この作品は、ドイツ学術振興助成 HI-698 / 10-1とRU-1652 / 1-1によってサポートされていました。私たちは、彼らの親切なサポートのための優れた技術支援と会社DYOMICS社、イエナのためのドリーン·メイに感謝。

注：すべての手順は、地域の動物委員会や動物の倫理的な使用に関する国際的なガイドラインに従って承認されている。 材料と楽器の作製<ol><li>自然発生的に形成された小胞分散液の調製（SFV） <ol><li>溶解すると、以下のリン脂質のストック溶液を調製する：214 mg / mlの卵ホスファチジルコリン（EPC）、134 mg / mlのコレステロール、122 mg / mlの1,2- distearoyl- のsn -glycero -3- phosphoethanolamine- N - [メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（アンモニウム塩）（のmPEG 2000 -DSPE）および2mg / mlの1,2- dioleoyl- のsn -glycero -3- phosphoethanolamine- N - （7-ニトロ- 2-1,3-benzoxadiazol-4ガラスバイアル中でクロロホルムストア内イル）（アンモニウム塩）（NBD-DOP​​E）。 </li><li>丸底フラスコ中で約3ミリリットルのクロロホルムを提出し、EPからなるリポソームを調製する丸底フラスコに、リン脂質のストック溶液の適切な容量を転送するC：3：0.5のChol：6.5のモル比でのmPEG 2000 -DSPE。リポソームの二重蛍光標識のために脂質溶液に0.3モル％NBD-DOP​​Eを追加します。 </li><li>ロータリーエバポレーターを用いて55℃で減圧（300ミリバール）下で、有機リン脂質溶液からクロロホルムを蒸発させる。 </li><li>均一なリン脂質膜を形成した後、残留クロロホルム堆積物を除去するために1〜2時間10ミリバールの圧力を低下させる。 </li><li>クロロホルムが蒸発している間、10 mMトリス緩衝液（pH7.4）にDY-676-COOH（6.181μM）を溶解し、液体窒素デュワー瓶を埋める。超音波浴に切り替え、50℃に設定。 </li><li> DY-676-COOH（6.181μM）自然発生的に形成された小胞（SFV）の分散が形成されるまでドライリン脂質フィルム、激しく渦を水和する丸底フラスコに、溶液の適切な容量（0.5〜ml）を転送します。リン脂質の全てが脂質の損失を回避するために、分散していることを確認してください。 </li><li>慎重にTRA液体窒素中SFV分散体を含有する丸底フラスコnsferと3-5分間分散をフリーズ。その後分散を解凍1-2分間激しく分散を渦に50℃の超音波浴に丸底フラスコを置きます。 7凍結融解サイクルの合計を作り、この手順を6回繰り返します。 </li></ol></li><li>均質なリポソーム小胞を形成するためのSFVの押出<ol><li> 1mlシリンジ（注射器-a）の中SFV分散液を移し、シリンジ-bの中にLiposoFastベーシック押出機を用いて100nmのポリカーボネート膜を通して分散液を押し出す。 </li><li>サイクルを10回繰り返した後、バックシリンジ-Aに、注射器-bから分散を押し出す。押し出し、時間との明確な分散物に曇った外観から注射器の変化で溶液に起因する。 10サイクル（20シングル押し出しステップ）した後、デバイスから注射器-Bを削除し、直接、滅菌シリンジ-から最後の時間のための分散を押し出す1.5ミリリットルの反応管。 </li></ol></li><li>リポソームの精製は、無料の色素からDY-676-COOHをカプセル化<ol><li> 10 mMトリス緩衝液pH 7.4（カラム長28センチメートル、直径0.8センチメートル）に浸しG25ビーズを用いたゲルクロマトグラフィーカラムを準備する。 </li><li>ゲル床の上に押し出された小胞体分散液の0.5ミリリットルを転送し、ゲルマトリックス内に試料の消耗をしましょう​​。 </li><li> 10mMトリス緩衝液（pH7.4）（ 図1A）を有するリポソームを溶出し、カラムから完全に遊離色素ドレンまでカラムを洗浄する。必要であれ場合は、収集し、製造業者の説明書に従って脱塩し、脱水によって遊離色素をリサイクルする。 </li><li>超遠心により溶出リポソームを濃縮する（20万×gで、8℃で2時間）、その後、滅菌10mMトリス緩衝液の適切な容積でそれらを分散させる、7.4。 </li></ol></li><li>カプセル化されたDY-676-COOH濃度の定量<ol><li> DY-676-COOH（0、82、124を溶解することにより検量線を作成し、10mMトリス緩衝液、0.1％トリトンX100を含有するpH7.4の247、494、988 nM）を有する。 </li><li>小胞を破壊し、封入された染料を放出するように、1％トリトンX100を含有する100μlのトリス緩衝液中、室温で5分間リポソームを2μl（50ミリモル/ Lのストックの100 nmolの最終脂質）を溶解する。 0.1％の最終のTriton-X100濃度を10mMトリス緩衝液、pH7.4中の試料を希釈（v / v）の全量1mlを作る。重複してすべてのサンプルを準備します。 </li><li>励起λ= 645 nmおよび放出λ= 700 nmで（無料DY-676-COOHおよびTriton-X100は、リポソームを処理したもの）すべてのサンプルの吸収および発光を測定します。確立し、封入された染料の濃度を決定するために、遊離色素の検量線を使用する。 </li></ol></li><li>リポソーム特性評価<ol><li>動的光散乱法によりリポソームのサイズとゼータ電位を決定します。交流の滅菌フィルター（0.2μm）を10 mMトリス緩衝液（pH7.4）とリポソームサンプルを希釈100から300μM（脂質）のoncentration。低容量の使い捨てキュベットに希釈した試料を移し、製造業者の説明書に従って、サンプルを測定する。 </li><li>標準的なプロトコルに従ってリポソーム小胞のサイズ、完全性および均一性を実証するために、電子顕微鏡でリポソームを特徴付ける。 </li></ol></li></ol> 2.蛍光消光の検証と調製されたリポソームの活性化<ol><li>蛍光消光及び活性化の物理化学的分析<ol><li>リップ-Qのための2つの1.5ミリリットルチューブ、無料のDY-676-COOHのための2のチューブを準備します。転送100ナノモルの全脂質対応するチューブに（カプセル化されたDY-676-COOHの138μg/ mlのを含む42ミリモル/ Lリップ-Q原液の2.38μL、）。リップ-Q（使用されるX 2.38μlのリップ-Q 138μgの/ 1,000μLから例の結果0.38μgの）の染料含有量に無料でDY-676-COOH相当を転送します。 1タブをインキュベート4℃での各プローブのeおよび-80℃で一晩（16時間）で第2のチューブを凍結する。 </li><li> 30℃に加熱ブロックを加熱する。砕いた氷で冷却ボックスを充填し、室温に10 mMトリス緩衝液（pH7.4）のアリコートを平衡化。 </li><li> 4℃からプローブを除去し、5分間、30℃で-80℃からプローブ（光から保護するためにアルミホイルで包まれた）、すぐに解凍し、室温で平衡化。 （また、光から保護するためにアルミホイルで包まれた）を室温にそれらを転送する前に1分間氷上で解凍したプローブを冷やす。 </li><li> 100μlの最終容量にプ​​ローブの各々に10mMトリス緩衝液（pH7.4）を加え、室温で10分間、すべてのプローブを平衡化する。 </li><li>ピペット80の低容量のガラスキュベットに各プローブμlの分光計400~900ナノメートルから各プローブの吸収を測定する。それらに対応するチューブにプローブを返します。 </li><li>適切なガラスキュベットに各プローブの80μlのを転送674 nmで励起するプローブによる蛍光光度計での蛍光発光を測定し、694-800ナノメートルの蛍光を測定する。 </li></ol></li><li>細胞取り込みおよび蛍光活性化<ol><li>標準条件（37℃、5％CO 2および95％加湿雰囲気）に応じて、それらの対応する培養培地中で以下の細胞株を取得し、培養する。ここで、U-118MG（必須ビタミンを含有するMEMおよび10％（体積/（ダルベッコ改変イーグル培地、10％（v / v）ウシ胎児血清を補充した）、ヒト膠芽腫細胞株をマウスマクロファージ細胞株J774A.1を使用v）のウシ胎児血清）およびヒト線維肉腫細胞株、HT-1080（5％FCSを含むRPMI）。 </li><li>コー​​トポリ-L-リジンとの8ウェルチャンバースライド（各ウェルに100μlの0.001％ポリ-L-リシンを追加し、10分間37℃でインキュベートする。吸引除去液とチャンバースライドは、少なくとも4用に乾燥させ無菌作業台上で、室温で時間。チャンバースライドをすすぐ3必要とされるまで、200μlのハンクス緩衝食塩水回、その後、4℃でパラフィン及びアルミ箔とストアでそれらを密封する。 </li><li>チャンバースライドが枯渇している間に必要とするまで、4℃でリポソームと染料溶液とストアをフィルター滅菌する。 </li><li> インビボでの NIR蛍光イメージングシステムにおける全身プローブ取り込み分析のために、3つの試験細胞株の各々について5小さな培養フラスコ（合計15フラスコ）を準備する。シード2×10 6 J774A.1、U-118MGおよび（5倍に）のそれぞれの培地を5 mlの培養フラスコ当たりのHT-1080細胞および16-24時間成長する。 、培養フラスコに平行なそれぞれのチャンバースライドの2ウェルに各細胞株（J774A.1およびHT-1080）または20,000細胞（U-118MG）の30,000細胞を播種し、16〜24時間、500μlの培養培地中で増殖。 </li><li>翌日、細胞株につき2フラスコに、チャンバースライド上の各細胞株の1つのウェルにリップ-Qの100ナノモル（最終脂質量）を追加します。直ちに4℃、バックインキュベーターに第二のフラスコに細胞株あたり1フラスコを転送する。 NOTE：チャンバースライド上の濃度作り、プローブの容量がフラスコに添加し、チャンバースライドが同じである10倍高い（5 mlを500μlの培養培地である）。顕微鏡的検出をフラスコからの細胞ペレットを結像さNIR蛍光イメージングシステムよりも感度が低いので、これが必要である。 </li><li>その後直ちに細胞株あたり1フラスコを転送する、細胞株当たり2フラスコ中の細胞へとチャンバースライド上の各細胞株の1つのウェルにリップ-Q染料含有量に相当する濃度でフリーDY-676-COOHを追加4℃（エネルギー枯渇）とバックインキュベーターにチャンバースライドと一緒に他のフラスコに。対応する条件で24時間、すべての細胞をインキュベートする。プローブなしのフラスコ中の細胞を未処理の対照として役立つ。 </li></ol></li><li> NIRFイメージングと半定量分析<ol><li> 24時間のインキュベーション期間の後、ハンクスで細胞を2回洗浄することによってフラスコ中で細胞を採取、その後500μlのチューブ内で遠心分離（200×gで5分間）で、500μlのHBSS、ペレット中の細胞をこすり取る塩溶液（HBSS）をバッファリング。 </li><li>励起（615から665 nm）を放出（&gt; 700 nmのカット）のフィルタを使用して、NIRFイメージャと画像内の細胞ペレット（及びHBSS）でチューブを置きます。 </li><li>自家蛍光を控除し、製造者の指示に従って、自家蛍光対ターゲットの強さを評価する。これは、測定値が互いの間で比較可能となるように、露光時間、カメラゲイン、ビニングおよびビット深度のためのスケーリング後のカウントレベルを表す平均信号として蛍光強度（スケーリングされたカウント/秒）の半定量的レベルを与える。 </li></ol></li><li>共焦点顕微鏡分析<ol><li> 24時間のインキュベーションの後、500μlのHBSSで2回洗浄することにより、チャンバースライド上で細胞を回収。 </li><li> CEを修正RTで30分間、3.7％（v / v）のホルムアルデヒドを含む200μlのHBSSとLLS。 </li><li>固定が起こっている間、DNA染色マウントソリューションで、ヘキスト-33258 1:50に希釈する。 </li><li>固定後、その後HBSSで細胞を2回洗浄したスライドガラスからチャンバーを分離する。チャンバースライドのウェルに対応する各スポット上のDNA染色を含む50μlのマウントソリューションを追加します。ガラスカバースリップで細胞をカバーし、室温で10分間（暗い）用の透明なマニキュアと空気乾燥でエッジをシールする。 </li><li>適切な蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡上で画像セル。核（ヘキスト-33258：励起405nmで、放射420から480 nm）で対応するコンポーネントの可視化のための以下の励起および発光の設定を使用します。 NBD-DOP​​E（リポソーム脂質：励起488nmで、放射530 nm）を。 DY-676-COOH（NIR蛍光色素：励起633から645 nmの、放射650〜700ナノメートル）。 注：いることを確認して蛍光顕微鏡Availableは、より高い630 nmより波長の励起および発光を可能にする適切なフィルターが装備されている。 </li></ol></li></ol> 3.リポソームベースの炎症のin vivo蛍光イメージングで <ol><li>動物や材料の調製<ol><li>食物および水を自由に標準条件下で約36 250gのハウスは、8-12週齢の雄性NMRIマウス。 </li><li>実験の開始前7日間の組織自己蛍光を低減するために、すべてのマウスを低フェオフォルビド食を与える。 </li><li>二十四時間後、各実験の開始前に、所望の領域にマウスを削る（ 例えば、後肢浮腫のイメージングを使用する場合に、裏面全体面積）。 </li><li>動物の重量を測定し、体重kg当たり10マイクロモル（脂質濃度）で（リップ-Qとリップ-DQマウスあたりに噴射されるプローブの量を計算し、無料のDY-676-COOH使用リップ-Qのコンテンツを染色する（等価） 。 </li><li>画像の動物細胞ペレットを使用したのと同じ設定で全身NIR蛍光イメージャ。この測定は、動物の自己蛍光を提供しています。 </li><li> 1mlの等張生理食塩水を10 mgのザイモサンAを溶解し、4℃で一晩保存する。 </li></ol></li><li>炎症のおよびin vivo NIRFイメージングにおける誘導<ol><li>次の解決策を含むマウスあたり3注射器を準備します。 50μlのザイモサン溶液（10mg / ml）と50μlの等張食塩水で第2のシリンジを有する1つのシリンジを充填する。対照動物のためのリップ-Qとリップ-DQ（10マイクロモル/ kgの体重（脂質））（LIP-Qの​​ように濃度）試験動物とフリーDY-676-COOHのために指定されていることにより、プローブを、第3注射器を埋める。プローブは、150μlの最終容量に無菌のHBSSで希釈することを確認してください。 </li><li> （乾燥を避けるため、彼らは深く眠っているまで2％のイソフルランで動物を麻酔し、足に触れたときに反応しないように動物の眼にアイクリームを適用しますこれは）約2分かかります。 </li><li> （まだ麻酔下）暖かいマットの上にマウスを置き、右後肢にザイモサン - 溶液を皮下と左後脚に生理食塩水を注入する。 （tは0時間を=のように）注入/測定の記録時間をすぐに静脈内にプローブを注入して、その後の画像動物。画像キューブなどの結果の画像を保存し、他のすべての動物とそれぞれのプローブのための上記の手順を繰り返します。 </li><li>画像動物測定室の段階（たとえば、下に暖かいマットを置くことによって）、ウォームであることを確認し、10時間後に注入するための2時間、次いで、24時間後の注射、低体温を回避するためである。各測定後、餌と水を自由にケージに動物を配置し、温帯動物チャンバー内にケージを置く。動物はもはや触れなくなるまで反応し、その後、5〜10分間、二酸化炭素で安楽死させる2％イソフルランで麻酔第によって動物を安楽死させる動物が完全に呼吸が停止し、死後硬直が発生していることを確認してください。 </li><li>標準のオンライン評価することが可能なプロトコル（http://www.freebookez.com/mouse-dissection-lab-report/）と画像の臓器に応じてマウスを解剖。 </li><li>最初の自己蛍光のために関心領域を割り当て、その後、動物の全体的な蛍光（非混​​合）を控除することにより、製造業者の指示に従って測定した結果を評価する（生理食塩水後肢左）および炎症領域（ザイモサンAと右後肢）の蛍光を標的とする。 </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

リポソームはまた、蛍光色素のための送達システムとして機能することができるので、それらは、標的疾患の画像化を可能にする。このようなここで使用NIRF染料、DY676-COOHのような蛍光色素、高濃度の封入は、封入された色素の蛍光消光の高いレベルをもたらす。蛍光消光、高濃度で、多くのフルオロフォアで見られる現象は、対象領域の高感度で信頼性の高い検出が要求されるインビボ?...

リポソームは、集中的に調査し、臨床応用1,2に最も生体適合性の生物医学的な薬物送達システムの一つとして機能してきた。これらは、主に天然の細胞膜の一部を模倣する生体適合性化合物であり、その両方が、リン脂質およびコレステロールから構成されている。親水性物質は水性内部内に捕捉することができるが、親油性薬剤は、リポソームのリン脂質二重層3内に組み込むことができる。リポソームの水性内部内の ​​物質のカプセル化は、 インビボでの分解に対する保護を付与し、また、腫瘍細胞を破壊することを目的とし、例えば化学療法のための疾患の治療のために使用される細胞毒性薬剤の毒性作用からホストシステムを防ぐ。ポリエチレングリコール（PEG化）のようなポリマーとリポソーム表面の修飾は、さらにによる立体安定化を、インビボでのリポソームの血液循環時間を延長4。 Moreov小胞体、リポソームは、タンパク質、5,6-、親水性物質7,8および酵素9のようないくつかの物質の高濃度を隔離することができる。したがって、それらは、そのような癌治療のための4ドキソルビシンなどの細胞毒性薬剤の送達のための彼らの承認に値するとして信頼性の高い臨床治療および診断ツールを提供しています。それらの柔軟性のために、リポソームは、診断および画像誘導外科的目的のために蛍光色素をロードすることができる。 蛍光イメージングは、しかしながら、いくつかの基本的な要件を要求するインビボでの診断ツールでコスト効果の高い、非侵襲的に提供する。これは、in vivoイメージングのための最高に合う蛍光色素は、光分散及び散乱ならびに水由来の組織の自己蛍光およびヘモグロビンが低い範囲の特性吸収と発光極大を有することが証明できた。したがって、そのようなプローブは、650と900 nmの10の間に彼らのABS /全角最大を持っている。<html>オプソニン化および急速なクリアランスが大きくインビボ画像11のためのそれらの適用を制限することができ、この他に、in vitroおよびin vivoの両方での蛍光色素の安定性は、重要である。そのような貧しい安定性と低感度やインドシアニングリーン（ICG）12-16で見られるように標的器官に細胞毒性作用などの他の効果は、望ましくないとin vivoイメージングのためのプローブを設計する際に考慮に入れなければならない。これらの観察は、いくつかの前臨床NIR蛍光色素、ナノ粒子、ならびに炎症プロセス、癌のin vivoイメージングのための、画像誘導手術17-20のための新しい技術の開発が活発につながっている。ほとんどの前臨床NIRF（近赤外蛍光）の安定性にもかかわらず、染料インビトロ 、肝臓および腎臓を介してそれらの迅速な灌流およびクリアランス疾患および炎症プロセスのインビボ光学イメージングにおけるそれらの使用を妨げる。 ntentは&quot;&gt;したがって、我々はそのようなよく特徴付け近赤外蛍光色素DY-676-COOH、比較的高濃度のリポソームで21で自己クエンチする傾向のために知られているような蛍光色素のカプセル化のためのプロトコルを提示する。高濃度でH-二量体形成および/または蛍光色素分子間の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に互いのフェルスター半径結果内に位置するフルオロフォア分子間のπスタッキング相互作用、低濃度では、フルオロフォア分子の間隔が増大し、それによって、πスタッキング相互作用を防止しHダイマー形成および高い蛍光発光をもたらす。高および低濃度および添付蛍光消光及び活性化との間のスイッチは、光学イメージング22に利用することができる有望な戦略である。この点で、NIRF染料高濃度のカプセル化DY-676-COOHリポソームの水性内部には多くのFAです遊離色素よりもin vivoイメージングのためのvorable。この方法の課題は、染料を高濃度でカプセル化から生じる利益の検証において、第二に、正しいカプセル内のすべての第ある。遊離色素のそれでクエンチしたリポソームの結像特性を比較し、また、色素の濃度が低い非クエンチリポソーム製剤とすることが不可欠である。私たちは、リポソーム中DY-676-COOHの消光濃度のカプセル化が可能であり、代替凍結融解サイクルと組み合わせるシンプルな、しかし非常に効果的なフィルムの水和と押し出しプロトコルによって示している。そのような逆相蒸発法23と同様にエタノール注入法24としてのリポソームを調製するために使用される他の方法は、多くの親水性物質のための高い封入効率を有するリポソーム製剤を可能にする。しかし、カプセル化される物質の性質は、カプセル化効率に影響を与えることができる。実際には、ここで紹介するフィルムの水和と押し出しプロトコルは、DY-676-COOHのカプセル化のための最高の効率を明らかにした。 DY-676-COOH、数時間以内に、炎症過程の研究を可能にするザイモサン誘導浮腫モデルのリポソームカプセル化の利点を説明するために、使用された。ここでは、カプセル化されたDY-676-COOHの高濃度を有するリポソームが遊離色素または低染料濃度を有する非クエンチリポソーム製剤よりも炎症過程のインビボ光学イメージングに全身に適していることが実証される。したがって、基本的なプロトコルは、 インビトロおよびインビボの両方でクエンチし、蛍光リポソームおよびそれらの活性化およびイメージング可能性の検証を生成するための簡単かつ迅速な方法を提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="872">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:179px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:267px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Materials and equipments for preparation of liposomes</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">egg phospahtidylcholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840051P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (214 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8667</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (134 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>880120P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (122 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:309px;">1,2-dioleoyl-snglycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810145P</td>
			<td>Dissolve in Chloroform and store in glass vials (2mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Sartorius MC1 (d = 0.01 mg)</td>
			<td>Sartorius AG</td>
			<td>Research RC 210 P</td>
			<td>used for weighing the phospholipids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Rotavapor</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>R-114</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Waterbath</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>R-481</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Vacuum Controller</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>B-720</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:309px;">Vacobox</td>
			<td>B&#252;chi Labortechnik AG</td>
			<td>B-177</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:309px;">Circulation Chiller</td>
			<td style="width:179px;">LAUDA DR. R. WOBSER 
			GMBH &#38; CO. KG</td>
			<td>WKL 230</td>
			<td>used for hydration of phospholipid film</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DY-676-COOH</td>
			<td>Dyomics GmbH</td>
			<td>676-00</td>
			<td>Dissolve in 10 mM Tris and store stock at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1086</td>
			<td>buffer 10 mM, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trichlormethan</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>Y015.2</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sonicator</td>
			<td>Merck Eurolab GmbH</td>
			<td>USR 170 H</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex Genie 2 (Pop-off Cup, No. 146-3011-00)</td>
			<td>Scientific Industries Inc.</td>
			<td>SI-0256</td>
			<td>used for liposome preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sephadex G25 medium&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Europe GmbH</td>
			<td>17-0033-01</td>
			<td>used for liposome purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X100</td>
			<td>Ferak Berlin GmbH</td>
			<td>505002</td>
			<td>used to destruct liposomes&#160; for dye quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LiposoFast-Basic</td>
			<td>Avestin Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the extrusion of liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polycarbonate filter membrane, 100 nm (Whatman Nucleopore Trans Etch Membrane, NUCLEPR PC 19 MM, 0.1 U)</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the extrusion of liposomes via LiposoFast-Basic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluostar Optima</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for dye quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zetasizer Nano ZS</td>
			<td>Malvern</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for the determination of liposome size and zetapotential</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Beckmann Coulter GmbH</td>
			<td style="width:119px;">XL 80</td>
			<td>used for concentration of the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Rotor</td>
			<td style="width:179px;">Beckmann Coulter GmbH</td>
			<td style="width:119px;">SW 55 TI</td>
			<td>used for concentration of the samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:309px;">Materials and equipments for the evaluation of liposome and optical imaging&#160;</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Zymosan-A from Saccharomyces cereviciae</td>
			<td style="width:179px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z4250-250MG</td>
			<td>used for induction of inflammation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isotonic Saline (0.9)</td>
			<td style="width:179px;">Fresenius GmbH</td>
			<td style="width:119px;">PZN-2159621</td>
			<td>used for the dilution of Zymosan-A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isoflurane vaporizer</td>
			<td>Ohmeda Isotec 4</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for anesthesizing animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Isoflurane</td>
			<td>Actavis GmbH&#160;</td>
			<td style="width:119px;">PZN-7253744</td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Mat Pro 20 W</td>
			<td style="width:179px;">Lucky Reptile</td>
			<td style="width:119px;">61202-HTP-20</td>
			<td>used to keep animals warm during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Omnican-F (1 ml injection)&#160;</td>
			<td style="width:179px;">Braun</td>
			<td style="width:119px;">PZN-3115465</td>
			<td>used for subcutaneous and intravenous application of probes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Panthenol eye cream</td>
			<td style="width:179px;">Jenapharm</td>
			<td style="width:119px;">PZN-3524531</td>
			<td>used to prevent dryness of the eyes of animals during anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Hanks buffered saline solution</td>
			<td style="width:179px;">PAA Laboratories /Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">L2045</td>
			<td>w/o Mg2+, Ca2+ and phenol red. For dilution of probes and for washing of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">8-Well chamber slides</td>
			<td style="width:179px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">354108</td>
			<td>used for cell culture followed by microscopy&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Cell culture flasks</td>
			<td style="width:179px;">Greiner BioOne</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture media</td>
			<td colspan="2">Gibco (life technologies GmbH)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal calf serum&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-L-Lysine solution (0,01% - 50&#160;ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4832</td>
			<td>used to coat cell culture chamber slides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mountant Permafluor</td>
			<td>ThermoScientific&#160;</td>
			<td>S21022-3</td>
			<td>Mounting solution for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hoechst-33258</td>
			<td style="width:179px;">AppliChem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>DNA stain for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Hera-Safe</td>
			<td>Heraeus Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile work bench used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HERA cell</td>
			<td>Heraeus Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Incubator used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">LSM510-Meta</td>
			<td style="width:179px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:309px;">Maestro-TM in vivo fluorescence imaging system</td>
			<td style="width:179px;">CRi, Woburn</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for whole body fluorescence imaging of small animals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Spectrophotometer (Ultrospec 4300 pro UV)</td>
			<td style="width:179px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for measurement of absorption</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Spectrofluorometer (Jasco FP-6200)</td>
			<td style="width:179px;">Jasco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for measurement of fluorescence emission</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:309px;">Animals</td>
			<td style="width:179px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NMRI mice (8-12 weeks old, male)</td>
			<td style="width:179px;">Elevage Janvier, France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for inflammation trials</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence-quenching of a liposomal-encapsulated near-infrared fluorophore as a tool for in vivo optical imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

そのようなNIRF染料DY676-COOHのような蛍光色素、高濃度のカプセル化は、リポソームの水性内部にここで使用される蛍光消光の高いレベルをもたらす。蛍光消光、高濃度で、多くのフルオロフォアで見られる現象は、標的領域の高感度で信頼性の高い検出が要求されるインビボイメージング用途のいくつかで利用することができる。リポソームの使用はまた、in vivoでの適用?...

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Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光<em&gt;インビボ</em&gt;光学イメージング

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

fluorescence-quenching-liposomal-encapsulated-near-infrared

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

16.1K ビュー.  Jena University Hospital. The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity. 

ビデオ: Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

三次元光学分解能光音響顕微鏡

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

生物工学

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

細胞融合の検出のためのCre - LOX Pの組換えのアプローチインビボでの</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

のためのウイルス粒子<emインビボ&gt;</em&gt;腫瘍イメージング

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an integral part of normal tissue renewal, excessive amount of remodeling activity is involved in tumors, arthritis, and many other pathological conditions. During collagen remodeling, the triple helical structure of collagen molecules is disrupted by proteases in the extracellular environment. In addition, collagens present in many histological tissue samples are partially denatured by the fixation and preservation processes. Therefore, these denatured collagen strands can serve as effective targets for biological imaging. We previously developed a caged collagen mimetic peptide (CMP) that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands by forming triple helical structure, which is unique to collagens. The overall goals of this procedure are i)&#160;to image denatured collagen strands resulting from normal remodeling activities in vivo, and ii) to visualize collagens in ex vivo tissue sections using the photo-triggered caged CMPs. To achieve effective hybridization and successful in vivo and ex vivo imaging, fluorescently labeled caged CMPs are either photo-activated immediately before intravenous injection, or are directly activated on tissue sections. Normal skeletal collagen remolding in nude mice and collagens in prefixed mouse cornea tissue sections are imaged in this procedure. The imaging method based on the CMP-collagen hybridization technology presented here could lead to deeper understanding of the tissue remodeling process, as well as allow development of new diagnostics for diseases associated with high collagen remodeling activity.

Imaging Denatured Collagen Strands In vivo and Ex vivo via Photo-triggered Hybridization of Caged Collagen Mimetic Peptides

This procedure demonstrates in vivo near IR fluorescence imaging of collagen remodeling activities in mice as well as ex vivo staining of collagens in tissue sections using caged collagen mimetic peptides that can be photo-triggered to hybridize with denatured collagen strands.

変性コラーゲンストランドを画像化する<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;生体外</em&gt;リテーナ入りコラーゲン模倣ペプチド写真·トリガブリダイゼーション経由

Collagen is a major structural component of the extracellular matrix that supports tissue formation and maintenance. Although collagen remodeling is an ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

近赤外Photoimmunotherapy法を用いた混合3D文化からの選択的な細胞除去

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

治療用途のためのツールとしてのRGD官能ヒドロゲルの合成

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

液晶ナノ粒子キャリアにおける疎水性貨物カプセル化の標的細胞膜配達

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

セミフレキシブル高分子を研究する多目的ツールとして DNA ナノチューブ

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光

のためのツールとしてのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光