この作品は、NIH / NCI助成金番号1R01CA158372-01（チー）に新薬国家重点プロジェクト無償数009ZX09102-205（チー）により部分的にサポートされていました。書き込み支援は博士ジュディRacadioから提供され、血液腫瘍のシンシナティ大学の学科によって資金を供給された。シンシナティ大学医学部の大学のVontzコアイメージングラボ（VCIL）。

動物使用の倫理声明。シンシナティ小児病院研究財団（動物福祉保証番号A3108-01）：すべての動物実験は、シンシナティ大学の施設内動物管理使用委員会（11-05-05-02 IACUCプロトコル番号）によって承認された。マウスを含むすべての実験は、シンシナティ大学およびシンシナティ小児病院研究財団の動物ケアのガイドラインに従った。 1。動物モデルを準備します 注：以下の通り三つの異なる動物モデルは、我々の先行研究で用いられてきた。 <ol><li>同所脳腫瘍マウス：頭蓋内に人間U87-ΔEGFR-Luc細胞を注射されてきたのNu /ニュースキン無胸腺雌マウスを使用してください。これらのマウスは、ヒト神経膠芽腫の典型的な特徴を示す積極的な腫瘍を開発しています。 </li><li>遺伝子操作した脳腫瘍モデルマウス13：MUT3（GFAP-CRE品種; Nf1loxをP / +; Trp53loxP/loxPとTrp53の - / +）雄性マウス; PtenloxP /のloxPメスMut6マウスを生成する（GFAP-CRE; Nf1loxP / +; Trp53-/loxP; PtenloxP / +）。女性B6CBAF1 / Jマウスと雄のMUT3マウスを交配することによりB6CBAF1 / J株でMUT3マウスを維持する。 P9とP12の間にマウスの遺伝子型とその組織を収穫した後に遺伝子型を確認してください。 </li><li> K / BXN関節炎：腹腔KRN XがうなずくF1マウスからの150μlの血清を用いて投与されている使用C57BL/6Jマウス。これらのマウスは、関節炎の血清注射後24〜48時間を開発しています。関節炎マウスのイメージングは​​、血清投与マウスは明白な巨視的関節炎を呈した時点次の7日目に行われる。マウスは、次のステップで概説された基準を用いて評価する必要があります。 <ol><li> 0 =検出可能な関節リウマチ、1 =腫脹および/または足の発赤や1桁、2 =関与する2つの関節、3 = 3関節invol：次のように関節炎指数巨視的スコアリングシステムを使用して、巨視的関節炎マウスの評価VED、全体の足と桁の4 =重度の関節炎。関節炎採点システムが影響を受け関節の数、マウスの足における関節炎の重症度を決定するために使用される。可能な限り最高の関節炎スコアでさえマウスはほとんど不動の兆しを見せていない。しかし、関節炎（例えば食品や水の消費量を抑制する腫れ足から厳しい不動など）、過度の痛み、監視対象の週3回マウスを屠殺している。 </li><li>注：無菌性は、実験を通して維持されている流体は、マウスの尾静脈にIV注射した。清潔な、無菌、使い捨てシリンジおよびバイアルを、研究溶液の調製および投与に使用される。 </li></ol></li></ol>蛍光標識SAPC-DOPSナノベシクルの2。準備<ol><li> SAPCタンパク質産生：SAPC正確なヒト配列を有する組換えSAPCタンパク質を大腸菌で産生された大腸菌細胞は、以前に改変して説明4。SAPCは、高速液体クロマトグラフィー精製に続いて​​、エタノールによって沈殿させた。凍結乾燥後、乾燥SAPCを用い、その濃度は、その重量によって決定した。 </li><li>以前7,10,11に記載されているようSAPCタンパク質を混ぜる。ガラス管中DOPS（0.18 mg）及びCVM（0.03 mg）を混合し、脂質溶媒を蒸発させ、窒素ガスを使用する。 </li><li>以前7,10,11に記載されているように約15分間乾燥PBS緩衝液1ミリリットル中の混合物を、バス音波処理を中断し、混合物にSAPCプロテインパウダー（0.32 mg）を追加します。そして、自由のCVM色素を除去するためにセファデックスG25カラム（PD-10）を介してサスペンションを渡します。最終製品の励起および発光極大、 すなわち SAPC-DOPS-CVMのナノベシクルは、それぞれ、653 nmおよび677 nmのです。 </li></ol> 3。イメージング<ol><li> MAROIシステムをテストする（ステップ1で上述）脳腫瘍および関節炎のマウスモデルを使用する。 2％のイソフルランで行うために、マウスを麻酔。 1〜2％のイソフルランはmaintaです撮像手順の間、INED。暖かい空気は、連続的に、穏やかに撮像期間中の撮像チャンバーに送達される。眼を覆う潤滑するように、無菌の人工涙液軟膏小ビーズは、マウスのそれぞれの眼に適用される。最初はカメラ（ 図1）に向け、その背骨と仰臥位でマウスを配置することにより、MARSシステムにマウスを置きます。 MARS 380°支持フィルムを校正し、ブルカーMIプロトコル]タブでローテーションソフトウェアを使用して、マウスを置きます。以下のようにして前SAPC-DOPS-CVM政権に対するマウスのベースライン画像を得る。 </li><li>静脈内にマウスの尾静脈にSAPC-DOPS-CVMを200μlを注入。マウスや関節炎、脳腫瘍保有マウスを制御するために管理します。 </li><li>画像マウス24時間後に注射し、再び蛍光（25秒の露光時間）とX線（10秒の露光時間）を考えて7-9日後に注射でI380°にわたって10°刻みでメイジ、回転データセットにギャップがないことを確認するために若干の重複を作成する。ブルカーMIソフトウェアを使用して、解剖学的局在化のためのX線画像上に蛍光を重ねる。 </li></ol> 4。画像解析<ol><li>疾患部位（腫瘍および関節炎）の視野（FOV）の幅を取り囲む長方形のROIを描画します。 ROIは380°の回転の過程で、動物の移動に伴って視野内の病気の機能を維持するのに十分な大きさでなければなりません。脳腫瘍マウス（同所及びトランスジェニックモデル）については、各腫瘍モデルおよびすべての時点（ベースライン、24時間、および9日）その3（3）は、それぞれの対照マウスに同じ長方形のROIを使用しています。各マウスの矩形ROIの位置決めは、各動物の対応するX線画像上の解剖学的ランドマークを利用して、全ての時点にわたって保存される。腫瘍モデルで同定解剖学的ランドマーク（単数または複数）はまた、ナンプラーに使用されなければならない各モデルのそれぞれの対照で同一の矩形のROIをCE。一貫性のあるROIの配置を可能にするX線画像上で識別解剖学的なランドマークは、頭蓋底および頬骨弓の後面があります。彼らは右上で可視化し、事後-前部（PA）の画像横頭蓋骨を残している。 </li><li>自動バックグラウンド除去した後、すべての画像の平均蛍光強度を決定する。蛍光画像は、Bruker MIイメージングソフトウェアを使用して、フォトン/秒/ mm 2のコンバータを使用することができる。撮像角度の関数としての蛍光値をプロットし、エラーをExcelのグラフまたは他のソフトウェアを使用して、対照マウスから得られた平均化蛍光値の標準偏差をバ​​ーとして適用する。 </li></ol>

<ol>
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M., Li, J., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity+and+selectivity+in+skin+cancer+by+SapC-DOPS+nanovesicles.">Cytotoxicity and selectivity in skin cancer by SapC-DOPS nanovesicles.</a> Journal of Cancer Therapy. 3, 321-326 (2012).</li><li>Wojton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+SapC-DOPS+has+antiangiogenic+and+antitumor+effects+against+glioblastoma.">Systemic delivery of SapC-DOPS has antiangiogenic and antitumor effects against glioblastoma.</a> Mol Ther. 21, 1517-1525 (2013).</li><li>Kwon, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pten+haploinsufficiency+accelerates+formation+of+high-grade+astrocytomas.">Pten haploinsufficiency accelerates formation of high-grade astrocytomas.</a> Cancer Res. 68, 3286-3294 (2008).</li></ol>

開示することは何もありません。

リウマチ条件の固形腫瘍および炎症性病巣の位置や大きさを正確に決定するには、適切な治療を実施し、疾患の進行または寛解をフォローアップすることが重要です。貴重ながら、現在の撮像戦略（X線、MRI、超音波、X線コンピュータ断層撮影）は、疾患の状態の不完全な評価を提供。例えば、関節炎の関節損傷は、一般に、骨構造にではなく、軟組織の炎症および破壊、疾患の初期段階の特性に関する情報を提供するX線によって評価される。ここに提示MAROI方法はまた、疾患組織または器官の完全な3Dマッピングおよび再構成を可能にする、統合された非侵襲的かつ単純なプラットフォームにX線および洗練された軟組織画像モダリティ（ 例えば、MRI又は超音波）の両方の利点を兼ね備えマウスなどの小動物。 この方法は、選択的親和oを利用しますF SAPC-DOPSは、がんや炎症性細胞の膜に豊富に存在する公開されるホスファチジルセリン残基のためナノベシクル。このバインディングの決定要因はSAPC、ホスファチジルセリン7,10,11等のアニオン性リン脂質に対する強い親和性を有する融合性リソソームタンパク質である。蛍光プローブ（CVM）に結合すると、全身に注入されたSAPC-DOPSは、蛍光イメージングにより、腫瘍および関節炎サイトにさかのぼることができます。 本手法の限界は、現在では、マウスのような小動物のイメージングにその使用を制限し、その感度、に関連しています。他のイメージング方法と同様に、対雑音比を最適な蛍光シグナルが腫瘍の大きさまたは関節炎の程度によって制約され、そのような耳（脳画像法）、腸などの高バックグラウンド（自家蛍光）を有する組織または器官を画像化する際に損なわれることがある/糞（腹部イメージング）と足（後肢イメージング）。この点において、我々が発見したようなCVMプロとして遠赤色色素vides可視範囲内の他の蛍光プローブよりも、生体内の設定で、より良いスペクトル分離と解像度。 他の落とし穴は、撮像中に両方の麻酔をかけ、 死後 （ 死後硬直 ）しばらく動物の潜在的な動きがあります。後肢の位置決めは、特に、回転時の移動を回避するために安定化させることはしばしば困難である。その現在の状態での技術は、スキャン時間限り60分で完全な回転を完了し、高品質の画像を取得するために必要に応じて用いて、また時間がかかる。 MAROIの方法は、他の画像診断法に比べて多くの利点を提供する。 38（またはそれ以上）の異なる角度からの画像病変組織する能力は単一面からそれを評価する際に妨げられることがあり、蛍光の可視化を可能にする。それが不適切な角度で撮像起因する偽陰性の数を最小限に抑えることができるので、これは動物実験で有用である。 overlによる瑛X線と蛍光画像、患部の正確な解剖学的局在を決定することができる。最後に、生（ インビボ ）イメージングの可能性は、実行されるべき縦断的研究を可能にする。

動物全体のイメージングは​​、動物の生理病理の研究に強力なツールとなっています。現在の撮像系の中で、MS FXのPROは、研究者が正確に生きているマウスでは、蛍光標識された（又は発光）の化合物および/または組織を視覚化すると同時に、X線画像を得ることができる。最近導入されたマルチモーダル動物の回転システム（MARS）でマウスを完全に自動化された回転は、特定の角度1における蛍光/発光及びX線画像の両方を捕捉するために達成される。画像取得は、順次の画像シリーズは、1°と小さく、特定の、増分角度で撮像することができるようにプログラムすることができる。これは、動物の最適配向、 すなわちを識別できるようにするものである。ここで、内部で発生した蛍光/発光シグナル、システムの検出装置との間の距離が最短であること。これは、順番に、その後のイメージングのための動物の正確な再配置を容易にし、SE縦研究中ssions。 本稿では、蛍光マーカー強度のin vivo定量のためのマルチアングル回転光学イメージング（MAROI）システムの実装について説明します。 MAROI信号曲線分析を正確に患部または目的の生物学的プロセスをマッピングするために蛍光シグナル分布の直接相関のための縦断的研究に用いることができる。 このシステムは、マウスの生体内、同所性腫瘍による自発的、ならびに関節炎の病巣によって蛍光標識SAPC-DOPSのナノベシクルの吸収をモニターするために使用した;それは、動物の完全な回転報道から派生したマルチスペクトルおよびマルチモーダルのデータセットを提供した。 in vivoイメージングのために現在利用できる多数の蛍光プローブの中では、近赤外、遠赤のスペクトル領域で発光するものが皮膚や組織との最低の干渉を与える、最高の浸透と画像解像度を提供olution。私たちは、SAPC-DOPS（SAPC-DOPS-CVM）4月12日にラベルを付けるには 、遠赤色蛍光細胞リンカー（例647/Em 667）、CellVueマルーン（CVM） の2,3を使用していました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1246">
	<colgroup>
		<col /> 
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium</td>
			<td style="width:423px;">Gibco (Grand Island, NY)</td>
			<td style="width:307px;">11965</td>
			<td style="width:167px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:423px;">Gibco (Grand Island, NY)</td>
			<td style="width:307px;">16000077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:423px;">Hyclone (Logan, Utah)</td>
			<td style="width:307px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Dioleoylphosphatidylserine</td>
			<td style="width:423px;">Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)</td>
			<td style="width:307px;">840035C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">CellVue Maroon</td>
			<td style="width:423px;">Molecular Targeting Technologies, Inc. (Exton, PA)</td>
			<td style="width:307px;">C-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Sephadex G25 column PD-10</td>
			<td style="width:423px;">Amersham Pharmacia Biotech, (Piscataway, NJ)</td>
			<td style="width:307px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:351px;">New Standard Stereotaxic for Rats and Mice</td>
			<td style="width:423px;">Harvard Apparatus (Holliston, MA)</td>
			<td style="width:307px;">726335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Bransonic Ultrasonic Cleaners Model 1510</td>
			<td style="width:423px;">Branson Ultrasonics (Danbury,CT)</td>
			<td style="width:307px;">CPN-952-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Multi-spectral FX system</td>
			<td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td>
			<td style="width:307px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Multi-angle Rotational Optical Imaging Device</td>
			<td>Bruker Corporation (Billerica, MA)</td>
			<td style="width:307px;"> </td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo optical imaging of brain tumors and arthritis using fluorescent sapc-dops nanovesicles

私たちは、蛍光マーカーで標識された生理病理学的過程のin vivoモニタリングのためのマルチアングル回転光学イメージング（MAROI）システムについて説明します。マウスモデル（脳腫瘍および関節炎）を、この方法の有用性を評価するために使用した。 CellVueマルーン（CVM）フルオロフォアでタグ付けされたサポシンC（SAPC） - ジオレオイルホスファチジルセリン（DOPS）ナノベシクルを静脈内投与した。次いで、動物をインビボイメージング·システムの回転ホルダ（MARS）に入れた。画像は380°にわたって10°ステップで取得した。関心領域（ROI）の矩形領域は、モデル疾患部位で全画像の幅全体に配置した。 ROI内の、すべての画像に対して、平均蛍光強度は、バックグラウンドを差し引いた後に計算した。研究されたマウスモデルにおいて、標識は、同所ナノベシクルおよびトランスジェニック脳腫瘍の両方において、関節炎部位（つま先と足首）に取った。マルチアングルIMAの曲線解析GE ROIが最も高い信号と角度を決定した。したがって、各疾患部位を撮像するための最適な角度を特徴付けた。蛍光化合物の撮像に適用MAROI方法についてマウスモデルにおける疾患状態のin vivo定量分析のために、非侵襲的、経済的、かつ正確なツールである。

私たちは、遠赤色染料（CVM）で標識SAPC-DOPSのナノベシクルは、具体的に同所自発マウス脳腫瘍に蓄積するだけでなく、K / BXNマウスの関節炎の関節であることをここに証明している。マウスの完全な回転中に各疾患部位の上に配置ROIから取得したシリアル蛍光/ X線画像は、最高蛍光強度との最適な撮像角度を明らかにしたMAROI曲線分析に供した。 MARSシステムを使用する主な目的は、最も正確な測定値をとることができるように、蛍光の最適角度を決定することである。脳腫瘍または関節炎を有するマウスを使用して3つの実験からの代表的な結果を示す。 SAPC-DOPS-CVMおよびMARSシステム（ 図1）による関節炎、腫瘍または炎症を観察するための最良の可能な画角を使用することを決定した。 X線の取得に続いて、蛍光画像は、すべての10°を取得したマウスの380°回転時。蛍光画像は、画像表示装置および回転ムービーの生成に対応するX線画像上にオーバーレイした。 同所性脳腫瘍モデルからの結果を図2に実証される。代表的な同所性腫瘍を有するマウス（Ortho1）の蛍光画像を図2Aに示されている。この動物のための最適な画角は、蛍光光子の強度が最大（ 図2B）となる位置10°である。測定はSAPC-DOPS-CVM（ベースライン）を注射し、注射後24時間前に撮影された。対照マウス（腫瘍無料）は、同様の治療を受けた。 図3は、遺伝子操作した脳腫瘍モデルマウスから比較可能なデータを示しています。蛍光画像と光子の測定はSAPC-DOPS-CVM（ベースライン）の注射の前に採取し、24時間（ 図3Aおよびれた&lt;強い&gt; 3B）および注入後の9日間（ 図3C）。これらのグラフは、腫瘍を有する動物（腫瘍Mut49）で最適な撮影角度は20°24時間後に注射が、10°9日後に注射への変更であることを示している。これはおそらく、腫瘍増殖を反映して、形態学的変化と相関し、その蛍光シグナルの変化を示唆している。 表1に示すように、MAROI方法は、明らかに蛍光シグナルが離れて最適な撮像角度からの回転を増加させるための突起で減少することを示している。動物の物理的な向きは、最適な撮像角度からオフセット±10°であった場合は、脳腫瘍では、蛍光シグナルの平均7％の減少が得られた。蛍光シグナルの平均21％の減少が±20°で測定した。このように最適な角度から比較的小さなオフセットは、有意な信号の減衰になることがあります。画像の位置決めのためのMAROI技術を利用することを可能にするINVEより一貫した信頼性のあるデータを生成するstigators。 MAROI方法は、最終的にSAPC-DOPS-CVM注射後SAPC-DOPS-CVM 24時間までに関節炎の関節のターゲティングを評価するために使用した。この動物は、3関節炎と3を獲得した。関節炎マウスのつま先と足首の蛍光画像を図4Aおよび4Bに示されている。 10°回転の間隔で、対応する光子の測定は、 図4Cおよび4Dにグラフ化されています。つま先と足首見つかり最適な撮像角はそれぞれ、140°、120°である。 要約すると、蛍光SAPC-DOPSのナノベシクルとMAROIシステムの組み合わせは、小動物の腫瘍、関節炎の進行の定量的研究を可能にし、ライブイメージングのための、非侵襲的に正確で高感度な戦略を表しています。 360°マルチモーダルイメージングデータセットを取得する可能性がかなり即興達成可能なシングルアングル画像化技術を使用しているものと比較してエスデータ分析および解釈。 <img alt="表1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187table1.jpg" width="600px" /> 表1の各マウスモデルにおける最適撮像角度最大光子蛍光（FLR最適な角度）の角度と標準解剖学的角度（X線）との違いを見ることができる。これらの二つの角度はますます異なってくる場合には、測定された信号が大幅に変更されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187table1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig1.jpg" width="600px"/&gt; 図1。マルチアングル回転光学イメージング（MAROI）デバイス。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig2.jpg" width="600px" /> 図2同所性脳腫瘍マウスモデルにおける画角対蛍光シグナル。 10°の最適な画角でのピークの蛍光シグナルの（A）の画像。青いボックスは、ROIが放出された光子を定量化するために使用示す（B）。光子放出に対する画角のグラフ。代表同所腫瘍を有するマウス（Ortho1）が3非腫瘍マウスでは、同一のROIからの平均蛍光値に対してグラフ化されている。測定は、（注入前）は、ベースラインで採取し、24時間後に充血し、N。エラーバーは標準偏差を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig3.jpg" width="600px" /> 遺伝子操作したマウスモデルの自発的な脳腫瘍での画角の関係を図3。蛍光シグナル。 （A）20℃の最適な画角でのROI 1（上青色のボックス）のピーク蛍光信号の画像は（B）および（C）。ROI 1からの光子放出に対する画角のグラフ。からの値代表自発脳担癌マウス、腫瘍ムート49は、3つの非腫瘍マウスから平均値に対してグラフ化する。測定は、（注入前）ベースライン時および24時間（B）および9日（C）ポスト噴射した。エラーbは<html> ARSは、標準偏差を表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51187/51187fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51187/51187fig4.jpg" width="600px" /> 図4。つま先と足首関節の関節炎のマウスでの画角対蛍光シグナル。 （A）及び（B）。赤枠で示されたROI内で、つま先（A）と足首関節（B）のピークの蛍光信号を示す。（C）対角度のグラフは、TOEのための光子の放出を意味するイメージ。 。ピーク光子放出角度の（D）のグラフ140°の角度で見た対足首のための光子放出を意味することができ;最大強度は、120°の角度で発生します。ターゲットは= &quot;_blank&quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

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In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

私たちは、サポシンC（SAPC） -ジオレオイルホスファチジルセリン（DOPS）ナノベシクルで配信蛍光マーカーのin vivo定量のためのマルチアングル回転光学イメージング（MAROI）システムについて説明します。癌および関節炎のマウスモデルを用いて、我々はMAROI信号曲線分析が正確なマッピングおよび疾患過程の生物学的特徴付けのために使用することができる方法を実証する。

蛍光SAPC-DOPSナノベシクルを用いて脳腫瘍、関節炎のin vivo光イメージング中

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

11.2K ビュー.  University of Cincinnati College of Medicine. 私たちは、サポシンC（SAPC） -ジオレオイルホスファチジルセリン（DOPS）ナノベシクルで配信蛍光マーカーのin vivo定量のためのマルチアングル回転光学イメージング（MAROI）システムについて説明します。癌および関節炎のマウスモデルを用いて、我々はMAROI信号曲線分析が正確なマッピングおよび疾患過程の生物学的特徴付けのために使用するこ?...

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Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&amp;#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

全血刺激のためのアッセイを用いて炎症性サイトカインIL -1βの正確かつ簡単に測定

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

医学

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Probing the Brain in Autism Using fMRI and Diffusion Tensor Imaging

Newly emerging theories suggest that the brain does not function as a cohesive unit in autism, and this discordance is reflected in the behavioral symptoms displayed by individuals with autism. While structural neuroimaging findings have provided some insights into brain abnormalities in autism, the consistency of such findings is questionable. Functional neuroimaging, on the other hand, has been more fruitful in this regard because autism is a disorder of dynamic processing and allows examination of communication between cortical networks, which appears to be where the underlying problem occurs in autism. Functional connectivity is defined as the temporal correlation of spatially separate neurological events1. Findings from a number of recent fMRI studies have supported the idea that there is weaker coordination between different parts of the brain that should be working together to accomplish complex social or language problems2,3,4,5,6. One of the mysteries of autism is the coexistence of deficits in several domains along with relatively intact, sometimes enhanced, abilities. Such complex manifestation of autism calls for a global and comprehensive examination of the disorder at the neural level. A compelling recent account of the brain functioning in autism, the cortical underconnectivity theory,2,7 provides an integrating framework for the neurobiological bases of autism. The cortical underconnectivity theory of autism suggests that any language, social, or psychological function that is dependent on the integration of multiple brain regions is susceptible to disruption as the processing demand increases. In autism, the underfunctioning of integrative circuitry in the brain may cause widespread underconnectivity. In other words, people with autism may interpret information in a piecemeal fashion at the expense of the whole. Since cortical underconnectivity among brain regions, especially the frontal cortex and more posterior areas 3,6, has now been relatively well established, we can begin to further understand brain connectivity as a critical component of autism symptomatology.
A logical next step in this direction is to examine the anatomical connections that may mediate the functional connections mentioned above. Diffusion Tensor Imaging (DTI) is a relatively novel neuroimaging technique that helps probe the diffusion of water in the brain to infer the integrity of white matter fibers. In this technique, water diffusion in the brain is examined in several directions using diffusion gradients. While functional connectivity provides information about the synchronization of brain activation across different brain areas during a task or during rest, DTI helps in understanding the underlying axonal organization which may facilitate the cross-talk among brain areas. This paper will describe these techniques as valuable tools in understanding the brain in autism and the challenges involved in this line of research.

Neuroimaging techniques, such as functional MRI and Diffusion Tensor Imaging have become increasingly useful in characterizing the cognitive and neural deficits in autism. An examination of brain connectivity in autism at a network level along with adaptations for scanning children with developmental disabilities is presented.

fMRIと拡散テンソル画像を用いた自閉症で脳を探る

Newly emerging theories suggest that the brain does not function as a cohesive unit in autism, and this discordance is reflected in the behavioral ...

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

乳幼児の脳代謝と血行動態の非侵襲的光計測

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

In vivo Macrophage Imaging Using MR Targeted Contrast Agent for Longitudinal Evaluation of Septic Arthritis

Macrophages are key-cells in the initiation, the development and the regulation of the inflammatory response to bacterial infection. Macrophages are intensively and increasingly recruited in septic joints from the early phases of infection and the infiltration is supposed to regress once efficient removal of the pathogens is obtained. The ability to identify in vivo macrophage activity in an infected joint can therefore provide two main applications: early detection of acute synovitis and monitoring of therapy.
In vivo noninvasive detection of macrophages can be performed with magnetic resonance imaging using iron nanoparticles such as ultrasmall superparamagnetic iron oxide (USPIO). After intravascular or intraarticular administration, USPIO are specifically phagocytized by activated macrophages, and, due to their magnetic properties, induce signal changes in tissues presenting macrophage infiltration. A quantitative evaluation of the infiltrate is feasible, as the area with signal loss (number of dark pixels) observed on gradient echo MR images after particles injection is correlated with the amount of iron within the tissue and therefore reflects the number of USPIO-loaded cells.
We present here a protocol to perform macrophage imaging using USPIO-enhanced MR imaging in an animal model of septic arthritis, allowing an initial and longitudinal in vivo noninvasive evaluation of macrophages infiltration and an assessment of therapy action.

In vivo Macrophage Imaging Using MR Targeted Contrast Agent for Longitudinal Evaluation of Septic Arthritis

We demonstrate how to perform macrophage MR imaging using ultrasmall superparamagnetic contrast agent (USPIO) in septic arthritis, allowing an initial and longitudinal in vivo non-invasive evaluation of macrophages infiltration and an assessment of therapy efficacy.

敗血症性関節炎の経時的評価のためにMRターゲット造影剤を用いたin vivoイメージングのマクロファージ

Macrophages are key-cells in the initiation, the development and the regulation of the inflammatory response to bacterial infection. Macrophages are ...

Combined In vivo Optical and &#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in vivo optical and &#956;CT imaging allow the visualization of biological phenomena in an anatomical context. These imaging modalities may be especially useful to study conditions that impact bone. In particular, orthopaedic implant infections are an important problem in clinical orthopaedic surgery. These infections are difficult to treat because bacterial biofilms form on the foreign surgically implanted materials, leading to persistent inflammation, osteomyelitis and eventual osteolysis of the bone surrounding the implant, which ultimately results in implant loosening and failure. Here, a mouse model of an infected orthopaedic prosthetic implant was used that involved the surgical placement of a Kirschner-wire implant into an intramedullary canal in the femur in such a way that the end of the implant extended into the knee joint. In this model, LysEGFP mice, a mouse strain that has EGFP-fluorescent neutrophils, were employed in conjunction with a bioluminescent Staphylococcus aureus strain, which naturally emits light. The bacteria were inoculated into the knee joints of the mice prior to closing the surgical site. In vivo bioluminescent and fluorescent imaging was used to quantify the bacterial burden and neutrophil inflammatory response, respectively. In addition, &#956;CT imaging was performed on the same mice so that the 3D location of the bioluminescent and fluorescent optical signals could be co-registered with the anatomical &#956;CT images. To quantify the changes in the bone over time, the outer bone volume of the distal femurs were measured at specific time points using a semi-automated contour based segmentation process. Taken together, the combination of in vivo bioluminescent/fluorescent imaging with &#956;CT imaging may be especially useful for the noninvasive monitoring of the infection, inflammatory response and anatomical changes in bone over time.

Combined In vivo Optical and  &amp;#181;CT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice

Combined optical and &#956;CT imaging in a mouse model of orthopaedic implant infection, utilizing a bioluminescent engineered strain of Staphylococcus aureus, provided the capability to noninvasively and longitudinally monitor the dynamics of the bacterial infection, as well as the corresponding inflammatory response and anatomical changes in the bone.

合わせた<em&gt;インビボ</em&gt;光とμCTイメージングマウスにおける整形外科インプラント感染で感染症、炎症、および骨解剖学を監視する

Multimodality imaging has emerged as a common technological approach used in both preclinical and clinical research. Advanced techniques that combine in ...

Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live animal &#8211;&#160;particularly in sites with unique physiological and architectural qualities such as the brain. In vitro and ectopic models cannot account for features such as vasculature, blood brain barrier, metabolism, drug delivery and toxicity, and a host of other relevant factors. Orthotopic models have their limitations too, but with proper technique tumor cells of interest can be accurately engrafted into tissue that most closely mimics conditions in the human brain. By employing methods that deliver precisely measured volumes to accurately defined locations at a consistent rate and pressure, mouse models of human brain tumors with predictable growth rates can be reproducibly created and are suitable for reliable analysis of various interventions. The protocol described here focuses on the technical details of designing and preparing for an intracranial injection, performing the surgery, and ensuring successful and reproducible tumor growth and provides starting points for a variety of conditions that can be customized for a range of different brain tumor models.

The brain is a unique site with qualities that are not well represented by in vitro or ectopic analyses. Orthotopic mouse models with reproducible location and growth characteristics can be reliably created with intracranial injections using a stereotaxic fixation instrument and a low pressure syringe pump.

解剖学的に正確な作成と人間の脳の腫瘍の再現性頭蓋内異種移植片

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

共焦点光学イメージングによるローズベンガル光血栓<em&gt;インビボ</em&gt;：単一の容器ストロークのモデル

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

ヒト腫瘍異種移植片からマウス細胞の枯渇は大幅に標的細胞の下流分析を向上させます

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the present protocol, mice expressing green fluorescent protein (gfp) under the promoter of Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) were used to image microglia cells in vivo in the retina. Microglia are resident macrophages of the retina and have been implicated in several retinal diseases1,2,3,4,5,6. This protocol provides a detailed approach for generation of retinal B-scans, with SD-OCT, and imaging of microglia cell distribution in Cx3cr1gfp/gfp mice with SLO in vivo, using an ophthalmic imaging platform system. The protocol can be used in several reporter mouse lines. However, there are some limitations to the protocol presented here. First, both SLO and SD-OCT, when used in the high-resolution mode, collect data with high axial resolution but the lateral resolution is lower (3.5 &#181;m and 6 &#181;m, respectively). Moreover, the focus and saturation level in SLO is highly dependent on parameter selection and correct alignment of the eye. Additionally, using devices designed for human patients in mice is challenging due to the higher total optical power of the mouse eye compared to the human eye; this can lead to lateral magnification inaccuracies7, which are also dependent on the magnification by the mouse lens among others. However, despite that the axial scan position is dependent upon lateral magnification, the axial SD-OCT measurements are accurate8.

In Vivo Imaging of Cx3cr1gfp/gfp Reporter Mice with Spectral-domain Optical Coherence Tomography and Scanning Laser Ophthalmoscopy

This protocol describes how high-resolution imaging techniques such as spectral domain optical coherence tomography and scanning laser ophthalmoscopy can be utilized in small rodents, using an ophthalmic imaging platform system, to obtain information on retinal thickness and microglial cell distribution, respectively.

生体内でスペクトル領域光干渉断層法と走査レーザー眼底Cx3cr1gfp/gfpレポーター マウスの画像

Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and scanning laser ophthalmoscopy (SLO) are extensively used in experimental ophthalmology. In the ...