この作品は、スタンフォード·ディーンのフェローシップ（SEJdV）、健康ディレクターズパイオニア賞（TRC DP0035350）、マクナイト財団奨学生賞（TRC）とR01 EY022638（TRC）の国立研究所によって資金を供給された。

1。 Channelrhodopsinハエを生成<ol><li>あなたが選んだのGal4ドライバーとクロスUAS-ChR2ハエは、我々は視葉では、FOMA-1ニューロンに発現しているG105-GAL4を使用しています。 </li><li>青色光刺激に対する視覚反応の可能性を排除するには、両方のフライラインはAW + norpA背景にあります。 </li><li>最終結果：W + norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 + </li><li>大人が孵化するの便を運行する航空会社の後、行動分析を実行する前に、3日間、10μM全トランスレチナール（ChR2ために必要な補因子）と光から保護を補った生鮮食品、上で選択しメスを入れた。 </li></ol> 2。 10μMのオールトランスレチナール強化食品を作る<ol><li> 20mMのは網膜なるように95％エタノール17.6ミリリットルの全トランスレチナール100mgを溶解します。全トランスレチナールは、すべての回で光から保護しておく。 </li><li>電子レンジで標準のコーンミールフライ食品を溶かし、触ると暖かくなるまで冷ます。 </li><li> 20mMの50μlを混ぜるフライ食品10mlのバイアルに全トランスレチナール。 </li><li>バイアルが冷却し、光から保護しておくましょう。 </li></ol> 3。機器<ol><li>ピペットチップ：標準千μlのピペットチップは〜2.25ミリメートルの細孔径を作成し、先端付近にカットされています。 </li><li>プラットフォーム（ 図1を参照）。 <ol><li>デルリンベース、17センチ×25センチメートルは、¼ &quot;NPTクーラントホースコネクタに合わせて、各角にネジ穴を使用して構築されました。 </li><li>デルリンから作られた縦型ホルダは、ベースの中央に取り付けられています。全体の寸法は、X 40ミリメートルX 65ミリメートル（幅×奥行き×高さ）25 mmである。 10mm幅の溝は下部のつまみねじで、ホルダーの長さを実行します。プラットフォームは、ホルダの上部に取り付けられたホルダの溝に整列さ3.5ミリメートル径の穴と25ミリメートル×40ミリメートル×10ミリメートル、されています。 </li></ol></li><li> LEDアレイ（ 図1を参照）。 <ol><li>クーラントホースの4つのアームは、約18センチ、プラットフォームBASに貼付されているクーラントホースコネクタを使用して、e。クーラントホースは、構造的なサポートとしてのみ使用され、冷却目的のために使用されていません。 </li><li>適切に等間隔溝は各アームの先端に固定するために、各アームのヒートシンクをつけ込まれることクーラントの最後のピースにカットされています。 </li><li>青色LED反乱トライスターはプレカット熱接着テープを使用して、それぞれのヒートシンクに取り付けられている。 Carclo 18°トライレンズがそれぞれトライスターに貼付されています。 </li><li> LEDのトライスターがBuckPuck DCのドライバと指定どおりに電源に配線されています。我々は、各BuckPuck直列に2トライスターに電力を供給するとのセットアップを配置している。 </li><li>すべての4つのLEDがトライスターの照明は700 mAでは、我々のプラットフォームで713 W / m 2の照度が得られた。 </li></ol></li><li>カメラ：カメラは、小型三脚に取り付けられ、プラットフォームの上に置いています。 </li></ol> 4。行動アッセイ<ol><li>簡単に言えば氷の上のハエをanaesthetize。 </li><li>閉じるには、テープを使用して、ピペットチップ内の個々のハエを配置双方は、先端の終了。 </li><li>ハエが起こされており、積極的にピペットチップを模索していた後、テープを取り出して、垂直ホルダーの溝にピペットを置く。つまみは、所定の位置にピペットチップを保護するために、チップの底を閉じるために使用されます。 </li><li>ハエがピペットチップ（一般に30から60秒）を探るように、ハエがプラットフォームに先端から出てくる直前にカメラの記録を開始します。 </li><li>ハエがプラットフォーム上に浮上した後、1から2セコ待ってから、青色LEDの電源をオンにします。ハエが飛行を開始するまで手動で時刻を測定するためにタイマーを使用します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+manipulations+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly.">Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72, 202-230 (2011).</li><li>Gordon, M., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Suh, G. S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+an+innate+olfactory+avoidance+response+in+Drosophila.">Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila.</a> Current Biology. 17, 905-908 (2007).</li><li>Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+for+light+control+of+Drosophila+behaviors+through+Channelrhodopsin+2-mediated+photoactivation+of+targeted+neurons.">A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons.</a> European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).</li><li>de Vries, S., Clandinin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loom-sensitive+neurons+link+computation+to+action+in+the+Drosophila+visual+system.">Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system.</a> Current Biology. 22, 353-362 (2012).</li><li>Card, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+behaviors+in+insects.">Escape behaviors in insects.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).</li><li>Card, G., Dickinson, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+trade-offs+in+the+flight+initiation+of+Drosophila+melanogaster.">Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster.</a> The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).</li><li>Hammond, S., O'Shea, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+flight+initiation+in+the+fly.">Escape flight initiation in the fly.</a> Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).</li><li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+mutants+of+Drosophila+isolated+by+countercurrent+distribution.">Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution.</a> PNAS. 58, 1112-1119 (1967).</li><li>Bloomquist, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+putative+phospholipase+C+gene+of+Drosophila,+norpA,+and+its+role+in+phototransduction.">Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction.</a> Cell. 54, 723-733 (1988).</li><li>Gohl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+in+vivo+system+for+directed+dissection+of+gene+expression+patterns.">A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns.</a> Nature Methods. 8, 231-237 (2011).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red-shifted+optogenetic+excitation:+a+tool+for+fast+neural+control+derived+from+Volvox+cateri.">Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri.</a> Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

<html>私達は明るい青い光でハエを歩いて自由に入浴することによってエスケープ行動のoptogenetic刺激を実証している。このアプローチは、簡単に自由に歩くハエに他の行動を調べるために適合させることができ、単純に我々はより大きな面積で使用されるLEDアレイをタイリングすることにより、より広いプラットフォームにスケーリングすることができます。私たちが説明する安価なカメラ?...

遺伝的にコードされたツールの成長武器は、 キイロショウジョウバエの 1で、特定の細胞の神経活動を操作するために開発されてきた。これらのツールは、無傷で自由に移動する動物の特定の神経細胞の非侵襲的な活性化またはサイレンシングを有効にしてください。それは時間的に制御し、迅速に誘導することができるので、これらのうち、Channelrhodopsin2（ChR2）、光活性化陽イオンチャネルは、重要な利点を提供しています。時急行ChR2それらが急速に脱分極および3-5高架発射速度を示す明るい青色（470 nm）の光にさらされていることをニューロン。自由に移動する動物における特定のニューロンのような標的と活性化は、CO 2の回避3、口吻伸展2,4、および巨大な繊維媒介驚愕応答4などの行動のための特定のニューロンの十分性を明らかにした。しかし、ChR2を刺激するために必要な強烈な光源としてもオペアンプを適用し、光受容体を刺激する視覚系にtogenetic技術が限られていました。光情報伝達を阻害する変異を有するoptogeneticアプローチを組み合わせることで、我々はハエの視葉のニューロンの特定のクラスターの活性化が衝突6を避けるために使用されるエスケープ動作を駆動することができることを実証した。 ほとんどが、すべてではありませんが、視覚的な動物が近づいてくるオブジェクトとの衝突を避けるために逃避行動を示す。迫り来る衝突が表示されたときに、ハエを歩いたり、静止した、離れて対向衝突7月9日から、飛行中に離陸。これらの離陸は離陸と不安定な飛行軌道10,11の前に隆起した翼によって特徴付けられる。この応答は、巨大な繊維媒介驚愕反応、隆起した翼が付いていませんジャンプとは区別され、通常は自由落下転倒4,9になる。 uniquアール視葉、FOMA-1ニューロンで織機感受性ニューロンの特定のクラスタを特定したエリーが近づいてオブジェクトをエンコードするように調整され、我々はハエの織機の逃避行動への関与を調べるためにしようとした。ここでは、選択的に、これらのニューロンを活性化し、ハエの逃避行動を誘発するoptogeneticsの使用例を示します。 我々は、FOMA-1ニューロンでChR2の発現を駆動するためにGAL4-UASの転写活性化システムを使用しています。 ChR2は補因子は全トランスレチナールが必要であり、これはショウジョウバエ中枢神経系における低レベルで検出されたとしてそれはハエの食事で補わなければなりません。明るい光がChR2を活性化するために使用し、ハエが強い走光の挙動を示すされている3,4のように12、我々は、刺激に対する視覚反応の可能性を排除するように努めた。これを行うには、我々は、光情報伝達カスケードの重要なコンポーネントで、ホスホリパーゼC-βをコードしてnorpA遺伝子のヌル対立遺伝子のホモ接合体変異た動物を使用していました。このような変異ハエにおける光受容体は責任することができませんdは13を点灯させる。エスケープ応答のoptogenetic刺激をテストするために、我々は1つのフライを隔離し、明るい青い光でそれを入浴する必要があります。これを行うには、我々は、ピペットチップ内の個々のハエを配置します。一つのピペットチップは、フライがgeotactically長方形のプラットフォーム上にチップと外を歩いていくようなカスタムホルダーに置かれます。ハエが自由にこのプラットフォームの上に歩くことができる。プラットフォームは、そのプラットフォームの上に焦点を当てた4つの青いLEDアレイ、それぞれ含む3つのLEDに囲まれています。ハエがプラットフォーム上に準備したら、LEDが点灯していると、フライの応答は、高速度カメラ6を使用して記録されます。

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td>網膜全トランス</td><td>アドバンス科学＆ケミカル株式会社</td><td> R3041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>熱は9.2℃/ Wのシンク</td><td> Luxeonstar </td><td> LPD30-30B </td><td>高30mm角X 30ミリメートル</td></tr><tr><td> Carclo 18°トライレンズ</td><td> Luxeonstar </td><td> 10507 </td><td></td></tr><tr><td>ブルーRebelはトライスターベースのLED </td><td> Luxeonstar </td><td> MR-B0030-20T </td><td> 470nmと、174 LM @ 700ミリアンペア。 </td></tr><tr><td> 700ミリアンペアBuckPuck dcドライバ</td><td> Luxeonstar </td><td> 3021-DE-700 </td><td></td></tr><tr><td> BuckPuckドライバ用ワイヤーハーネス</td><td> Luxeonstar </td><td> 3021-HE </td><td></td></tr><tr><td>プレカット熱接着テープ</td><td> Luxeonstar </td><td> LXT-S-12 </td><td> 20ミリメートル六角ベース</td></tr><tr><td>スナップ-Locのクーラントホース、¼ &quot;のID </td><td>マクマスター - カー</td><td> 5307K49 </td><td></td></tr><tr><td>スナップ-Locのクーラントホースコネクタ</td><td>マクマスター - カー</td><td> 5307K39 </td><td> ¼ &quot;NPTおねじ</td></tr><tr><td>実験室グレードスイッチングモードプログラマブルDC電源</td><td> BKプレシジョン</td><td> 1698 </td><td></td></tr><tr><td> EXILIMカメラ</td><td>カシオ</td><td> EX-FH20 </td><td></td></tr></tbody></table>

optogenetic stimulation of escape behavior in drosophila melanogaster

遺伝的にコードされたツールの数が増えてキイロショウジョウバエ 1における特定のニューロンの神経活動の非侵襲的な操作を可能にすることを利用可能になっています。これらの中で最も重要なのはそのままで特定のニューロンの活性化またはサイレンシングを有効にして、自由に明るい光を用いて動物を移動optogeneticツールです。 Channelrhodopsin（ChR2）は青色光によって活性化されると、それを表現するニューロンの脱分極を引き起こし、光活性化陽イオンチャネルである。 ChR2は、CO 2の回避、口先拡張と巨大な繊維媒介驚愕反応2月4日などの特定の行動のための重要な神経細胞を同定するために有効であった。しかしながら、また、ChR2を刺激する光受容体を刺激するために使用される強烈な光源として、これらoptogenetic技術は以前に視覚システムで使用されていない。ここで、我々はデモに光情報伝達を阻害する変異を有するoptogeneticアプローチを組み合わせるハエの視葉は、FOMA-1ニューロンにおける織機敏感なニューロンのクラスターの活性化をnstrate、衝突を回避するために使用されるエスケープ動作を駆動することができます。我々は盲目の飛んでもフォマ-1にChR2の発現を駆動するためにGAL4-UASは転写活性化システムを使用してレンダリングするnorpA遺伝子によってコードされたホスホリパーゼC-β、、、光情報伝達カスケードの重要なコンポーネントのヌル対立遺伝子を用いニューロン。個々のハエは、青色LEDに囲まれた小さなプラットフォーム上に配置されています。 LEDが点灯しているときに、視覚的に駆動織機逃避行動と同様に、飛行中に素早く離陸飛ぶ。我々は、この技術が簡単に自由に飛んで移動中に他の行動を調べるように適合させることができると信じています。

ブラインドはどちらChR2または単独G105ドライバ明るい青色光と、その照明に続いて離陸率の低さを示してを表現飛ぶ。ブラインドは、これらのテイクオフは青色光ではなく、自発的な照明によるものであったことを示唆しているにかかわらず、照明（ 図2）の離陸の同じ割合を示し飛ぶ。 ChR2がFoma1ニューロンに発現しているときは、しかし、青色光による照明は、エスケープ応答...

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Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

遺伝的にコードされoptogeneticツール内の特定の神経細胞の非侵襲的な操作を可能に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;脳。このようなツールは、そのアクティベーション、特定の行動を誘発または抑制するのに十分である神経細胞を識別することができます。ここでは、自由に歩いてハエの標的ニューロンに発現しているChannelrhodopsin2を活性化するための方法を提案する。

で逃避行動のOptogenetic刺激<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

optogenetic-stimulation-of-escape-behavior-in-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

17.3K ビュー.  Stanford University. 遺伝的にコードされoptogeneticツール内の特定の神経細胞の非侵襲的な操作を可能にショウジョウバエ脳。このようなツールは、そのアクティベーション、特定の行動を誘発または抑制するのに十分である神経細胞を識別することができます。ここでは、自由に歩いてハエの標的ニューロンに発現しているChannelrhodopsin2を活性化するための方法を?...

ビデオ: Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

神経科学

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

における自発運動量の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

齧歯類の中枢神経系の生体光遺伝学的刺激

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

聴覚神経の光遺伝学的刺激

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

で社会空間に影響を与える条件<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

臭気誘導挙動の高分解能定量<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;使用<em&gt; Flywalk</em&gt;パラダイム

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

使用して報酬を求める行動の変化を測定するための簡単な方法<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Quantification of Drosophila Grooming Behavior

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a grooming assay protocol and novel chamber design that is cost-efficient and scalable for either small or large-scale studies of Drosophila grooming. Flies are dusted all over their body with Brilliant Yellow dye and given time to remove the dye from their bodies within the chamber. Flies are then deposited in a set volume of ethanol to solubilize the dye. The relative spectral absorbance of dye-ethanol samples for groomed versus ungroomed animals are measured and recorded. The protocol yields quantitative data of dye accumulation for individual flies, which can be easily averaged and compared across samples. This allows experimental designs to easily evaluate grooming ability for mutant animal studies or circuit manipulations. This efficient procedure is both versatile and scalable. We show work-flow of the protocol and comparative data between WT animals and mutant animals for the Drosophila type I Dopamine Receptor (DopR).

This protocol describes a scalable individual grooming assay technique in Drosophila that yields robust, quantitative data to measure grooming behavior. The method is based on comparing the difference in dye accumulation on the bodies of un-groomed versus groomed animals over a set period of time.

ショウジョウバエのグルーミング行動の定量

Drosophila grooming behavior is a complex multi-step locomotor program that requires coordinated movement of both forelegs and hindlegs. Here we present a ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

行動するマウスにおける海馬シータ振動の光同調

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...