この作品は、バイオテクノロジー·生物科学研究会議（BBSRC）、王立協会とノッティンガム大学でサポートされています。

MANT標識ヌクレオチドの結合時に蛍光強度変化の1。決定。 <ol><li>適切な反応緩衝液中1μMのキネシン（最終濃度）に1μMのMANT標識ヌクレオチドを​​追加します。通常、微小管の成長と安定に利益をもたらすバッファが（議論を参照）が使用されます。一般的に使用される緩衝液は80mMのピペラジン-ビス-2 -エタンスルホン酸（PIPES）、pH6.9を含有し、1mMのMgCl 2および1mMのエチレングリコールビス2アミノエーテル四酢酸（EGTA）。 注：すべてのプロトコルに記載されたキネシンの濃度は、ヌクレオチド結合部位（ すなわち、モータードメイン）の濃度を意味する。別のキネシンは、単量体、二量体または四量体として存在するので、分子当たり二つ以上のヌクレオチド結合部位を含むことができる。 </li><li>インキュベーション期間（1-3分）後、標準的な蛍光光度計を使用して、マント標識ヌクレオチド、キネシン複合体について発光スペクトルを測定する。 365nmの励起波長を使用し、1nmの増分で400〜500nmの発光を測定する。 </li><li>ステップ1.1で使用したのと同じ反応緩衝液中1mMのMANT標識ヌクレオチドの溶液を作る。 </li><li>前述のように、マントヌクレオチドのみのサンプルについて、発光スペクトルを測定し（ステップ1.2参照）。 </li><li>この値で割ることを通じて（キネシンことなく、 すなわち ）溶液にマントヌクレオチドのスペクトルのピークの蛍光強度の波長の信号にスペクトルを正規化する。 </li><li> （ 例えば、 図2B）は mantATP結合および/ ​​または溶液中mantADP結合キネシンとMANTヌクレオチドの間の蛍光強度の違いを観察するために正規化されたスペクトルをプロットします。 </li></ol> mantATPための会合および解離速度定数の2。測定<ol><li>任意の適切なマグネシウムで最大20μMのキネシン（説明を参照してください）2 +フリー緩衝剤（ 例えば、80ミリメートルPIPES pH6.9、1mMのEGTA、0.1％のTween20）の溶液に、1を追加mMの（最終濃度）エチレンジアミン四酢酸（EDTA）および1mM（最終濃度）ジチオスレイトール（DTT）。注：バッファへのTween20の添加が推奨され、それが減少するように/バッファー交換に使用したカラムにキネシンタンパク質の損失を防止する（ステップ2.3および3.3） </li><li> 15分間、25℃で溶液をインキュベートする。 </li><li>製造業者の指示に従って重力流G-25セファデックスゲルろ過カラムを用いキネシンとは別の自由ヌクレオチドおよびEDTA（材料のリストを参照）。 <ol><li> （ステップ2.1参照）、適切なマグネシウム2 +のない緩衝の少なくとも3カラム容量でカラムを平衡化する。カラムにキネシンを含む溶液をロードします。塩化マグネシウムの最終濃度はキネシン液の採取後1 mMであるように、空のチューブに100mMの塩化マグネシウム溶液の適切な量を添加することによって収集チューブを準備する。塩化マグネシウムの即時の追加はstabiliに役立ちますヌクレオチドフリーキネシンをSE。 </li><li>適切なマグネシウム2 +フリー緩衝液を用いて、キネシンを溶出。そう、それが迅速に作業することが重要であるとき、ヌクレオチドの自由キネシンは不安定である。氷の上のヌクレオチドの無キネシンを保存し、1〜2時間以内に使用しています。 </li></ol></li><li>中またはヌクレオチドフリーキネシンの製造に先立って、ヌクレオチドフリーキネシンの最終的な解決策として、同じ反応緩衝液中mantATP濃度シリーズを用意。 0.1〜50μM（ステップ2.5および説明を参照）に至るまでの典型的なシリーズとキネシンの利用可能な濃度に応じて必要なmantATPの濃度の範囲を決定します。 </li><li>ヌクレオチドフリーキネシンの濃度シリーズを準備します。 mantATPの各濃度（2.4ステップ）、ヌクレオチドフリーキネシンの濃度はMANT標識ヌクレオチドは、キネシンのヌクレオチド結合部位を介して5から10倍モル過剰であるように準備する必要があります。 </li><li>ストップトFLOに励起波長を設定します365nmでのwの光度とロングパスフィルタを使用して&gt; 400 nmで放射された光を集める。 </li><li>ストップフロー蛍光光度（ 図3Aおよび3B 挿入図 ） を使用して、1（v / v）の比：mantATPの最低濃度から始めて、1ヌクレオチドの無キネシンの適切な濃度のmantATPを混ぜる。注：反応物は混合時に50％に希釈する。混乱を避けるために（ すなわち、3.0 / 1.5μM）前と後の両方の混合ヌクレオチド濃度をメモしておいてください。 </li><li>指数関数プラスマント基（ すなわちの退色を考慮するために一定の負の傾斜のラインにmantATPの各濃度で測定された蛍光強度の変化を取り付け、蛍光を0 .EXP（K OBS .T）+（メートル=。トン+ 0は振幅であるc）は、k個の実測値は、速度定数であり、tは、） 図3Bおよび議論を参照の時間である。これらのフィットから決定するmantATPの各濃度の速度定数（k OBS）。各k個の OBSが会合および解離速度定数（ 図1、K 1およびk -1）の畳み込みである。 </li><li> （ 例えば 、図3C）mantATP濃度に対してk個の OBSをプロットすることによって会合及び解離速度定数をデコンボリューション。勾配とy軸切片を得るために、一次関数（ すなわち、k個の OBS = k 1は [mantATP] + K -1）にこれらのデータを合わせる。勾配は単位M -1 s -1のとmantATPアソシエーション（ 図1で、k 1）についての速度定数を表す。切片は、s -1（考察を参照）の単位を有する解離速度定数（ 図1 で、k -1）を表す。注：この方法はまた、ADPの結合および解離を決定するために適用することができる塩基としてmantADPを使用して速度定数（ 図1で、k -4およびk 4）。 </li></ol> mantADPための解離速度定数（3）測定<ol><li>適切な反応緩衝液中の2μMキネシンの溶液に（ 例えば、80 mMのPIPES pH6.9、1mMのMgCl 2を 、1mMのEGTAは、0.1％のTween20）、50μMのmantADP（最終濃度）を追加します。 </li><li> 30分間25°Cのでインキュベートする。 </li><li> G-25セファデックスカラムを用いて選択された反応緩衝液中にキネシンを交換バッファによって過剰mantADPや他のフリーのヌクレオチドを​​取り外し、製造者の指示に従って（材料のリストを参照してください）​​。キネシンモータードメインは現在、mantADPをロードする必要があります。 </li><li> 365 nmのストップフロー蛍光計で励起波長を設定し、ロングパスフィルタを使用して&gt; 400 nmで放射された光を集める。 </li><li> 50倍以上のモラでmantADP.kinesin複合体（〜1μM）をミックスストップフロー蛍光光度（ 図4Aおよび4B 挿入図 ） を使用して、1（v / v）の比：1の非標識ATPのr個の過剰。 </li><li>マントグループの光退色を考慮するために、単一の指数関数に加えて一定の負の傾斜のラインに時間をかけて観察された蛍光強度の減少（ すなわち、蛍光= 0 .EXP（K OBS .T）+（m.t +フィットc）に示すように、0は振幅であり、k個のOBSは速度定数、tは時間である、 図4Bおよびディスカッション）を参照してください。このフィットから決定のk obsは、sの単位で、ADPの解離の速度定数（ 図1、K 4）-1（説明を参照）。 </li></ol>

<ol>
	<li>Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+kinesin+motor+proteins.">Structures of kinesin motor proteins.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66, 958-966 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+kinesin+ATP+turnover+to+translocation+and+microtubule+regulation:+one+engine,+many+machines.">Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).</li><li>Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+pathway+for+activation+of+the+kinesin+motor+ATPase.">A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase.</a> EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).</li><li>Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conformational+changes+in+a+kinesin+motor+catalyzed+by+interaction+with+microtubules.">Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules.</a> Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).</li><li>Kikkawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch-based+mechanism+of+kinesin+motors.">Switch-based mechanism of kinesin motors.</a> Nature. 411, 439-445 (2001).</li><li>Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+the+ATP+turnover+cycle+of+microtubule+motors.">Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors.</a> Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+analogues+at+a+glance.">ATP analogues at a glance.</a> J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-13+MCAK+has+an+unconventional+ATPase+cycle+adapted+for+microtubule+depolymerization.">The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization.</a> EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).</li><li>Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+processive+ATP+hydrolysis+by+kinesin.">Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin.</a> Nature. 373, 671-676 (1995).</li><li>Sadhu, A., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+kinesin+ATPase.">A kinetic study of the kinesin ATPase.</a> J. Biol. Chem. 267, 11352-11359 (1992).</li><li>Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+interaction+of+2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP+with+myosin+subfragment+1+and+actomyosin+subfragment+1:+characterization+of+two+acto-S1-ADP+complexes.">Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes.</a> Biochemistry. 30, 422-430 (1991).</li><li>Hackney, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ADP-stimulated+ADP+release+and+dissociation+of+tethered+kinesin+from+microtubules.+Implications+for+the+extent+of+processivity.">Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity.</a> Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).</li><li>Lockhart, A., Cross, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+motility+of+the+Eg5+microtubule+motor.">Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor.</a> Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).</li><li>Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATPase+pathway+that+drives+the+kinesin-14+Kar3Vik1+powerstroke.">The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke.</a> J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).</li><li>Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ATP+hydrolysis+by+monomeric+and+dimeric+kinesin.">Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin.</a> Biochemistry. 37, 800-813 (1998).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase.">real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).</li><li>Goodrich, J. A., Kugel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, 69-97 (2006).</li><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy.">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).</li><li>Olmsted, J. B., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+and+nucleotide+requirements+for+microtubule+polymerization+in+vitro.">Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro.</a> Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).</li><li>Brinkley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules:+a+brief+historical+perspective.">Microtubules: a brief historical perspective.</a> J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).</li><li>Ostap, E. M., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+kinetic+characterization+of+the+Acanthamoeba+myosin-I+ATPase.">Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase.</a> J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).</li><li>Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+approaches+to+the+study+of+the+p21ras+GTPase+mechanism.">Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism.</a> Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).</li><li>Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+methods+in+the+study+of+small+GTP-binding+proteins.">Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins.</a> Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害がないことを宣言します。

ここでは、キネシンのヌクレオチド状態間の遷移の動態の観察と分析のためのプロトコルを提示する。これらのプロトコルは、蛍光標識ヌクレオチドと組み合わせて迅速な混合方法ストップフローを利用している。このタイプの方法は、結合およびキネシン9-11,13-16のさまざまな解離ヌクレオチドを研究するために広く使用されてきた。記載されている方法は、リン酸の放出を観察します（ 図1、ステップ3）許可されていません。しかし、ストップフロー蛍光は蛍光強度の変化17に結合するために、リン酸の産生をリンセンシングタンパク質を使用することによって、この移行を観察するために使用することができる。タンパク質に結合した場合、一般的に蛍光強度の増加を呈する小フルオロフォアmethylanthraniloyl（マント）で標識された使用ヌクレオチドを​​、提示される方法。 R上の2 &#39;または3&#39;位のいずれかにコンジュゲートまた、マントのフルオロフォア、ibose、多くの場合、ヌクレオチド9-12の結合、解離または加水分解にほとんどまたは全く影響を及ぼさない。マント標識ヌクレオチドは、商業的供給源（材料のリストを参照されたい）から容易に入手可能であり、単一異性体8まで精製の ​​際には迅速に再平衡として2 &#39;、3&#39;結合体の混合物として提供される。マント標識ヌクレオチドは、ヌクレオチド結合および解離の動態を観察することが可能な優れたレポーター分子を作る。 蛍光標識ヌクレオチドの使用が記載されたアッセイのうち読み取りが蛍光強度の実時間変化であることを意味している。これは、試薬の迅速な混合及びその後の反応に伴う蛍光の変化をリアルタイムで観察できるストップフロー蛍光に対するこれらのアッセイに最適です。検出の方法として、混合技術と蛍光としてストップトフローの組み合わせが比較的サンプルエフあるシステムを作り出すficient。たとえば、 図3Cに示すデータを取得することは、0.8が必要- 、精製されたキネシン13の1.0 mgのMCAK、及び図4Bに示すデータを取得するために、精製〜キネシン13 0.3mgの、MCAKを必要とする。フルオロフォアとしてマントの使用の1つの欠点は、それが光退色する傾向があることである。これは、ストップフローにおいて、キネシンの非存在下で、反応緩衝液でマント標識ヌクレオチドの溶液を混合することによってキネシン反応速度から分離して観察することができる。マント基は漂白なるにつれて蛍光強度の遅い減少が観察される。マントグループの光退色を記載されたプロトコルで使用されるタイムスケールの範囲にわたってよく線形関数によって記述される。したがって、光退色のためのデータを修正する簡単な方法は、線形関数（ すなわち 、メートル+ c）のではなく、単一のパラメータによって記述より一般的な平らなベースラインにより記述ベースラインと指数関数にフィットすることである。 mantATPバインディング mantATPの会合および解離速度定数微小管の非存在下におけるキネシンヌクレオチド結合部位に結合したままで（第2節）、ADPを測定する場合、削除する必要があります。これはmantATPの会合および解離（ 図1、ステップ1）は、ADPの解離か ​​ら分離して観察することができます。これを達成するためにキネシンは、ヌクレオチド結合部位（ステップ2.1）上のEDTAの少なくとも50倍過剰とインキュベートする。 EDTAはMgが2 +、ヌクレオチド11の放出をもたらすヌクレオチド結合ポケットから解離させるのMg 2 +イオンを封鎖する。実施することは、2.1のステップしたがって、 - 2.3、それが2 +のMgを含まない緩衝液を使用することが重要です。ヌクレオチドフリーキネシンタンパク質は、遊離ヌクレオチドからおよびEDTAの両方からそれを分離するために交換されるバッファである。この分離、使い捨ての重力流れGEを達成するためにlの濾過カラム（材料のリストを参照）に十分なものであり、シンプルで使い迅速である。ヌクレオチド無料キネシンとmantATPの相互作用は、結合および解離速度定数（ステップ2.8）のデコンボリューションを可能にするためにmantATP濃度（ステップ2.4​​）の範囲で行われる。このタイプの実験の背後にある理論は、1つのウェルがmantATPの最低濃度で始まるこれらの実験を行う際の基準18に記載されている。これは、異なる濃度の間の洗浄ステップの必要性を削除します。これは、おそらくmantATP濃度が増加するにつれて、ストップフロー蛍光光度計の感度を調整する必要がある。 mantATP濃度は常に疑似一次条件下を維持するためにキネシンヌクレオチド結合部位の濃度よりも少なくとも5倍過剰に存在する必要があります。 mantATPの濃度が増加するにつれてしかし、信号の変化が減少キネシンに結合するヌクレオチドの割合として圧倒さになり得る。 Therefo再、キネシンの濃度もmantATPの濃度は、ヌクレオチド結合部位（ステップ2.6）上の10倍モル過剰よりも大きくなることはありませんようにmantATPのそれぞれの新しい濃度​​で増加している。 mantADP解離 mantADPための会合および解離速度定数はmantATP（セクション2）について記載した同じ方法によって決定することができるが。キネシンからのADPの解離を直接mantADP（ステップ3.1〜3.3）を有するヌクレオチド結合部位をプリロードすることによって観察することができるmantADP.kinesin複合体は、非標識ATP（ステップ3.5）を超えると混合される。過剰の非標識ATPはキネシンにmantADPの再結合を防止し、それによって解離反応（ 図1、K 4）mantADPの関連付けから分離して観察することができます。このアッセイにおいて、非標識ATPの濃度は、NUCの少なくとも50倍モル過剰でなければならない結合部位をleotide。このアッセイの背後にある理論は十分にこの直接法は、ステップ2.8に記載されたy軸に外挿より一定の解離速度のため、より正確な値を与える基準18に記載されている。 微小管を含める 記載された方法はまた、微小管の存在下でヌクレオチド結合及び解離の動態を決定するために用いることができる。 図3Bと4Bの下、注射器：微小管は、先行ストップフローでの混合に注射器を含むヌクレオチドに導入される （ 挿入図 ）。この構成では、キネシンは微小管を満たすと同時にヌクレオチドを​​満たす。安定化された微小管は、チューブリン重合体の寿命は、安定化化学物質、のいずれかの使用によって拡張される場合、使用されているような &#39;グアノシン-5などのタキソール、または非加水分解性GTP類似体、など - [（α、β） -methyleno]三リン酸（GMPCPPは、材料のリストを参照してください）​​。これは、液体窒素9,19で何ヶ月も保存することができる微小管を作るためにGMPCPPでチューブリン重合の2つのサイクルを使用することが可能である。あらかじめ準備された微小管の使用は、これらのアッセイを実行する際に実際的な困難を軽減します。アッセイにおける微小管を含めるためには、微小管の安定性に適した反応緩衝液を使用することが重要である。選択のバッファーは80 mMのPIPES pHを6.9、1 mMのMgCl 2および1mMのEGTA（BRB80として知られている）20,21を含む最も一般的に使用されるバッファーでベースPIPES、です。 記載の方法は、キネシンの使用に限定されないが、任意のヌクレオチド結合タンパク質に適合し、適用することができる。例えば、同様の方法は、分子モーター12,22のミオシンファミリーのメンバーのATPターンオーバーサイクルに適用されており、マント標識グアノシンヌクレオチドの使用は、さらに拡張しこのタイプの方法は、タンパク質23,24を加水GTPする。

キネシンは、高度に保存されたモータードメイン1によって特徴付けられるタンパク質のスーパーファミリーである。キネシンモータードメインは、ヌクレオチド依存的に微小管と相互作用する。キネシンファミリーのメンバーは、微小管の動態2,3を制御する非転位微小管の端結合キネシンと微小管に沿っ向かう形で貨物を運ぶトランスロケーションキネシン、、、から関数の範囲を表示します。 キネシンは微小管細胞骨格4-6との相互作用を調節するためにアデノシン-5&#39;-三リン酸（ATP）の売上高を使用しています。 ATP、ADP、ADP.Piあるいは全くヌクレオチドが結合することができます（ 図1）：微小管のためのキネシンモータードメインため、その親和性のコンホメーションは、その塩基の状態に依存します。キネシンの分子メカニズムを理解するために、ATPの代謝回転と微小管の相互作用との関係の理解が必要である。ザ·reforeは、キネシンの分野における主要な目標は、微小管の存在下および非存在下で異なるヌクレオチド状態と、それらの両方の間の遷移の動態の機能的特性を特徴付けることである。 <img alt="図1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" /> キネシンのための最も簡単なATPターンオーバーサイクル1図は、4つの可能な状態で構成されています。ヌクレオチドフリー（Φ）、ATP結合、ADP.P iは結合型とADP結合 4遷移のそれぞれは、前進することを特徴とすると。逆方向速度定数（k xおよびkはそれぞれ-x）。 ATP代謝回転の化学サイクルが微小管の相互作用の機械的なサイクルに連結されているかを理解するためには、microtubが存在しない場合に速度制限され、ATPターンオーバーサイクルのどの段階を決定する必要がありますその後ulesとサイクルは、微小管の存在によって変化する方法を決定します。最も単純なATPターンオーバーサイクルは4つの個別の化学物質のステップで構成されています（1）ATPが空の部位に結合する（Φは空のサイト、 すなわち、ヌクレオチドのないキネシンを表す）; （2）ATP開裂; （3）リン酸解離、（4）ADP解離（ 図1）。律速段階は完了し、ATPターンオーバーサイクルの速度定数を設定します。そのため、個別の遷移の各測定され、完全なサイクルの速度定数と比較する必要があり律速となるステップを決定する。全体的なATPターンオーバーサイクル速度定数を測定する方法がここに記載されていないが、ここでは参考7に見ることができる、個々の化学工程のための速度定数を決定することができる方法を記載している。塩基加水分解タンパク質のターンオーバーのサイクルで個別の遷移を研究するために利用可能な方法がいくつかあります。ここで紹介する方法はadvantagを取るフルオロフォアmethylanthraniloylで標識されたヌクレオチドの性質のeは、通常、タンパク質8に結合すると蛍光強度の変化を表示するマントと呼ばれる。その小さなサイズは、リボース（ 図2A）に結合されたとき、それは一般にヌクレオチド結合または加水9-12の動態にほとんど又は全く影響を及ぼさない、ことを意味するためマントグループが使用されている。ここでは、キネシンのATPターンオーバーサイクルでヌクレオチド結合および解離の観察を可能にするストップフロー蛍光と併せてマント標識ヌクレオチドの使用を記述するプロトコルを提示する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="781">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:279px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;triphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-202</td>
			<td style="width:279px;">mantATP</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;-diphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-201</td>
			<td style="width:279px;">mantADP</td>
		</tr>
		<tr height="134">
			<td height="134" style="height:134px;width:220px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:147px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;"># 10519979001</td>
			<td style="width:279px;">The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100&#160;mM in 100&#160;mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260&#160;nm (e = 15400&#160;M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20&#160;oC.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP120-500</td>
			<td style="width:279px;">0.5&#160;M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:220px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:147px;">Melford</td>
			<td style="width:136px;">MB1015</td>
			<td style="width:279px;">1&#160;M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">NAP-5 column</td>
			<td style="width:147px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;"># 17-0853</td>
			<td style="width:279px;">G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:220px;">GMPCPP</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-405</td>
			<td style="width:279px;">nonhydrolysable analogue of GTP</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:220px;">Stopped-flow fluorimeter&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Applied Photophysics</td>
			<td style="width:136px;">SX20</td>
			<td style="width:279px;">A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1&#160;-&#160;100&#160;s to be monitored.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins

微小管関連モータータンパク質キネシンスーパーファミリーは、両方のは、ATPを加水分解し、微小管を結合し、特徴的なモータードメインを共有しています。キネシンは、ATP売上高のと微小管の相互作用の両方のスーパーファミリー間での違いを表示します。これらの違いは、そのような貨物輸送、微小管滑り、微小管脱重合と微小管の安定化などのさまざまな機能に対して特定のキネシンを調整。キネシンの作用機序を理解するためには、ATP代謝回転の化学サイクルが微小管の相互作用の機械的なサイクルに連結されているかを理解することが重要です。 ATPターンオーバーサイクルを分析するために、1つのアプローチは、サイクル内の個別のステップを可視化する蛍光標識ヌクレオチドを​​利用することである。 ATPターンオーバーサイクルにおける各ヌクレオチドの移行の動力学を決定することは、完全なサイクルの律速段階またはステップを識別することができる。キネシンのためには、律速段階を知ることが重要であるキネシンは、微小管と相互作用する場合、微小管が存在しないことは、このステップは、一般的に数千倍に加速されるように。微小管の非存在下でのサイクルは完全にキネシンのATPターンオーバーサイクルを理解するために、微小管の存在下でのそれと比較する。個別のヌクレオチド転移の動力学は、一般的に手動で、特に微小管の存在下で、反応物質を混合することによって観察するにはあまりにも高速である。そのような速度は数ミリ秒ほど少しの時間スケールで観察することを可能にするストップフロー蛍光光度計など、急速な混合装置は、そのような遷移を監視するために使用することができる。ここでは、ストップトフローによる試薬の迅速な混合は、キネシンのATPターンオーバー周期を分析するために蛍光標識ヌクレオチドと組み合わせて使用​​されるプロトコルを説明する。

マント群の蛍光強度の増加は、典型的には、キネシンにマント標識ヌクレオチドの結合の際に観察される。しかし、このような信号変化の大​​きさは、問題の特定のキネシンに依存する。したがって、動的アッセイに進む前に、蛍光強度変化の存在および大きさの両方を確認するために平衡測定を行うことが有用である。 mantATPとmantADPための代表的な蛍光スペクトルは、溶液中およびキネシン-13との複合体の両方において、MCAKは、 図2Bに示されている。これらのデータは、MCAKに結合するとmantATPとmantADP両方で表示される蛍光強度の増加を強調表示します。キネシンにマントヌクレオチドの結合時の蛍光強度の変化は、ATPとADP（セクション2および3）の両方の結合および解離を報告するために使用される。 MCAKの場合には、蛍光強度の差はmantATP.kinesinとmantADP.kinesinの間で観察され<suP&gt; 9。 図3Aは、ヌクレオチドを含まないキネシンとmantATPを混合した際に発生する反応を示している。キネシン13にmantATPの結合の際に発生する蛍光強度の増加を示す代表的なデータを、MCAKは、 図3Bに示されている。 図3Bに示されるタイプのデータがmantATP濃度の範囲で収集される。 mantATP濃度に対して決定される速度定数（k個の 実測値 ）のプロットは、 図3Cに示されている。線形関数にこれらのデータをフィッティング（ すなわち、k個の OBS = K 1 [mantATP] + K -1）は OBSを （2.8ステップ）kに貢献する速度定数のデコンボリューションすることができます。したがって、会合およびmantATPの解離速度定数（ 図1で、k 1とkの両方の決定を可能にする<eM&gt; -1それぞれ）。 図4Aは、非標識ATPを過剰のmantADP.kinesinを混合した際に発生する反応を示している。 図4Bのデータは、キネシン-13、MCAKから解離によりmantADPのために観察された蛍光強度の減少を示している。指数関数（ステップ3.6）にこのデータをフィッティングすることによりmantADPの解離のための一定の割合が直接決定される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" /> フルオロフォアmethylanthraniloyl（マント）で標識した図2ヌクレオチドは、ATPターンオーバーサイクルにおける個別のステップを単離するために使用される。リボース上の位置2 &#39;または3&#39;のいずれかにコンジュゲートマントフルオロフォアの位置を示すmantATPの（A）の構造図（B）の溶液（MAXP）におけるmantATPとmantADPための正規化蛍光スペクトルとmantATPキネシンMCAK（MATP + MCAKとMADP + MCAK）との複合体中のd mantADP。 mantATPスペクトルは、溶液中でmantATPための最大の蛍光とmantADPスペクトルに正規化され、溶液中mantADPのために、最大で蛍光に正規化されている。 MCAKと混合マントヌクレオチドのスペクトルは、1分後の混合で収集される。などのプロトコルに記述されている試薬および蛍光光度設定の濃度が1.1および1.2のステップ。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" /> mantATPの会合速度定数の図3の測定。 （A）図は、ストップフローによって適所ポストミキシング起こる反応を描いた：mantATP（MATP）は、ヌクレオチドのないようにキネシンをバインドします。タンパク質への結合の際にマント基が増加する蛍光強度（B）の蛍光シグナルの変化（黒）MCAK（5 MのνとmantATP（25 M）を混合する際に観察さcleotideフリー）。このデータは、単一指数関数プラスマントフルオロフォアの光退色を占める一定の負の傾き、（説明を参照）の行に（赤点線）適合している挿入図：前ストップフロー蛍光光度に混合するシリンジの内容。ヌクレオチドフリーMCAKとmantATPの反応のために決定され、（C）の速度定数（k個のOBS）は mantATPの濃度に対してプロットした。このプロットは、M -1 sの単位で会合速度定数（ 図1、k は1）である勾配を-1とy切片は解離速度定数である（ 図1 で、k -1）とを有する直鎖領域を有する。秒の単位で-1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 。mantADPがプリロードキネシンは、非標識ATPの過剰に希 ​​釈されています。mantADPの解離速度定数の図4。測定は、（A）は回路図ストップフローによって適所ポストミキシング起こる反応を描いた。解離しmantADPことによりmantADPアソシエーション（説明を参照）の逆反応を防止し、未標識ATPによって置き換えられている。キネシンMCAKからmantADPの解離の際に観察マント基がタンパク質から解離により減少する。（B）蛍光の減少の蛍光強度。蛍光シグナル（ブラック）（説明を参照してください）​​マント·グループの退色を考慮するために単一指数プラス定数負の傾きの直線に適合（破線赤）です。決定された速度定数はmantADP（図1、kの解離についての速度定数である4） 挿入図 ：ストップフロー蛍光光度に混合する前にシリンジの内容<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins at JoVE.com

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

微小管の相互作用のサイクルに結合されたATPターンオーバーのサイクル：キネシンは微小管を有するヌクレオチド依存性相互作用によって特徴付けられる。ここでは、蛍光標識されたヌクレオチドおよびストップフロー蛍光を用いキネシンのATPターンオーバーサイクルにおける個別のヌクレオチド遷移の動態を分析するためのプロトコルを記述している。

キネシンのATPターンオーバーサイクルを分析するためにストップトフロー蛍光および標識ヌクレオチドの使用

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

use-stopped-flow-fluorescence-labeled-nucleotides-to-analyze-atp

Research

JoVE Journal

Chemistry

15.4K ビュー.  University of Nottingham. 微小管の相互作用のサイクルに結合されたATPターンオーバーのサイクル：キネシンは微小管を有するヌクレオチド依存性相互作用によって特徴付けられる。ここでは、蛍光標識されたヌクレオチドおよびストップフロー蛍光を用いキネシンのATPターンオーバーサイクルにおける個別のヌクレオチド遷移の動態を分析するためのプロトコルを記述している?...

ビデオ: Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of molecular iodine to samarium metal in THF.1,2-3 It is a mild and selective single electron reductant and its versatility is a result of its ability to initiate a wide range of reductions including C-C bond-forming and cascade or sequential reactions. SmI2 can reduce a variety of functional groups including sulfoxides and sulfones, phosphine oxides, epoxides, alkyl and aryl halides, carbonyls, and conjugated double bonds.2-12 One of the fascinating features of SmI-2-mediated reactions is the ability to manipulate the outcome of reactions through the selective use of cosolvents or additives. In most instances, additives are essential in controlling the rate of reduction and the chemo- or stereoselectivity of reactions.13-14 Additives commonly utilized to fine tune the reactivity of SmI2 can be classified into three major groups: (1) Lewis bases (HMPA, other electron-donor ligands, chelating ethers, etc.), (2) proton sources (alcohols, water etc.), and (3) inorganic additives (Ni(acac)2, FeCl3, etc).3
Understanding the mechanism of SmI2 reactions and the role of the additives enables utilization of the full potential of the reagent in organic synthesis. The Sm-Barbier reaction is chosen to illustrate the synthetic importance and mechanistic role of two common additives: HMPA and Ni(II) in this reaction. The Sm-Barbier reaction is similar to the traditional Grignard reaction with the only difference being that the alkyl halide, carbonyl, and Sm reductant are mixed simultaneously in one pot.1,15 Examples of Sm-mediated Barbier reactions with a range of coupling partners have been reported,1,3,7,10,12 and have been utilized in key steps of the synthesis of large natural products.16,17 Previous studies on the effect of additives on SmI2 reactions have shown that HMPA enhances the reduction potential of SmI2 by coordinating to the samarium metal center, producing a more powerful,13-14,18 sterically encumbered reductant19-21 and in some cases playing an integral role in post electron-transfer steps facilitating subsequent bond-forming events.22 In the Sm-Barbier reaction, HMPA has been shown to additionally activate the alkyl halide by forming a complex in a pre-equilibrium step.23
Ni(II) salts are a catalytic additive used frequently in Sm-mediated transformations.24-27 Though critical for success, the mechanistic role of Ni(II) was not known in these reactions. Recently it has been shown that SmI2 reduces Ni(II) to Ni(0), and the reaction is then carried out through organometallic Ni(0) chemistry.28
These mechanistic studies highlight that although the same Barbier product is obtained, the use of different additives in the SmI2 reaction drastically alters the mechanistic pathway of the reaction. The protocol for running these SmI2-initiated reactions is described.

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

A straightforward procedure for the preparation of samarium diiodide (SmI2) in THF is described. The role of two main additives namely hexamethylphosphoramide (HMPA) and Ni(acac)2 in Sm mediated reactions is demonstrated in the Sm-Barbier reaction.

二ヨウ化サマリウム（SMIの調製および使用<sub&gt; 2</sub&gt;）有機合成における：サマリウムバルビエ反応におけるHMPAとNi（II）塩の力学的役割

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

化学

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

DNAグリコシラーゼ活性の定常状態、プレ定常状態、およびシングルターンオーバー速度論的測定

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

蛍光ベースの氷面アフィニティーによる不凍タンパク質の氷結合平面の決定

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

妊娠中にラット肝組織中の脂肪酸の組成変化を分析するために、ガスクロマトグラフィーの使用

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

プロ蛍光基質アナログを経由してPAD4活性の蛍光ベースの監視

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Preparation and Use of Carbonyl-decorated Carbenes in the Activation of White Phosphorus

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures in multi-gram scale quantities. The goal of this manuscript is to clearly detail how to handle and prepare these unique carbenes such that a synthetic chemist of any skill level can work with them. The two carbenes described are a diamidocarbene (DAC, carbene 1) and a monoamidoaminocarbene (MAAC 2). These carbenes are highly electron-deficient and as such display reactivity profiles that are atypical of more traditional N-heterocyclic carbenes. Additionally, these two carbenes only differ in their electrophilic character and not their steric parameters, making them ideal for studying how carbene electronics influence reactivity. To demonstrate this phenomenon, we are also describing the activation of white phosphorus (P4) using these carbenes. Depending on the carbene used, two very different phosphorus-containing compounds can be isolated. When the DAC 1 is used, a tris(phosphaalkenyl)phosphane can be isolated as the exclusive product. Remarkably however, when MAAC 2 is added to P4 under identical reaction conditions, an unexpected carbene-supported P8&#160;allotrope of phosphorus is isolated exclusively. Mechanistic studies demonstrate that this carbene-supported P8allotrope forms via a [2+2] cycloaddition dimerization of a transient diphosphene which has been trapped by treatment with 2,3-dimethyl-1,3-butadiene.

Here, we present a protocol for the synthesis of two carbonyl-decorated carbenes. The protocol makes these interesting compounds readily available to chemists of all skill levels. In addition to the synthesis of these two carbenes, their use in the activation of white phosphorus is also described.

白リンの活性化カルボニル装飾カルベンの調製および使用

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET radiopharmaceuticals. Due to their multi-day biological half-life, antibodies must be labeled with positron-emitting radionuclides with relatively long physical decay half-lives. Traditionally, the positron-emitting isotopes 124I (t1/2 = 4.18 d), 86Y (t1/2 = 14.7 hr), and 64Cu (t1/2 = 12.7 hr) have been used to label antibodies for PET imaging. More recently, however, the field has witnessed a dramatic increase in the use of the positron-emitting radiometal 89Zr in antibody-based PET imaging agents. 89Zr is a nearly ideal radioisotope for PET imaging with immunoconjugates, as it possesses a physical half-life (t1/2 = 78.4 hr) that is compatible with the in vivo pharmacokinetics of antibodies and emits a relatively low energy positron that produces high resolution images. Furthermore, antibodies can be straightforwardly labeled with 89Zr using the siderophore-derived chelator desferrioxamine (DFO). In this protocol, the prostate-specific membrane antigen targeting antibody J591 will be used as a model system to illustrate (1) the bioconjugation of the bifunctional chelator DFO-isothiocyanate to an antibody, (2) the radiosynthesis and purification of a 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate, and (3) in vivo PET imaging with an 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in a murine model of cancer.

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

バイオコンジュゲーションとのアルタン<sup&gt; 89</sup&gt;のZr-DFO標識抗体

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass spectrometer, it is necessary to characterize and understand the physical principles of the source. Most commercial ambient ionization sources utilize jets of nitrogen, helium, or atmospheric air to facilitate the ionization of the analyte. As a consequence, schlieren photography can be used to visualize the gas streams by exploiting the differences in refractive index between the streams and ambient air for visualization in real time. The basic setup requires a camera, mirror, flashlight, and razor blade. When properly configured, a real time image of the source is observed by watching its reflection. This allows for insight into the mechanism of action in the source, and pathways to its optimization can be elucidated. Light is shed on an otherwise invisible situation.

This paper presents a protocol for the visualization of gaseous streams of an ambient ionization source using schlieren photography and mass spectrometry.

シュリーレン写真の使用とアンビエント質量分析の可視化

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

使用した金ナノ粒子の効率的な放射性標識のために最適化されたプロトコル<sup&gt; 125</sup&gt; I標識アジド補綴グループ

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

の調製と評価<sup&gt; 99メートル</sup&gt; Tc標識三座キレートバイオ直交化学反応を用いて事前ターゲティングするため

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...