突起。 50 kHzとフィルター（1〜10,000ヘルツ）の速度でサンプリングする。光刺激装置の位置を最適化するための理想的記録セットアップ近いオシロスコープの差電位を可視化。信号平均（50-1,000x）を使用してオフライン解析用コンピュータ上のデータを格納します。 </li></ol>光学的に誘発ローカル電場電位の5。録音<ol><li>定位フレームに動物を配置します。鉗子セントの使い方ラリーは、頭蓋を覆う皮膚を引っ張るとハサミは大きく首の筋肉は頭蓋骨に付着する点に目の間から延びる正中切開を行う。 <ol><li>横方向に皮膚を反映している。矢状縫合に沿って縦に骨膜を切り、静かに綿棒で露光頭蓋骨を擦ってそれを側方を削除します。 </li></ol></li><li>プレートとラムダの尾側端部との間に約1mmのスペースを残しさらさ頭蓋骨上にカスタムメイドの金属板を配置します。直径0.7mmのドリルで慎重に頭頂骨に穴を開けます。 </li><li>静かに0.85ミリメートルの直径のネジでネジ - 下丘（IC）から記録された電位の基準となるために - などの長いネジがしっかり固定されていないようにピンセットでネジを保持している。脳を貫通することなくネジと硬膜との間の良好な接触を確認してください。シアノアクリレート接着剤で頭蓋骨にネジと金属板を接着。 </li><li> n個をゆるめ静かに頭蓋骨からECKの筋肉。 1-2年頃mmのための尾側に首の筋肉を引き出します。上矢状静脈洞（SSS）および横洞（TS）との交点を特定します。必要であれば、生理的NaCl溶液で骨を加湿することによって頭蓋骨の透明性を高める。 <ol><li> SSSとTS交差点に直接尾にあるとマウスでは、ICを特定します。 ICの位置を同定した後、ゆっくりと慎重にCAを拡張する穿孔を行う吻方TSと横方向に約3 mmまで尾側1.5ミリメートルに0.5ミリメートル。 </li><li>これらが成功した実験を妨げるとして、SSSおよびTSへの傷害を避ける。ここでは、トレパネーション骨が柔らかく、それを押すことで緩んなってきたかどうかをテストします。鉗子を使用すると、ゆっくりと骨から持ち上げます。 </li></ol></li><li>適切なアダプタでマイクロマニピュレータ上に多チャンネルアレイとヘッドステージを添付してください。 ICへの挿入時にマルチチャンネル記録配列を破壊しないようにするには、慎重に硬膜を削除小さな皮下注射針の屈曲先端が骨の端の近くに開始した。 <ol><li>定位フレームから動物を削除します。定位固定のままにバーの上に金属板を固定します。 ICの上に記録プローブを置き、一番上のチャンネルが表面でちょうど見えるように微細な制御下に挿入します。 </li></ol></li><li>オフライン分析のためにコンピュータ上で32kHzのローパスフィルタ（300 Hz）の店舗の速度で記録·アレイと頭頂骨における基準スクリュー、サンプルの各チャンネル間の差電位を増幅する。 </li><li>全ての動物は人道的に先立って、関連する安楽死ガイドラインに従い、麻酔回復手順の最後に安楽死させなければならない。安楽死の適切な方法は頸椎脱臼またはCO 2吸入を含むことができる。 </li></ol>

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J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+neural+systems.">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li><li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway.">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

記載された実験は、SGNSの光遺伝学的刺激を実証し、そして、原則的に、また内側及び/又は外側有毛細胞を刺激するために使用することができ、オプシンの発現を提供した。これらの実験は、多くの忍耐と注意が必要です。前述のように、最も重要なステップは、光源の良好な蝸牛/正円窓挿入ならびに適切な位置および向きである。 ChR2をを使用して、光遺伝学的刺激に...

世界保健機関（WHO）によると360万人が世界中で難聴に悩まされている。聴覚障害の被験者では、CIのよるSGNSの直接電気刺激はそれら1,2,4,5の大部分においてオープンスピーチ理解を可能にする。 CIは、したがって最も成功しneuroprosthesisいる、20万人以上の人に移植されているにもかかわらず、現在の蝸牛インプラントによって駆動音エンコードが限られている。 CIは、各1は、このように蝸牛内コルチ機能不全感覚器官を迂回する聴覚神経のtonotopic地域を活性化し、電極の特定の数によって電気刺激に基づいています。通常の聴力リスナーが2,000以上の周波数を識別することができる、しかし、今日のCIのは、12〜22の周波数チャネル4まで使用しています。これは8,15、多くの異なるサウンド周波数を表すSGNSの多数を作動させる、各刺激電極7,9から広まっ電流の流れに起因している。この制限は、多極刺激を使用して、より高い電力消費16,17を犠牲にして改善することができる。音の強さのための彼らの出力ダイナミック·レンジは、通常、dBで4,18 6-20の下にも制限されています。これらの理由から、頻度および強度の解像度を向上させることは、ノイズの多い環境、韻律理解や音楽の知覚に音声認識を改善するためにCI性能を高めるための重要な目的である。 聴覚神経を刺激する別のオプションは、光刺激である。光は、好都合には、良好な空間閉じ込め有望な周波数分解能を増加させ、より良い強度分解能で、その結果、ダイナミックレンジを広げる、SGN小集団を標的とするように集束させることができる。実際には、赤外光による蝸牛刺激は、動物モデル10,11,19に優れた周波数分解能を示している。刺激のこの種の1つの欠点は、電気刺激よりも高いエネルギーを必要とすることで<suP&gt; 10,11。また、直接聴覚神経細胞を刺激する方法の能力についての懸念が12,20が提起されている。 赤外線刺激の代わりに、私たちはSGNS光感受性レンダリングするoptogeneticsを採用している。 Optogeneticsは、非侵襲的に遺伝的および光学技術を組み合わせて、具体的には、高い時間精度（レビュー21〜23）で細胞を制御する新規のアプローチである。現在最も頻繁に使用される様式は、 クラミドモナスの微生物チャネルロドプシン-2（ChR2を）遺伝子の発現を採用し、光依存性カチオンチャネル24をコードするその変異体である。 ChR2を、ニューロンに形質導入し、青色光によって活性化されると、このように細胞の24 27を脱分極、非選択的陽イオンチャネルとして機能し、7回膜貫通ヘリックスタンパク質である。 ChR2を、よく特徴付けられている24,28- 31と多くの変異体は、アクティオを変更するために開発されているn個のスペクトル、ゲーティングと透磁率の特性32,33。私たちの仕事の目的は、聴覚経路の活性化のための蝸牛optogeneticsを確立することである。私たちは、聴覚神経を刺激する光遺伝学的アプローチは、チャネルロドプシンを発現させるためのスパイラル神経節の遺伝子操作を必要とすることに注意してください。マウスおよびラットの操作tonotopic軸に沿っや動物36のところが少し変動してチャネルロドプシンの発現を提供利用可能なトランスジェニック動物13,34,35、の使用を可能にする。適切なのCre-ラインとの条件付き対立遺伝子37を組み合わせることにより、細胞特異的発現を提供する。他の動物の螺旋神経節への遺伝子導入は、そのようなoptogenetics 38に標準的なアプローチであると私たちはマウス36でうまく動作することを示したアデノ随伴ウイルスなどのウイルスを使用する必要があります。外国人のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子操作および発現は、IMMUなどの副作用のリスクを負担するNE応答および/または増殖、妥協の条件または遺伝的に操作された細胞の死。このデモの目的のために、私たちは、光学的、聴覚経路を刺激するのThy-1プロモーター13歳未満のらせん神経節ニューロンにおいてChR2を発現するトランスジェニックマウスを使用しています。私たちは、SGNS 39に変異体キャッチ14のウイルス媒介転移を用いて実証されるように、他のチャネルロドプシン変異体は、同じ目的に使用することができることに留意されたい。 蝸牛optogeneticsは、遺伝子操作を必要とするが、それは最適化されたSGN刺激と電気刺激と比較すると、周波数や強度分解能を向上させ、約束のための分子チューニングを提供しています。聴覚路の光遺伝学的刺激が研究を聞くために非常に関連しています。たとえば、音のスペクトルの統合のための要件の分析に、開発中のtonotopyの活性依存洗練の研究の進歩を約束localizatイオンおよび中枢聴覚システムにおける周波数固有の求心性突起間の相互作用の程度。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="769">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Urethane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U2500-100G</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine HCl</td>
			<td>RXV</td>
			<td></td>
			<td>Sedative and analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td></td>
			<td>Analgesic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>It is used to hold hard tissue, e.g. bone or materials. Never use them to hold soft delicated tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Only to be used to hold soft tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td>To open the skin and help with the muscle dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lempert Rongeurs&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16004-16</td>
			<td>They are very useful to easily remove the bone from the bulla</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>473-nm laser&#160;</td>
			<td>Changchun New Industries</td>
			<td>MLL-III473</td>
			<td>100 mW solid state 473 nm laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser driver&#160;</td>
			<td>Changchun New Industries</td>
			<td>DPSSL MLL 100 mW</td>
			<td>TTL operated laser driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#181;m optical fiber</td>
			<td>Any comercial ; e.g. Thorlabs</td>
			<td>M42L05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-optical modulator</td>
			<td>Crystal Technology, Inc.</td>
			<td>PCAOM VIS</td>
			<td>Control the amount of light coupled into the fiber from the laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller for Acousto-optical modulator</td>
			<td>Crystal Technology, Inc.</td>
			<td>160T1-8SAR-24-0.8</td>
			<td>Control the acousto-optic modulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solo2 laser power &#38; energy meter</td>
			<td>Gentec-EO</td>
			<td></td>
			<td>Used to measure light intensity of the LED and the fiber coupled laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue &#181;LED</td>
			<td>Cree</td>
			<td>C470UT200</td>
			<td>It is necessary to build several &#956;LED devices because easily get damaged or the isolation is not good enough</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TDT System&#160;</td>
			<td>Tucker-Davis Technologies</td>
			<td>RZ6-A-P1</td>
			<td>It can be used any system for stimulus generation&#160; presentation and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-shank, 16-channel silicon probe</td>
			<td>Neuronexus</td>
			<td>a1x16-5mm-100-177-CM16LP&#160;</td>
			<td>These are fragile devises, must be handled carefully and cleaned after use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnidrill</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>503598</td>
			<td>Perform craniotomy for IC recordings and reference screw implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill Steel Burrs</td>
			<td>any commercial; e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>19007-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Self tapping bone screw</td>
			<td>any commercial; e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>19010-10</td>
			<td>Reference screw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>any commercial; e.g. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 axis</td>
			<td></td>
			<td>Positioning of recording probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic stimulation of the auditory nerve

人工内耳によるらせん神経節ニューロン（SGNS）の直接電気刺激（CIS）は、移植された聴覚障害の被験者1〜6の大部分においてオープンスピーチ理解を可能にします。それにもかかわらず、現在のCIとの健全なコーディングが原因蝸牛7 9のtonotopic軸に沿ってSGNSの多数を作動させる各電極接点から幅広い現在の普及に貧しい頻度と強度分解能を有する。光刺激は、したがってSGNSと、空間的により閉じ込められた活性化、符号化のより高い周波数分解能を約束する電気刺激の代替として提案されている。近年では、蝸牛の直接の赤外線照明は聴神経10における応答を誘発するために用いられてきた。それにもかかわらず、電気刺激10,11と不確実性は、基礎となる機構12のように残っているよりも高いエネルギーを必要とします。ここでは、SGNSを刺激するためにoptogeneticsに基づく方法を記載している低強度の青色光と、ChR2を変キャッチ14のチャネルロドプシン2（ChR2を）13またはウイルス媒介発現が神経細胞の発現とトランスジェニックマウスを用いて。私たちは、小さな人工開口部（蝸牛）または丸い窓からChR2を発現SGNSを刺激するために、マイクロ発光ダイオード（μLEDs）とファイバ結合レーザを使用。聴覚路または微小電極記録によって音響および電気刺激と比較した：私たちは、光誘発電位（oABR光遺伝学的聴性脳幹反応）の頭皮記録によって反応を分析した。

<html>最適蝸牛は重要であり、成功した実験の可能性が高くなります。これはウィンドウは、定期的に小さく、内部蝸牛構造の全く怪我がないことを意味します。例えば、出血は血管条の破損を示している。良い例は、 図1Bに示されている。 ChR2をトランスジェニックマウスを用いて、ChR2を蝸牛（ 図1C）内のSGNSで発現される。青色光?...

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Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

人工内耳（CIの）聴神経を直接電気刺激によって聴力ができます。しかし、貧しい頻度と強度分解能はCIので聴力の質を制限します。ここでは、聴覚の研究と今後のCIを開発するための代替戦略として、マウスにおいて聴覚神経の光遺伝学的刺激を説明します。

聴覚神経の光遺伝学的刺激

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

optogenetic-stimulation-of-the-auditory-nerve

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.5K ビュー.  University Medical Center Goettingen. 人工内耳（CIの）聴神経を直接電気刺激によって聴力ができます。しかし、貧しい頻度と強度分解能はCIので聴力の質を制限します。ここでは、聴覚の研究と今後のCIを開発するための代替戦略として、マウスにおいて聴覚神経の光遺伝学的刺激を説明します。 

ビデオ: Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS：脆弱X症候群と自閉症の可塑性のMechasnismを探検するシータバーストプロトコルを使用する

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

神経科学

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

NeuroStar TMSデバイス：うつ病の治療薬としてFDA承認されたプロトコルを実施

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

慢性のためのアダルト生まれの嗅覚ニューロンの選択的なウイルス形質導入 in vivoで Optogenetic刺激

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

脳組織の慢性Optogenetic刺激のための光ファイバ注入

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

で逃避行動のOptogenetic刺激<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling of auditory axons within the VIIIth cranial nerve would enhance the study of central auditory circuit development. This approach is challenging because multiple sensory organs of the inner ear contribute to the VIIIth nerve 1. Moreover, markers that reliably distinguish auditory versus vestibular groups of axons within the avian VIIIth nerve have yet to be identified. Auditory and vestibular pathways cannot be distinguished functionally in early embryos, as sensory-evoked responses are not present before the circuits are formed. Centrally projecting VIIIth nerve axons have been traced in some studies, but auditory axon labeling was accompanied by labeling from other VIIIth nerve components 2,3. Here, we describe a method for anterograde tracing from the acoustic ganglion to selectively label auditory axons within the developing VIIIth nerve. First, after partial dissection of the anterior cephalic region of an 8-day chick embryo immersed in oxygenated artificial cerebrospinal fluid, the cochlear duct is identified by anatomical landmarks. Next, a fine pulled glass micropipette is positioned to inject a small amount of rhodamine dextran amine into the duct and adjacent deep region where the acoustic ganglion cells are located. Within thirty minutes following the injection, auditory axons are traced centrally into the hindbrain and can later be visualized following histologic preparation. This method provides a useful tool for developmental studies of peripheral to central auditory circuit formation.

Here we describe a microdissection technique followed by fluorescent dye injection into the acoustic ganglion of early chick embryos for selective tracing of auditory axon fibers in the nerve and hindbrain.

鳥類胚性内耳神経における聴覚繊維の選択的なトレース

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

聴覚路の光遺伝学的刺激のためのマウス背側蝸牛神経核の直接可視化

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Assessment of Neuromuscular Function Using Percutaneous Electrical Nerve Stimulation

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels). The present protocol describes how this method can be used to stimulate the posterior tibial nerve that activates plantar flexor muscles. Percutaneous electrical nerve stimulation consists of inducing an electrical stimulus to a motor nerve to evoke a muscular response. Direct (M-wave) and/or indirect (H-reflex) electrophysiological responses can be recorded at rest using surface electromyography. Mechanical (twitch torque) responses can be quantified with a force/torque ergometer. M-wave and twitch torque reflect neuromuscular transmission and excitation-contraction coupling, whereas H-reflex provides an index of spinal excitability. EMG activity and mechanical (superimposed twitch) responses can also be recorded during maximal voluntary contractions to evaluate voluntary activation level. Percutaneous nerve stimulation provides an assessment of neuromuscular function in humans, and is highly beneficial especially for studies evaluating neuromuscular plasticity following acute (fatigue) or chronic (training/detraining) exercise.

We present a protocol to assess changes in neuromuscular function. Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method that evokes muscular responses. Electrophysiological and mechanical properties of these responses permit the evaluation of neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, spinal and peripheral levels).

経皮的電気神経刺激を使用した神経筋機能の評価

Percutaneous electrical nerve stimulation is a non-invasive method commonly used to evaluate neuromuscular function from brain to muscle (supra-spinal, ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.