Name: the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies
Uploaded: 2015-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
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著者は役立つ会話教授トーマス·ライナー、博士ヤコブホートン、博士セルジュLyaschenkoに感謝。

記載のin vivo動物実験のすべてが承認されたプロトコルとメモリアルスローンケタリングがんセンター施設内動物管理使用委員会（IACUC）の倫理指針の下で実施した。 DFO-NCSの1抱合J591へ<ol><li> 1.7ミリリットルのマイクロ遠心管中で、1×リン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）中、0.5 M HEPES緩衝液（pH7.4）のいずれか1ml中J591 2-5 mg / mlの溶液を調製する。 </li><li> 5-10ミリ（3.8から7.6 mg / ml）での濃度で乾燥DMSOにDFO-NCSを溶かす。超音波処理または完全な溶解を容易にするために、溶液を十分にボルテックスする。 </li><li> 0.1 MのNa 2 CO 3の少量のアリコート（&lt;10μl）を添加することにより、8.8から9.0へのJ591溶液のpHを調整します。 </li><li>抗体溶液は、適切なpHであると、二官能性キレート剤の3-4倍のモル過剰に相当DFO-NCS溶液の容量を追加する。 <ol><li>試験を受験するPLE、2 mg / mlのJ591抗体溶液（13.3ナノモルJ591）の1ミリリットルに10ミリ（7.6 mg / ml）でDFO-NCS溶液（40.4 nmolのDFO-NCS）の4-5μlを添加する。最終水性反応混合物中のDMSOの量は2％v / vのを超えてはならない。 </li></ol></li><li> 350 rpmで攪拌​​し、加熱ブロック上で37℃で30分間、反応をインキュベートする。 </li><li> 37°Cで1時間後、溶出液として0.5 M HEPES緩衝液（pH7.4）を使用して、分子量50,000カットオフを有する予め充填使い捨てサイズ排除脱塩カラムを使用して得られた免疫複合体を精製する。このステップでは、完成したJ591-DFOコンストラクトの2ミリリットルソリューションが得られます。 </li><li>紫外可視分光光度計で構築J591-DFOの濃度を測定します。 </li><li>構築物のより高い濃度が望まれる場合は50,000分子量カットオフ遠心フィルターユニットを用いてJ591-DFO液を濃縮する。 </li><li>暗闇の中で-20℃で完成したJ591-DFOの免疫複合体の溶液を保管してください。 </ol> 89のZr 2.放射性標識J591-DFO 注意：プロトコルのこのステップでは、放射能の取り扱いと操作を含む。これらの手順を実行するか、放射能の研究者と他の作業を行う前に、自宅の機関の放射線安全課に相談してください。すべての可能なステップは、電離放射線への暴露を最小限に抑えるよう注意が必要です。 注：適切な放射化学ノート保持性のために、試料中の放射能の量は、投与量較正器を用いて測定されるべきであると前に、以下のプロトコルのステップ2.2から2.13の後に記録された。これは放射化学収率および具体的な活動の正確な決定に役立ちます。 <ol><li> 0.5 M HEPES緩衝液、pH7.5の200μlのJ591-DFOの0.5-2.0ミリグラムの溶液を調製する。 </li><li>の音量をピペット&lt;SUP&gt; 89のZr 4+ストック溶液（典型的には1.0 Mのシュウ酸で供給される）2ミリリットルプラスチック製スクリューキャップマイクロ遠心チューブに1.0から6.0 mCiの（37から222 MBqの）に対応する。 1.0Mのシュウ酸を用いて合計300μlにこの溶液の体積を調整します。 </li><li> 1.0 MのNa 2 CO 3を使用して、6.8から7.5への89のZr 4+溶液のpHを調整します。ソリューション4+ 89のZrに1.0 MのNa 2 CO 3250μlのを追加することから始め、その後、所望のpHを達成するためにベースの小さい（&lt;10μl）をアリコートを追加します。 </li><li>ステップ2.1で作成J591-DFO溶液にpH調整した89のZr 4+溶液の所望の量を追加します。 </li><li>それは6.8〜の所望の範囲内にあることを確実にするために、放射性標識化反応混合物のpHをチェックする。 </li><li> 350 rpmで攪拌​​し、加熱ブロック上に室温で60分間の放射標識反応をインキュベートする。 </li><li>インキュベーションの60分後に、ラジアン測定放射性TLCを用いて反応の収率をiolabeling。 <ol><li>この目的のために、シリカ含浸TLCストリップ上に放射標識反応混合物を1μCiのスポット。 50 mMのDTPA（pHは5.5）の溶離液を使用して、TLCを実行し、アリコートを乾燥させると放射性TLCスキャナーを使用してTLCストリップを分析する。89のZr 4+、原点に表示されますJ591-DFOコンストラクトに結合している（R F &lt;0.1）、Zrの89自由しばらく4+陽イオンはDTPAによってキレート化され、溶媒の先端（R fに溶出することになる&gt; 0.9）。 </li><li> 、ラジオクロマトグラムを統合する曲線下の総面積で0.0から0.1 F Rから曲線下面積を分割して、100を掛けることにより反応の放射性標識収量を計算します。 </li></ol></li><li>放射能標識収率は十分（通常は&gt; 2のmCi / mgでの理論的な比活性）である場合、50 mMのDTPA、pH5.5で5μlので反応をクエンチした。 </li><li>生じた免疫複合体のUSIを精製ngの5 mg / mlのゲンチシン酸5mg / mlのゲンチシン酸又は0.25 M酢酸ナトリウム（pH5.5）中0.9％滅菌生理食塩水のいずれかの溶離液を使用して分子量50,000カットオフを有する予め充填された使い捨てのサイズ排除脱塩カラム。このステップでは、完成した89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体の2ミリリットルソリューションが得られます。 </li><li>ステップ2.7で説明したように精製した後、放射性TLCを用いて、89のZr-DFO-J591の放射化学的純度を確認する。 </li><li>最初に精製された89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体を用いて単離した放射能の量によって抗体溶液に加え活動量を分割することによって反応の全体的な放射性標識の収量を計算します。 </li><li>放射標識反応におけるDFO-J591の初期質量によって精製89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体を用いて分離活性量で除して、最終的な比活性を計算します。 </li><li>より高い濃度が望まれる場合、第集中分子量50,000カットオフ遠心フィルターユニットを使用して電子89のZr-DFO-J591溶液。 注：最終精製工程で使用ゲンチシン酸は放射線分解に起因する抗体の分解を最小限にするために用いられる放射性保護で46ながら4℃で最大48時間、89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体の貯蔵。ことが可能であり、これはお勧めしません。放射性免疫複合体を保存する場合には、次亜塩素酸塩媒介性放射線分解のリスクを最小限にするために、保存緩衝液として5 mg / mlのゲンチシン酸を0.25 M酢酸ナトリウム（pHは5.5）を使用する。47 </li></ol> 89のZr-DFO-J591によるインビボ PETイメージング3. 注意：プロトコル2節と同様に、プロトコルのこのステップでは、放射能の取り扱いと操作を含む。これらの手順を実行する前に研究者は、自宅の機関の放射線安全課に相談してください。すべてのpossibルステップは、電離放射線への暴露を最小限に抑えるように注意すべきである。 <ol><li>オスの無胸腺ヌードマウスでは、皮下インプラント5×10 6のLNCaP前立腺癌細胞と、これらは100〜150ミリメートル3異種移植片（接種後3〜4週間）に成長することができます。44 </li><li> 0.9％滅菌生理食塩水で1.0 mCiの/ mlの濃度になるように89のZr-DFO-J591の放射性免疫複合体を希釈する。 </li><li>異種移植片担持マウスの外側尾静脈に48; 89のZr-DFO-J591溶液（7.4 MBqの200μCiの）200μlを注入する。 </li><li>酸素ガス混合物：所望の撮影時点（ 例えば、12、24、48、72、96、または120時間後に注射）で、2％イソフルランでマウスを麻酔。 </li><li>小動物PETスキャナーのベッドの上にマウスを置き、1％イソフルラン使用して、スキャン中に麻酔を維持：酸素ガス混合物を。スキャナベッドの上で動物を配置する前に、つま先ピンチ方式とAPPLを使用して麻酔を検証麻酔中の乾燥を防ぐために、マウスの目にyの眼軟膏。49 </li><li> 350〜700 keVのエネルギーウィンドウと6ナノ秒の一致タイミングウィンドウを使用して4000万一致するイベントの最小限の静的スキャンを経由して、マウス用のPETデータを取得する。50 </li><li>画像の取得を完了した後、無人のマウスを残していないし、それが意識を取り戻したまで他のマウスとケージに入れないでください。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

89のZr-DFO-表示のある放射性免疫複合体の建設、放射性標識、およびイメージングは、一般的に、むしろ簡単な手順ですが、それはプロセスの各ステップの間に念頭に置いて、いくつかの重要な考慮事項を維持することが重要である。例えば、おそらく手続きの共役工程中の懸念の原因として最も可能性が高い結合反応中の抗体の集合体である。この問題は、ほとんどの場合、DFO-NCSス...

それらの著しい感度、親和性、及び選択性は、抗体は、長い癌細胞への放射性同位体を送達するためのベクターとして有望と考えられてきた。しかしながら、陽電子放出断層撮影（PET）イメージングへの応用は、それらの標識に適した陽電子放出放射性同位体の欠如によって妨げられてきた。放射性免疫複合体の設計において最も重要な考慮事項1-3 One物理減衰に一致さ半二重抗体のin vivoでの薬物動態への放射性同位元素の生活。より具体的には、抗体は、しばしば、比較的長い、複数日の生物学的半減期を有し、従って、同等の物理的半減期を有する放射性同位体で標識されなければならない。 PETイメージング用途のために、抗体は、伝統的に64のCu（トン1/2 = 12.7時間）、86 Y（tの1/2 = 14.7時間）、または124 I（t 1/2は= 4.18 d）の放射性標識されている。4、 5しかし、それぞれのこれらの放射性同位元素は、臨床イメージングのための適性を妨げる重大な限界を有している。 86 Y及び64 Cuで標識された放射性免疫複合体は、前臨床研究において有望であることが証明されているが、両方の同位体は、ヒトでのイメージングのために有効であるには余りにも短い物理的半減期を有する。124 I、対照的に、のためのほぼ理想的な物理的半減期を有する抗体を用いたイメージングが、それは高価であり、比較的低解像度の臨床画像につながる次善の減衰特性を有している。さらに、124 I-標識放射性免疫複合体は、 インビボでの腫瘍対バックグラウンド活性比を低下させることができるプロセスを脱ハロゲン化の対象となることができる。6,7 64のCuに取って代わる陽電子放出放射性同位元素、86 Yを見つけるために、ドライブ、および放射性免疫複合体中の124 Iは89 Zrの標識抗体の研究の最近の急増に燃料を供給しています。8-12 T89 Zrの出現のために彼の理由は簡単である：放射性診断のPET放射性免疫複合体において使用するためのほぼ理想的な化学的および物理的特性を有している13 89 Zrは89 Y た（p、n）を用いてサイクロトロンでの89 Zrの反応を介して生成される。市販の100％天然に豊富な89 Yターゲット。14,15放射性金属は、23％の陽電子収率が78.4時間の半減期で崩壊し、395.5 keVの（ 図1）の比較的低いエネルギーで陽電子を放出する。 13,16,17これは、89 Zrは、高エネルギーを放出することに留意することが重要で、909 keVのγ線99％の効率を有する。この発光は放出される511keVの光子を精力的に干渉しないが、それは、輸送、取り扱い、および線量測定に関して余分な配慮を必要としません。この警告にもかかわらず、これらの減衰特性は、最終的に89 Zrをより良好な時間を持っていないだけであることを意味Cuの86 Yおよび64より抗体によるイメージングのためのアルフ寿命もより高い687と975 keVのエネルギーの同様の100-150 keVの内のエネルギーを有する光子の数と陽電子を放出する、124 Iよりも高い解像度の画像を生成することができる511keVの陽電子が作成した光子は。13また、89 Zrがまた製造するのに安価で、取扱いが安全で、より効果的に放射性ヨウ素の対応物よりも腫瘍においてresidualizes。89 Zrの18,19つの潜在的な制限は、それが持っていないということです治療アイソトポマー、 例えば 、86 Y（PET）対90 Y（療法）。これは、それらの治療の対応のための線量測定スカウトとして用いることができる化学的に同一の、サロゲート造影剤の構築を妨げる。とはいえ、調査は89 Zrの標識抗体が90 Y軸、177呂標識免疫複合体のためのイメージング·サロゲートとしての可能性を持っていることを示唆している。20,21 化学的な観点からは、第IV族金属として、89 Zrが水溶液中で4カチオンとして存在する。のZr 4+イオンが高度に、比較的大きな（有効イオン半径= 0.84オングストローム）で充電され、「ハード」カチオンとして分類することができる。このように、ハードディスク8、アニオン性酸素ドナーまで軸受リガンドに対する選好を示す。簡単に89 Zrの標識放射性免疫複合体で使用される最も一般的なキレート剤は、デスフェリオキサミン（DFO）、3ヒドロキ基を有するシデロフォア由来の、非環式キレート剤である。リガンドは、安定的に生物学的に関連するpHレベルでRTで迅速かつクリーンジルコニウム4+カチオンを調整し、得られたジルコニウム-DFO複合体は、生理食塩水、血清、全血における複数日にわたって安定なままである22計算の研究が強く示唆DFOは、金属中心三NEUTに配位しているのZr 4+を有する配位錯体を形成すること然とリガンドの三アニオン性酸素ドナーならびに2つの外因性の水のリガンド （ 図2）。23,24 89のZr-DFO抱合足場を採用した放射性免疫複合体のin vivoでの挙動は、一般的に優れたています。しかし、いくつかのケースでは、イメージングおよび急性生体内分布の研究は89 Zrの標識抗体を注射したマウスの骨において高活性レベルを明らかにし、データosteophilic 89のZr 4+イオンがインビボでキレート剤から放出され、その後、無機化されていることを示唆している骨に。8酸素ドナーが文献に登場していると25は最近、小説89のZr 4+キレート剤の開発の調査の数は特に、現在では、それにもかかわらず、24,26,27。リガンドDFOは、最も広く採用さキレート剤である大差で89 Zrの標識放射性免疫複合体で。異なるさまざまな生物結合戦略は、チオール反応性DFOの反応は抗体中のシステインを構築し、活性化エステル有利子DFOの反応は、抗体中のリジンを構築し、バイオ直交クリックケミストリーを含む、抗体にDFOを取り付けるために使用されてきた。4,28- 30は簡単に、最も一般的な戦略、しかし、DFO、DFO-NCS（ 図2）のイソチオシアネート-ベアリング誘導体の使用であった。22この市販の二官能性キレート剤は、堅牢かつ確実のリジンとの安定した、共有結合チオ尿素結合を形成し、抗体（ 図3）。 過去数年にわたり、89のZr-DFO標識放射性免疫複合体の多種多様な文献に報告されている。前臨床研究は、そのようなCD105を標的とするTとセツキシマブ、ベバシズマブ、およびトラスツズマブより難解な抗体に、よりよく知られているに至るまで抗体をフィーチャーし、特に豊富だったRC105とfPSAのターゲティング5A10は30-36より最近では、89のZr-DFO標識抗体を使用して初期段階の臨床試験の少数が文献に登場した。具体的には、オランダのグループは、89のZr-DFO-cmAb U36、89のZr-DFO-イブリツモマブチウキセタン、及び89のZr-DFO-トラスツズマブを用いた試験を公開している。加えて、21,32,37、89と他の臨床試験の範囲Zrの標識放射性免疫複合体は、前立腺癌のイメージングおよび乳癌イメージングのためのHER2を標的とする89のZr-DFO-トラスツズマブPSMAを標的と89のZr-DFO-J591を使用して、ここでメモリアルスローンケタリングがんセンターの調査を含め、現在進行中である。23、放射性標識された抗体は、最も一般的な89のZrで標識した放射性医薬品のままさらに30、放射性もますますペプチド、タンパク質、ナノ材料を含む他のベクターに用いられてきた。38-43 </sup&gt; この89のZr-DFOラベリング方法論のモジュール性は途方もない資産である。バイオマーカーを標的とする抗体のレパートリーは、拡大を続けるであり、これらの構築物を用いて、生体 PETイメージングで行う際の関心はたちまち成長しています。その結果、我々はより標準化された実践とプロトコルの開発は、フィールドを利益を得ることができると信じています。 DFO-NCSの共役と89のZr放射性標識のための優れた書かれた実験プロトコルは、すでにら Vosjan、によって出版されました。22私たちは、この仕事が提供する視覚的なデモはさらにこれらの技術に新しい研究者を助けることができると感じています。手元プロトコルでは、前立腺特異的膜抗原のターゲティング抗体J591は、例示するためのモデル系として使用される（1）は、抗体へのDFO -イソチオシアネート、二官能性キレート剤のバイオコンジュゲーション、89（2）放射合成及び精製ZR-DFO-のmAb放射性免疫複合体、（3）癌のマウスモデルにおける89のZr-DFO-のmAb放射性免疫複合体によるインビボ PETイメージング。23,44,45

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-SCN-Bn-DFO</td><td>Macrocyclics</td><td>B-705</td><td>Store at -80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;89&lt;/sup&gt;Zr]Zr-oxalate</td><td>Various, including Perkin-Elmer</td><td></td><td>Caution: Radioactive material</td></tr><tr><td>PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&amp;nbsp;</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC805024</td><td>Store at room temperature</td></tr><tr><td>Silica Gel Impregnated RadioTLC Paper</td><td>Agilent Technologies</td><td>SGI0001</td><td>Cut into strips 0.5 cm wide</td></tr></tbody></table>

the bioconjugation and radiosynthesis of 89zr-dfo-labeled antibodies

例外的な親和性、特異性、および抗体の選択性は、それらの腫瘍標的PET放射性医薬品のための非常に魅力的なベクトルを作る。それらの複数日生物学的半減期に、抗体は、比較的長い物理的な崩壊の半減期を持つ陽電子放出放射性核種で標識されなければならない。伝統的に、陽電子放出同位体124 I（T 1/2 = 4.18 D）、86 Y（T 1/2 = 14.7時間）、および64のCu（T 1/2 = 12.7時間）がための抗体を標識するために使用されてきたPETイメージング。しかし、最近では、フィールドは、抗体ベースのPETイメージング剤における陽電子放出放射性金属89 Zrの使用の劇的な増加を目撃した。それは物理的な半分を所有として89 Zrは、免疫複合体のPETイメージングのためのほぼ理想的な放射性同位体である抗体のインビボ薬物動態と互換性があり、比較的低いエンを発する-Life（T 1/2 = 78.4時間）高解像度の画像を生成するRGY陽電子。さらに、抗体は、直接にシデロフォア由来のキレート剤デスフェリオキサミン（DFO）を使用して、89 Zrを用いて標識することができる。このプロトコルでは、前立腺特異的膜抗原のターゲティング抗体J591は、例示するためのモデル系として使用される（1）抗体、（2）放射性合成および89 Zr-の精製-イソチオシアネートDFO二官能性キレート剤のバイオコンジュゲーションDFO-mAbでの放射性免疫複合体、および癌のマウスモデルにおける89のZr-DFO-mAbでの放射性免疫複合体（3） のインビボ PETイメージング。

抗体にこのプロトコルの最初のステップDFO-NCSの結合は、一般的に非常に堅牢で信頼性の高いです。一般的に、精製され、キレート剤で修飾された免疫複合体は、&gt; 90％の収率で得ることができ、初期結合反応にDFO-NCSの3モル当量を使用する度標識約1.0~1.5 DFOのキレート剤が得られる/モノクローナル抗体。手順の89 Zrの放射性標識および精製工程も同様に簡単です。上記のプロトコル?...

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

バイオコンジュゲーションとのアルタン<sup&gt; 89</sup&gt;のZr-DFO標識抗体

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

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The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

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17.1K ビュー.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described. 

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An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

使用した金ナノ粒子の効率的な放射性標識のために最適化されたプロトコル<sup&gt; 125</sup&gt; I標識アジド補綴グループ

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

化学

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

の調製と評価<sup&gt; 99メートル</sup&gt; Tc標識三座キレートバイオ直交化学反応を用いて事前ターゲティングするため

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for PET imaging. However, the necessity of labeling antibodies with radionuclides with long physical half-lives often results in high background radiation dose rates to non-target tissues. In order to circumvent this issue, we have employed a pretargeted PET imaging strategy based on the inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition reaction. The methodology decouples the antibody from the radioactivity and thus exploits the positive characteristics of antibodies, while eschewing their pharmacokinetic drawbacks. The system is composed of four steps: (1) the injection of a mAb-trans-cyclooctene (TCO) conjugate; (2) a localization time period during which the antibody accumulates in the tumor and clears from the blood; (3) the injection of the radiolabeled tetrazine; and (4) the in vivo click ligation of the components followed by the clearance of excess radioligand. In the example presented in the work at hand, a 64Cu-NOTA-labeled tetrazine radioligand and a trans-cyclooctene-conjugated humanized antibody (huA33) were successfully used to delineate SW1222 colorectal cancer tumors with high tumor-to-background contrast. Further, the pretargeting methodology produces high quality images at only a fraction of the radiation dose to non-target tissue created by radioimmunoconjugates directly labeled with 64Cu or 89Zr. Ultimately, the modularity of this protocol is one of its greatest assets, as the trans-cyclooctene moiety can be appended to any non-internalizing antibody, and the tetrazine can be attached to a wide variety of radioisotopes.

The bioorthogonal inverse electron demand Diels-Alder cycloaddition has been harnessed to create an effective and modular pretargeted PET imaging strategy for cancer. In this protocol, the steps of this methodology are described in the context of a model system employing the colorectal cancer targeted antibody huA33 and a 64Cu-labeled radioligand.

プレターゲッティングPETイメージング用バイオ直交逆電子需要ディールスアルダー環化を活用

Due to their exquisite affinity and specificity, antibodies have become extremely promising vectors for the delivery of radioisotopes to cancer cells for ...

生物工学

Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can result in high radiation doses to healthy tissues. Perhaps not surprisingly, several different strategies have been developed to circumvent this troubling limitation. One of the most promising of these approaches is pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). PRIT is predicated on decoupling the radionuclide from the immunoglobulin, injecting them separately, and then allowing them to combine in vivo at the target tissue. This approach harnesses the exceptional tumor-targeting properties of antibodies while skirting their pharmacokinetic drawbacks, thereby lowering radiation doses to non-target tissues and facilitating the use of radionuclides with half-lives that are considered too short for use in traditional radioimmunoconjugates. Over the last five years, our laboratory and others have developed an approach to in vivo pretargeting based on the inverse electron-demand Diels-Alder (IEDDA) reaction between trans-cyclooctene (TCO) and tetrazine (Tz). This strategy has been successfully applied to pretargeted positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) imaging with a variety of antibody-antigen systems. In a pair of recent publications, we have demonstrated the efficacy of IEDDA-based PRIT in murine models of pancreatic ductal adenocarcinoma and colorectal carcinoma. In this protocol, we describe protocols for PRIT using a 177Lu-DOTA-labeled tetrazine radioligand ([177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz) and a TCO-modified variant of the colorectal cancer targeting huA33 antibody (huA33-TCO). More specifically, we will describe the construction of huA33-TCO, the synthesis and radiolabeling of [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz, and the performance of in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in murine models of colorectal carcinoma.

This protocol describes the synthesis and characterization of a trans-cyclooctene (TCO)-modified antibody and a 177Lu-labeled tetrazine (Tz) radioligand for pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). In addition, it details the use of these two constructs for in vivo biodistribution and longitudinal therapy studies in a murine model of colorectal cancer.

逆電子需要ディールス ・ アルダー反応に基づく pretargeted 放射免疫療法

While radioimmunotherapy (RIT) is a promising approach for the treatment of cancer, the long pharmacokinetic half-life of radiolabeled antibodies can ...

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

合成と化反応のサイト選択的に作成するためのチオール反応性の試薬の変更 Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Positron Emission Tomography Imaging of Cell Trafficking: A Method of Cell Radiolabeling

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for various cancers. Despite significant progress having been made in these areas, there is still more to be learned to better understand the pharmacokinetics and pharmacodynamics of the administered therapeutic cells in the living system. For noninvasive, in vivo tracking of cells with positron emission tomography (PET), a novel [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN)-mediated cell radiolabeling method has been developed utilizing 89Zr (t1/2 78.4 h). The present protocol describes a [89Zr]Zr-DBN-mediated, ready-to-use, radiolabeling synthon for direct radiolabeling of variety of cells, including mesenchymal stem cells, lineage-guided cardiopoietic stem cells, liver regenerating hepatocytes, white blood cells, melanoma cells, and dendritic cells. The developed methodology enables noninvasive PET imaging of cell trafficking for up to 7 days post-administration without affecting the nature or the function of the radiolabeled cells. Additionally, this protocol describes a stepwise method for the radiosynthesis of [89Zr]Zr-DBN, biocompatible formulation of [89Zr]Zr-DBN, preparation of cells for radiolabeling, and finally the radiolabeling of cells with [89Zr]Zr-DBN, including all the intricate details needed for the successful radiolabeling of cells.

Presented here is a protocol to radiolabel cells with a positron emission tomography (PET) radioisotope, 89Zr (t1/2 78.4 h), using a ready-to-use radiolabeling synthon, [89Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr]Zr-DBN). Radiolabeling cells with [89Zr]Zr-DBN allows noninvasive tracking and imaging of administered radiolabeled cells in the body with PET for up to 7 days post-administration.

細胞輸送の陽電子放出断層撮影イメージング:細胞放射性標識法

Stem cell and chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies are emerging as promising therapeutics for organ regeneration and as immunotherapy for ...

がん研究

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used in cancer treatment and imaging due to increased cellular accumulation over current ACs. During early AC in vitro development, fluorescence techniques and radioimmunoassays are sufficient for determining intracellular localization, accumulation efficiency, and target cell specificity. Currently, there is no consensus on standardized methods for preparing cells for evaluating AC intracellular accumulation and localization. The initial testing of ACs modified with virus-derived peptides is critical especially if several candidates have been constructed. Determining intracellular accumulation by fluorescence can be affected by background signal from ACs at the cell surface and complicate the interpretation of accumulation. For radioimmunoassays, typically treated cells are fractionated and the radioactivity in different cell compartments measured. However, cell lysis varies from cell to cell and often nuclear and cytoplasmic compartments are not adequately isolated. This can produce misleading data on payload delivery properties. The intravenous injection of radiolabeled virus-derived peptide-modified ACs in tumor bearing mice followed by radionuclide imaging is a powerful method for determining tumor targeting and payload delivery properties at the in vivo phase of development. However, this is a relatively recent advancement and few groups have evaluated virus-derived peptide-modified ACs in this manner. We describe the processing of treated cells to more accurately evaluate virus-derived peptide-modified AC accumulation when using confocal microscopy and radioimmunoassays. Specifically, a method for trypsinizing cells to remove cell surface bound ACs. We also provide a method for improving cellular fractionation. Lastly, this protocol provides an in vivo method using positron emission tomography (PET) for evaluating initial tumor targeting properties in tumor-bearing mice. We use the radioisotope 64Cu (t1/2 = 12.7 h) as an example payload in this protocol.

Viral-derived peptides coupled to antibody-conjugates (ACs) is an approach gaining momentum due to the potential of delivering molecular payloads with increased tumor cell accumulation. Utilizing common methods to evaluate peptide conjugation, AC and payload intracellular accumulation, and tumor targeting, this protocol helps researchers during the key initial development phases.

細胞集積量の増加と腫瘍標的化の改善のためウイルス由来ペプチド修飾抗体複合体の初期評価

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

マウスリンパ球標識による<sup&gt; 64</sup以下のためのターゲット設定&gt;のCu-抗体の受容体<em&gt;インビボ</em&gt; PET / CTによる細胞輸送

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

免疫・感染学

Determining Binding Affinity (KD) of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is represented by the equilibrium dissociation constant, KD, and can be calculated as the concentration of antibody at which half the antibody binding sites are occupied at equilibrium. This method can be generalized to any radiolabeled antibody or other protein and peptide scaffolds. In contrast to cell-based methods, the choice of immobilized antigens is particularly useful for validating binding affinities after long-term storage of antibodies, distinguishing binding affinities of fragment antigen-binding region (Fab) arms in bispecific antibody constructs, and determining if there is variability in antigen expression between different cell lines. This method involves immobilizing a fixed amount of antigen to specified wells on a breakable 96-well plate. Then, nonspecific binding was blocked in all wells with bovine serum albumin (BSA). Subsequently, the rAb was added in a concentration gradient to all wells. A range of concentrations was chosen to allow the rAb to reach saturation, i.e., a concentration of antibody at which all antigens are continuously bound by the rAb. In designated wells without immobilized antigen, nonspecific binding of the rAb can be determined. By subtracting nonspecific binding from total binding in the wells with immobilized antigen, specific binding of the rAb to the antigen can be determined. The KD of the rAb was calculated from the resulting saturation binding curve. As an example, binding affinity was determined using radiolabeled amivantamab, a bispecific antibody for epidermal growth factor receptor (EGFR) and cytoplasmic mesenchymal-epithelial transition (cMET) proteins.

Determining Binding Affinity KD of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Here, a method is described to determine the binding affinity (KD) of radiolabeled antibodies to immobilized antigens. KD is the equilibrium dissociation constant that can be determined from a saturation binding experiment by measuring the total, specific, and nonspecific binding of a radiolabeled antibody at various concentrations to its antigen.

固定化抗原に対する放射性標識抗体の結合親和性(KD)の決定

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is ...

医学

Pretargeted Radioimmunotherapy: A Method for Targeted Delivery of Therapeutic Radionuclides to Tumors

Source: Membreno, R., et al. <a href="https://www.jove.com/v/59041"> Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video describes the technique of pretargeted radioimmunotherapy or PRIT, in which immunoconjugates followed by radioligands are administered for treating tumors. This radioimmunotherapy reduces radiation doses to healthy tissues and utilizes radionuclides with very low half-lives incompatible with antibody-based vectors.

プレターゲット放射性免疫療法:治療用放射性核種を腫瘍に標的送達する方法

Source: Membreno, R., et al.  Pretargeted Radioimmunotherapy Based on the Inverse Electron Demand Diels-Alder Reaction. J. Vis. Exp. (2019).
This video ...

バイオコンジュゲーションとのアルタン

要約

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使用した金ナノ粒子の効率的な放射性標識のために最適化されたプロトコル

の調製と評価

プレターゲッティングPETイメージング用バイオ直交逆電子需要ディールスアルダー環化を活用

逆電子需要ディールス・アルダー反応に基づく pretargeted 放射免疫療法

合成と化反応のサイト選択的に作成するためのチオール反応性の試薬の変更 Immunoconjugates

細胞輸送の陽電子放出断層撮影イメージング:細胞放射性標識法

細胞集積量の増加と腫瘍標的化の改善のためウイルス由来ペプチド修飾抗体複合体の初期評価

マウスリンパ球標識による

固定化抗原に対する放射性標識抗体の結合親和性_(KD)の決定

プレターゲット放射性免疫療法:治療用放射性核種を腫瘍に標的送達する方法

バイオコンジュゲーションとのアルタン

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使用した金ナノ粒子の効率的な放射性標識のために最適化されたプロトコル

の調製と評価

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マウスリンパ球標識による

固定化抗原に対する放射性標識抗体の結合親和性(KD)の決定

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逆電子需要ディールス・アルダー反応に基づく pretargeted 放射免疫療法

固定化抗原に対する放射性標識抗体の結合親和性_(KD)の決定