著者は役立つ会話教授トーマス·ライナー、博士ヤコブホートン、博士セルジュLyaschenkoに感謝。

記載のin vivo動物実験のすべてが承認されたプロトコルとメモリアルスローンケタリングがんセンター施設内動物管理使用委員会（IACUC）の倫理指針の下で実施した。 DFO-NCSの1抱合J591へ<ol><li> 1.7ミリリットルのマイクロ遠心管中で、1×リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）中、0.5 M HEPES緩衝液（pH7.4）のいずれか1ml中J591 2-5 mg / mlの溶液を調製する。 </li><li> 5-10ミリ（3.8から7.6 mg / ml）での濃度で乾燥DMSOにDFO-NCSを溶かす。超音波処理または完全な溶解を容易にするために、溶液を十分にボルテックスする。 </li><li> 0.1 MのNa 2 CO 3の少量のアリコート（&lt;10μl）を添加することにより、8.8から9.0へのJ591溶液のpHを調整します。 </li><li>抗体溶液は、適切なpHであると、二官能性キレート剤の3-4倍のモル過剰に相当DFO-NCS溶液の容量を追加する。 <ol><li>試験を受験するPLE、2 mg / mlのJ591抗体溶液（13.3ナノモルJ591）の1ミリリットルに10ミリ（7.6 mg / ml）でDFO-NCS溶液（40.4 nmolのDFO-NCS）の4-5μlを添加する。最終水性反応混合物中のDMSOの量は2％v / vのを超えてはならない。 </li></ol></li><li> 350 rpmで攪拌​​し、加熱ブロック上で37℃で30分間、反応をインキュベートする。 </li><li> 37°Cで1時間後、溶出液として0.5 M HEPES緩衝液（pH7.4）を使用して、分子量50,000カットオフを有する予め充填使い捨てサイズ排除脱塩カラムを使用して得られた免疫複合体を精製する。このステップでは、完成したJ591-DFOコンストラクトの2ミリリットルソリューションが得られます。 </li><li>紫外可視分光光度計で構築J591-DFOの濃度を測定します。 </li><li>構築物のより高い濃度が望まれる場合は50,000分子量カットオフ遠心フィルターユニットを用いてJ591-DFO液を濃縮する。 </li><li>暗闇の中で-20℃で完成したJ591-DFOの免疫複合体の溶液を保管してください。 </ol> 89のZr 2.放射性標識J591-DFO 注意：プロトコルのこのステップでは、放射能の取り扱いと操作を含む。これらの手順を実行するか、放射能の研究者と他の作業を行う前に、自宅の機関の放射線安全課に相談してください。すべての可能なステップは、電離放射線への暴露を最小限に抑えるよう注意が必要です。 注：適切な放射化学ノート保持性のために、試料中の放射能の量は、投与量較正器を用いて測定されるべきであると前に、以下のプロトコルのステップ2.2から2.13の後に記録された。これは放射化学収率および具体的な活動の正確な決定に役立ちます。 <ol><li> 0.5 M HEPES緩衝液、pH7.5の200μlのJ591-DFOの0.5-2.0ミリグラムの溶液を調製する。 </li><li>の音量をピペット&lt;SUP&gt; 89のZr 4+ストック溶液（典型的には1.0 Mのシュウ酸で供給される）2ミリリットルプラスチック製スクリューキャップマイクロ遠心チューブに1.0から6.0 mCiの（37から222 MBqの）に対応する。 1.0Mのシュウ酸を用いて合計300μlにこの溶液の体積を調整します。 </li><li> 1.0 MのNa 2 CO 3を使用して、6.8から7.5への89のZr 4+溶液のpHを調整します。ソリューション4+ 89のZrに1.0 MのNa 2 CO 3250μlのを追加することから始め、その後、所望のpHを達成するためにベースの小さい（&lt;10μl）をアリコートを追加します。 </li><li>ステップ2.1で作成J591-DFO溶液にpH調整した89のZr 4+溶液の所望の量を追加します。 </li><li>それは6.8〜の所望の範囲内にあることを確実にするために、放射性標識化反応混合物のpHをチェックする。 </li><li> 350 rpmで攪拌​​し、加熱ブロック上に室温で60分間の放射標識反応をインキュベートする。 </li><li>インキュベーションの60分後に、ラジアン測定放射性TLCを用いて反応の収率をiolabeling。 <ol><li>この目的のために、シリカ含浸TLCストリップ上に放射標識反応混合物を1μCiのスポット。 50 mMのDTPA（pHは5.5）の溶離液を使用して、TLCを実行し、アリコートを乾燥させると放射性TLCスキャナーを使用してTLCストリップを分析する。89のZr 4+、原点に表示されますJ591-DFOコンストラクトに結合している（R F &lt;0.1）、Zrの89自由しばらく4+陽イオンはDTPAによってキレート化され、溶媒の先端（R fに溶出することになる&gt; 0.9）。 </li><li> 、ラジオクロマトグラムを統合する曲線下の総面積で0.0から0.1 F Rから曲線下面積を分割して、100を掛けることにより反応の放射性標識収量を計算します。 </li></ol></li><li>放射能標識収率は十分（通常は&gt; 2のmCi / mgでの理論的な比活性）である場合、50 mMのDTPA、pH5.5で5μlので反応をクエンチした。 </li><li>生じた免疫複合体のUSIを精製ngの5 mg / mlのゲンチシン酸5mg / mlのゲンチシン酸又は0.25 M酢酸ナトリウム（pH5.5）中0.9％滅菌生理食塩水のいずれかの溶離液を使用して分子量50,000カットオフを有する予め充填された使い捨てのサイズ排除脱塩カラム。このステップでは、完成した89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体の2ミリリットルソリューションが得られます。 </li><li>ステップ2.7で説明したように精製した後、放射性TLCを用いて、89のZr-DFO-J591の放射化学的純度を確認する。 </li><li>最初に精製された89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体を用いて単離した放射能の量によって抗体溶液に加え活動量を分割することによって反応の全体的な放射性標識の収量を計算します。 </li><li>放射標識反応におけるDFO-J591の初期質量によって精製89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体を用いて分離活性量で除して、最終的な比活性を計算します。 </li><li>より高い濃度が望まれる場合、第集中分子量50,000カットオフ遠心フィルターユニットを使用して電子89のZr-DFO-J591溶液。 注：最終精製工程で使用ゲンチシン酸は放射線分解に起因する抗体の分解を最小限にするために用いられる放射性保護で46ながら4℃で最大48時間、89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体の貯蔵。ことが可能であり、これはお勧めしません。放射性免疫複合体を保存する場合には、次亜塩素酸塩媒介性放射線分解のリスクを最小限にするために、保存緩衝液として5 mg / mlのゲンチシン酸を0.25 M酢酸ナトリウム（pHは5.5）を使用する。47 </li></ol> 89のZr-DFO-J591によるインビボ PETイメージング3. 注意：プロトコル2節と同様に、プロトコルのこのステップでは、放射能の取り扱いと操作を含む。これらの手順を実行する前に研究者は、自宅の機関の放射線安全課に相談してください。すべてのpossibルステップは、電離放射線への暴露を最小限に抑えるように注意すべきである。 <ol><li>オスの無胸腺ヌードマウスでは、皮下インプラント5×10 6のLNCaP前立腺癌細胞と、これらは100〜150ミリメートル3異種移植片（接種後3〜4週間）に成長することができます。44 </li><li> 0.9％滅菌生理食塩水で1.0 mCiの/ mlの濃度になるように89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体を希釈する。 </li><li>異種移植片担持マウスの外側尾静脈に48; 89のZr-DFO-J591溶液（7.4 MBqの200μCiの）200μlを注入する。 </li><li>酸素ガス混合物：所望の撮影時点（ 例えば、12、24、48、72、96、または120時間後に注射）で、2％イソフルランでマウスを麻酔。 </li><li>小動物PETスキャナーのベッドの上にマウスを置き、1％イソフルラン使用して、スキャン中に麻酔を維持：酸素ガス混合物を。スキャナベッドの上で動物を配置する前に、つま先ピンチ方式とAPPLを使用して麻酔を検証麻酔中の乾燥を防ぐために、マウスの目にyの眼軟膏。49 </li><li> 350〜700 keVのエネルギーウィンドウと6ナノ秒の一致タイミングウィンドウを使用して4000万一致するイベントの最小限の静的スキャンを経由して、マウス用のPETデータを取得する。50 </li><li>画像の取得を完了した後、無人のマウスを残していないし、それが意識を取り戻したまで他のマウスとケージに入れないでください。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

89のZr-DFO-表示のある放射性免疫複合体の建設、放射性標識、およびイメージングは、一般的に、むしろ簡単な手順ですが、それはプロセスの各ステップの間に念頭に置いて、いくつかの重要な考慮事項を維持することが重要である。例えば、おそらく手続きの共役工程中の懸念の原因として最も可能性が高い結合反応中の抗体の集合体である。この問題は、ほとんどの場合、DFO-NCSス...

それらの著しい感度、親和性、及び選択性は、抗体は、長い癌細胞への放射性同位体を送達するためのベクターとして有望と考えられてきた。しかしながら、陽電子放出断層撮影（PET）イメージングへの応用は、それらの標識に適した陽電子放出放射性同位体の欠如によって妨げられてきた。放射性免疫複合体の設計において最も重要な考慮事項1-3 One物理減衰に一致さ半二重抗体のin vivoでの薬物動態への放射性同位元素の生活。より具体的には、抗体は、しばしば、比較的長い、複数日の生物学的半減期を有し、従って、同等の物理的半減期を有する放射性同位体で標識されなければならない。 PETイメージング用途のために、抗体は、伝統的に64のCu（トン1/2 = 12.7時間）、86 Y（tの1/2 = 14.7時間）、または124 I（t 1/2は= 4.18 d）の放射性標識されている。4、 5しかし、それぞれのこれらの放射性同位元素は、臨床イメージングのための適性を妨げる重大な限界を有している。 86 Y及び64 Cuで標識された放射性免疫複合体は、前臨床研究において有望であることが証明されているが、両方の同位体は、ヒトでのイメージングのために有効であるには余りにも短い物理的半減期を有する。124 I、対照的に、のためのほぼ理想的な物理的半減期を有する抗体を用いたイメージングが、それは高価であり、比較的低解像度の臨床画像につながる次善の減衰特性を有している。さらに、124 I-標識放射性免疫複合体は、 インビボでの腫瘍対バックグラウンド活性比を低下させることができるプロセスを脱ハロゲン化の対象となることができる。6,7 64のCuに取って代わる陽電子放出放射性同位元素、86 Yを見つけるために、ドライブ、および放射性免疫複合体中の124 Iは89 Zrの標識抗体の研究の最近の急増に燃料を供給しています。8-12 T89 Zrの出現のために彼の理由は簡単である：放射性診断のPET放射性免疫複合体において使用するためのほぼ理想的な化学的および物理的特性を有している13 89 Zrは89 Y た（p、n）を用いてサイクロトロンでの89 Zrの反応を介して生成される。市販の100％天然に豊富な89 Yターゲット。14,15放射性金属は、23％の陽電子収率が78.4時間の半減期で崩壊し、395.5 keVの（ 図1）の比較的低いエネルギーで陽電子を放出する。 13,16,17これは、89 Zrは、高エネルギーを放出することに留意することが重要で、909 keVのγ線99％の効率を有する。この発光は放出される511keVの光子を精力的に干渉しないが、それは、輸送、取り扱い、および線量測定に関して余分な配慮を必要としません。この警告にもかかわらず、これらの減衰特性は、最終的に89 Zrをより良好な時間を持っていないだけであることを意味Cuの86 Yおよび64より抗体によるイメージングのためのアルフ寿命もより高い687と975 keVのエネルギーの同様の100-150 keVの内のエネルギーを有する光子の数と陽電子を放出する、124 Iよりも高い解像度の画像を生成することができる511keVの陽電子が作成した光子は。13また、89 Zrがまた製造するのに安価で、取扱いが安全で、より効果的に放射性ヨウ素の対応物よりも腫瘍においてresidualizes。89 Zrの18,19つの潜在的な制限は、それが持っていないということです治療アイソトポマー、 例えば 、86 Y（PET）対90 Y（療法）。これは、それらの治療の対応のための線量測定スカウトとして用いることができる化学的に同一の、サロゲート造影剤の構築を妨げる。とはいえ、調査は89 Zrの標識抗体が90 Y軸、177呂標識免疫複合体のためのイメージング·サロゲートとしての可能性を持っていることを示唆している。20,21 化学的な観点からは、第IV族金属として、89 Zrが水溶液中で4カチオンとして存在する。のZr 4+イオンが高度に、比較的大きな（有効イオン半径= 0.84オングストローム）で充電され、「ハード」カチオンとして分類することができる。このように、ハードディスク8、アニオン性酸素ドナーまで軸受リガンドに対する選好を示す。簡単に89 Zrの標識放射性免疫複合体で使用される最も一般的なキレート剤は、デスフェリオキサミン（DFO）、3ヒドロキ基を有するシデロフォア由来の、非環式キレート剤である。リガンドは、安定的に生物学的に関連するpHレベルでRTで迅速かつクリーンジルコニウム4+カチオンを調整し、得られたジルコニウム-DFO複合体は、生理食塩水、血清、全血における複数日にわたって安定なままである22計算の研究が強く示唆DFOは、金属中心三NEUTに配位しているのZr 4+を有する配位錯体を形成すること然とリガンドの三アニオン性酸素ドナーならびに2つの外因性の水のリガンド （ 図2）。23,24 89のZr-DFO抱合足場を採用した放射性免疫複合体のin vivoでの挙動は、一般的に優れたています。しかし、いくつかのケースでは、イメージングおよび急性生体内分布の研究は89 Zrの標識抗体を注射したマウスの骨において高活性レベルを明らかにし、データosteophilic 89のZr 4+イオンがインビボでキレート剤から放出され、その後、無機化されていることを示唆している骨に。8酸素ドナーが文献に登場していると25は最近、小説89のZr 4+キレート剤の開発の調査の数は特に、現在では、それにもかかわらず、24,26,27。リガンドDFOは、最も広く採用さキレート剤である大差で89 Zrの標識放射性免疫複合体で。異なるさまざまな生物結合戦略は、チオール反応性DFOの反応は抗体中のシステインを構築し、活性化エステル有利子DFOの反応は、抗体中のリジンを構築し、バイオ直交クリックケミストリーを含む、抗体にDFOを取り付けるために使用されてきた。4,28- 30は簡単に、最も一般的な戦略、しかし、DFO、DFO-NCS（ 図2）のイソチオシアネート-ベアリング誘導体の使用であった。22この市販の二官能性キレート剤は、堅牢かつ確実のリジンとの安定した、共有結合チオ尿素結合を形成し、抗体（ 図3）。 過去数年にわたり、89のZr-DFO標識放射性免疫複合体の多種多様な文献に報告されている。前臨床研究は、そのようなCD105を標的とするTとセツキシマブ、ベバシズマブ、およびトラスツズマブより難解な抗体に、よりよく知られているに至るまで抗体をフィーチャーし、特に豊富だったRC105とfPSAのターゲティング5A10は30-36より最近では、89のZr-DFO標識抗体を使用して初期段階の臨床試験の少数が文献に登場した。具体的には、オランダのグループは、89のZr-DFO-cmAb U36、89のZr-DFO-イブリツモマブチウキセタン、及び89のZr-DFO-トラスツズマブを用いた試験を公開している。加えて、21,32,37、89と他の臨床試験の範囲Zrの標識放射性免疫複合体は、前立腺癌のイメージングおよび乳癌イメージングのためのHER2を標的とする89のZr-DFO-トラスツズマブPSMAを標的と89のZr-DFO-J591を使用して、ここでメモリアルスローンケタリングがんセンターの調査を含め、現在進行中である。23、放射性標識された抗体は、最も一般的な89のZrで標識した放射性医薬品のままさらに30、放射性もますますペプチド、タンパク質、ナノ材料を含む他のベクターに用いられてきた。38-43 </sup&gt; この89のZr-DFOラベリング方法論のモジュール性は途方もない資産である。バイオマーカーを標的とする抗体のレパートリーは、拡大を続けるであり、これらの構築物を用いて、生体 PETイメージングで行う際の関心はたちまち成長しています。その結果、我々はより標準化された実践とプロトコルの開発は、フィールドを利益を得ることができると信じています。 DFO-NCSの共役と89のZr放射性標識のための優れた書かれた実験プロトコルは、すでにら Vosjan、によって出版されました。22私たちは、この仕事が提供する視覚的なデモはさらにこれらの技術に新しい研究者を助けることができると感じています。手元プロトコルでは、前立腺特異的膜抗原のターゲティング抗体J591は、例示するためのモデル系として使用される（1）は、抗体へのDFO -イソチオシアネート、二官能性キレート剤のバイオコンジュゲーション、89（2）放射合成及び精製ZR-DFO-のmAb放射性免疫複合体、（3）癌のマウスモデルにおける89のZr-DFO-のmAb放射性免疫複合体によるインビボ PETイメージング。23,44,45

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="676">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:217px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:99px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-SCN-Bn-DFO</td>
			<td>Macrocyclics</td>
			<td>B-705</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">[89Zr]Zr-oxalate</td>
			<td>Various, including Perkin-Elmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Caution: Radioactive material</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PD-10 Desalting Columns</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0851-01&#160;</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC805024</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica Gel Impregnanted RadioTLC Paper</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SGI0001</td>
			<td>Cut into strips 0.5 cm wide</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

例外的な親和性、特異性、および抗体の選択性は、それらの腫瘍標的PET放射性医薬品のための非常に魅力的なベクトルを作る。それらの複数日生物学的半減期に、抗体は、比較的長い物理的な崩壊の半減期を持つ陽電子放出放射性核種で標識されなければならない。伝統的に、陽電子放出同位体124 I（T 1/2 = 4.18 D）、86 Y（T 1/2 = 14.7時間）、および64のCu（T 1/2 = 12.7時間）がための抗体を標識するために使用されてきたPETイメージング。しかし、最近では、フィールドは、抗体ベースのPETイメージング剤における陽電子放出放射性金属89 Zrの使用の劇的な増加を目撃した。それは物理的な半分を所有として89 Zrは、免疫複合体のPETイメージングのためのほぼ理想的な放射性同位体である抗体のインビボ薬物動態と互換性があり、比較的低いエンを発する-Life（T 1/2 = 78.4時間）高解像度の画像を生成するRGY陽電子。さらに、抗体は、直接にシデロフォア由来のキレート剤デスフェリオキサミン（DFO）を使用して、89 Zrを用いて標識することができる。このプロトコルでは、前立腺特異的膜抗原のターゲティング抗体J591は、例示するためのモデル系として使用される（1）抗体、（2）放射性合成および89 Zr-の精製-イソチオシアネートDFO二官能性キレート剤のバイオコンジュゲーションDFO-mAbでの放射性免疫複合体、および癌のマウスモデルにおける89のZr-DFO-mAbでの放射性免疫複合体（3） のインビボ PETイメージング。

抗体にこのプロトコルの最初のステップDFO-NCSの結合は、一般的に非常に堅牢で信頼性の高いです。一般的に、精製され、キレート剤で修飾された免疫複合体は、&gt; 90％の収率で得ることができ、初期結合反応にDFO-NCSの3モル当量を使用する度標識約1.0~1.5 DFOのキレート剤が得られる/モノクローナル抗体。手順の89 Zrの放射性標識および精製工程も同様に簡単です。上記のプロトコル?...

Watch this Scientific Journal Video about The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies at JoVE.com

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

バイオコンジュゲーションとのアルタン<sup&gt; 89</sup&gt;のZr-DFO標識抗体

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

the-bioconjugation-and-radiosynthesis-of-89zr-dfo-labeled-antibodies

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Chemistry

Unit 1

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Fundamentals of Chemistry

SCIENTISTS IN ACTION

17.0K ビュー.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

ビデオ: The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Origami Inspired Self-assembly of Patterned and Reconfigurable Particles

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two dimensional (2D) structures. These technologies are mature, offer high precision and many of them can be implemented in a high-throughput manner. We leverage the advantages of planar lithography and combine them with self-folding methods1-20 wherein physical forces derived from surface tension or residual stress, are used to curve or fold planar structures into three dimensional (3D) structures. In doing so, we make it possible to mass produce precisely patterned static and reconfigurable particles that are challenging to synthesize.
In this paper, we detail visualized experimental protocols to create patterned particles, notably, (a) permanently bonded, hollow, polyhedra that self-assemble and self-seal due to the minimization of surface energy of liquefied hinges21-23 and (b) grippers that self-fold due to residual stress powered hinges24,25. The specific protocol described can be used to create particles with overall sizes ranging from the micrometer to the centimeter length scales. Further, arbitrary patterns can be defined on the surfaces of the particles of importance in colloidal science, electronics, optics and medicine. More generally, the concept of self-assembling mechanically rigid particles with self-sealing hinges is applicable, with some process modifications, to the creation of particles at even smaller, 100 nm length scales22, 26 and with a range of materials including metals21, semiconductors9 and polymers27. With respect to residual stress powered actuation of reconfigurable grasping devices, our specific protocol utilizes chromium hinges of relevance to devices with sizes ranging from 100 &mu;m to 2.5 mm. However, more generally, the concept of such tether-free residual stress powered actuation can be used with alternate high-stress materials such as heteroepitaxially deposited semiconductor films5,7 to possibly create even smaller nanoscale grasping devices.

We describe experimental details of the synthesis of patterned and reconfigurable particles from two dimensional (2D) precursors. This methodology can be used to create particles in a variety of shapes including polyhedra and grasping devices at length scales ranging from the micro to centimeter scale.

折り紙インスパイアパターン化され、再構成可能な粒子の自己組織化

There are numerous techniques such as photolithography, electron-beam lithography and soft-lithography that can be used to precisely pattern two ...

化学

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and cleaves intracellular proteins that are essential for neurotransmitter release. BoNT is comprised of a heavy chain (HC), which mediates host cell binding and internalization, and a light chain (LC), which cleaves intracellular host proteins essential for acetylcholine release. While therapies that inhibit toxin binding/internalization have a small time window of administration, compounds that target intracellular LC activity have a much larger time window of administrations, particularly relevant given the extremely long half-life of the toxin. In recent years, small molecules have been heavily analyzed as potential LC inhibitors based on their increased cellular permeability relative to larger therapeutics (peptides, aptamers, etc.). Lead identification often involves high-throughput screening (HTS), where large libraries of small molecules are screened based on their ability to modulate therapeutic target function. Here we describe a FRET-based assay with a commercial BoNT/A LC substrate and recombinant LC that can be automated for HTS of potential BoNT inhibitors. Moreover, we describe a manual technique that can be used for follow-up secondary screening, or for comparing the potency of several candidate compounds.

The botulinum neurotoxin type A light chain (BoNT/A LC) is a metalloprotease that enters motor neurons, cleaves its substrate SNAP-25, and disrupts neurotransmission, thereby resulting in flaccid paralysis. Utilizing a high-throughput-compatible FRET-based assay, large libraries of small molecules can be screened for their impact on BoNT/A LC enzymatic activity.

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

短いペプチドの自己組織化によって順序付け生体分子構造の形成

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Split-and-pool Synthesis and Characterization of Peptide Tertiary Amide Library

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid phase by using combinatorial chemistry. One of the most well studied classes of peptidomimetics is peptoids. Peptoids are easy to synthesize and have been shown to be proteolysis-resistant and cell-permeable. Over the past decade, many useful protein ligands have been identified through screening of peptoid libraries. However, most of the ligands identified from peptoid libraries do not display high affinity, with rare exceptions. This may be due, in part, to the lack of chiral centers and conformational constraints in peptoid molecules. Recently, we described a new synthetic route to access peptide tertiary amides (PTAs). PTAs are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. With side chains on both &#945;-carbon and main chain nitrogen atoms, the conformation of these molecules are greatly constrained by sterical hindrance and allylic 1,3 strain. (Figure 1) Our study suggests that these PTA molecules are highly structured in solution and can be used to identify protein ligands. We believe that these molecules can be a future source of high-affinity protein ligands. Here we describe the synthetic method combining the power of both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a sample one-bead one-compound (OBOC) library of PTAs.

Peptide tertiary amides (PTAs) are a superfamily of peptidomimetics that include but are not limited to peptides, peptoids and N-methylated peptides. Here we describe a synthetic method which combines&#160;both split-and-pool and sub-monomer strategies to synthesize a one-bead one-compound library of PTAs.

ペプチド第三級アミドライブラリのスプリット·アンド·プールの合成とキャラクタリゼーション

Peptidomimetics are great sources of protein ligands. The oligomeric nature of these compounds enables us to access large synthetic libraries on solid ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

タンパク質のバイオコンジュゲートの合成<em&gt;経由で</em&gt;システイン - マレイミドケミストリー

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

単一分子力分光法を用いて無機材料とアミノ酸とペプチドの相互作用への洞察

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential nutrients. The objective of this work is to demonstrate the qualitative and quantitative analysis of encapsulated fish oil supplements using high-resolution 1H and 13C NMR spectroscopy utilizing two different NMR instruments; a 500 MHz and an 850 MHz instrument. Both proton (1H) and carbon (13C) NMR spectra can be used for the quantitative determination of the major constituents of fish oil supplements. Quantification of the lipids in fish oil supplements is achieved through integration of the appropriate NMR signals in the relevant 1D spectra. Results obtained by 1H and 13C NMR are in good agreement with each other, despite the difference in resolution and sensitivity between the two nuclei and the two instruments. 1H NMR offers a more rapid analysis compared to 13C NMR, as the spectrum can be recorded in less than 1 min, in contrast to 13C NMR analysis, which lasts from 10 min to one hour. The 13C NMR spectrum, however, is much more informative. It can provide quantitative data for a greater number of individual fatty acids and can be used for determining the positional distribution of fatty acids on the glycerol backbone. Both nuclei can provide quantitative information in just one experiment without the need of purification or separation steps. The strength of the magnetic field mostly affects the 1H NMR spectra due to its lower resolution with respect to 13C NMR, however, even lower cost NMR instruments can be efficiently applied as a standard method by the food industry and quality control laboratories.

Here, high-resolution 1H and 13C Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy was used as a rapid and reliable tool for quantitative and qualitative analysis of encapsulated fish oil supplements.

魚油サプリメントの脂質プロファイルの迅速な評価のための強力なツールとしてNMR分光法

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have been thought of as a type of molecular information storage. Mass spectrometry analysis has been considered the method of choice for sequencing peptoids. Peptoids can be synthesized via solid phase chemistry using a repeating two-step reaction cycle. Here we present a method to manually synthesize oligo-peptoids and to analyze the sequence of the peptoids using tandem mass spectrometry (MS/MS) techniques. The sample peptoid is a nonamer consisting of alternating N-(2-methyloxyethyl)glycine (Nme) and N-(2-phenylethyl)glycine (Npe), as well as an N-(2-aminoethyl)glycine (Nae) at the N-terminus. The sequence formula of the peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, where Ac is the acetyl group. The synthesis takes place in a commercially available solid-phase reaction vessel. The rink amide resin is used as the solid support to yield the peptoid with an amide group at the C-terminus. The resulting peptoid product is subjected to sequence analysis using a triple-quadrupole mass spectrometer coupled to an electrospray ionization source. The MS/MS measurement produces a spectrum of fragment ions resulting from the dissociation of charged peptoid. The fragment ions are sorted out based on the values of their mass-to-charge ratio (m/z). The m/z values of the fragment ions are compared against the nominal masses of theoretically predicted fragment ions, according to the scheme of peptoid fragmentation. The analysis generates a fragmentation pattern of the charged peptoid. The fragmentation pattern is correlated to the monomer sequence of the neutral peptoid. In this regard, MS analysis reads out the sequence information of the peptoids.

A protocol is described for the manual synthesis of oligo-peptoids followed by sequence analysis by mass spectrometry.

合成とオリゴ ペプチドの質量分析

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...