著者らは、ラットの研究にMeritxellロム·ナダルの貢献を感謝したい。

1。動物手続き<ol><li>全ての動物研究は、内務省動物（科学的処置）法（1986）に従って行われるべきである。 </li><li>一夫一婦制の繁殖による古い10週齢のWistarラットを交尾し、膣栓の出現によって妊娠を確認します。妊娠1日目としてこれを記録し、実験食を開始。処女雌については、個別にそれぞれのラットを収容し、実験食を開始。 </li><li> 20日間の実験飼料を供給した後、頸椎脱臼に続いてCO 2窒息によりラットは安楽死させる。 </li><li>腹腔を露出させ、腹部、胃と十二指腸の前壁を振動板に肝臓をつなぐ靭帯を切断することにより、肝臓を切除する解剖鉗子やハサミを使用してください。 -80℃で保存する前に、PBS中で肝臓を洗浄し、液体窒素中で凍結</li></ol> 2。総脂質の製造は、9を抽出します<ol><li> moleculを追加ARキュラー&#39;ドライ&#39;溶剤を作成するためにすべての溶媒に（溶剤容器の1月10日を記入します。）。 ヒュームフード内のすべての溶剤作業を実施 。 </li><li>約100ミリグラムを凍結した肝臓を切り取り、重量を量る。アイスバケットにチューブに組織を配置し、0.8ミリリットルの氷冷0.9％のNaClを追加します。組織を均質化する。 </li><li>乾燥クロロホルムを1ml / mgの中に溶解し、内部標準を追加：メタノール（2:1、v / v）のブチル化ヒドロキシトルエン（BHT;を50mg / l）を含有する抗酸化剤。ラットの肝臓の100 mgのためのCE規格（コレステヘプタデカン午後05時）の100μgのを追加します。 注意 ：クロロホルムおよびBHTは危険です。 </li><li> 5.0ミリリットルの乾燥クロロホルムを追加：メタノール（2:1、v / v）のBHTた（50mg / L）を含有する。 </li><li>混合物が均一に見えるまで、ボルテックスで十分に混和、1.0ミリリットル1MのNaClを追加します。サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li><li> 10分、室温で低ブレーキ1,000×gで遠心分離する。 </li><li> lower収集ガラスパスツールピペットを用いて相は、40℃の窒素下に新しいスクリューキャップガラスチューブに移し、ドライサンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li></ol> 3。固相抽出（SPE）10による脂質クラスの分離<ol><li>真空ポンプにSPEタンクを接続し、タンクにアミノプロピルシリカSPEカートリッジを配置します。 </li><li>第一の画分を収集するために列の下のタンクラック内のタグおよびCEというラベルの新しいスクリューキャップのガラス管を配置します。 </li><li> 1.0ミリリットルの乾燥クロロホルムや渦の総脂質抽出物を溶解する。 </li><li>ガラスパスツールピペットを用いてカラムにサンプルを適用し、重力下でスクリューキャップチューブに通って滴下することができます。これ以上のドリップが落ちない場合は、真空によって残った液体を除去。 </li><li>真空下でTAGおよびCEの分画を溶出、乾燥クロロホルム2×1.0 mLの洗浄でカラムを洗浄。 </li><li>全ての液体が除去されると、TAGおよびCE fractioを乾燥40℃で窒素下、Nサンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li><li>列の下のタンクトレイに新しいスクリューキャップのガラス管ラベルのPCを配置します。 </li><li> 2×1.0ミリリットルを加え乾燥クロロホルムを真空下でのPCの割合を溶出：メタノール（60:40、v / v）で、すべての液体がカラムから除去されるまで。 </li><li> 40℃で窒素下でのPCの画分を除去し、乾燥サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li><li>タンクトレイに、PEという新しいスクリューキャップのガラス管を配置し、1.0ミリリットルを加え、真空下で乾燥メタノールでのPE分を溶出。 </li><li> 40℃で窒素下でのPE画分を除去し、乾燥サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li><li>タンクトレイにNEFAという新しいスクリューキャップのガラス管を置き、乾燥クロロホルム2×1.0ミリリットルの洗浄を添加することにより、真空下でNEFA分を溶出：メタノール：氷酢酸（100:2:2、v / v / v）を注意 ：氷酢酸危険である。 </li><li> 40℃の窒素下で収集NEFA画分と乾燥を削除サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li><li> SPEタンクに新しいアミノプロピルシリカSPEカートリッジを配置し、廃棄物を収集するためのカートリッジの下にタンクトレイにスクリューキャップのガラス管を配置します。 </li><li> 3真空下で乾燥ヘキサン洗浄および重力下で、最終的な1.0ミリリットルの洗浄でカラムを洗浄します。 。カートリッジ（ヘキサンレベルはカートリッジ行列に近い場合に閉位置にカートリッジカラム·チャネルをオンに） 注意ドライになることを許可していない：ヘキサンは危険です。 </li><li>新しいスクリューキャップガラス管ラベルのCEと廃液チューブを交換してください。 </li><li>乾燥ヘキサンと渦の1.0ミリリットル中に（ステップ3.6で製造）乾燥し、タグおよびCE分を溶解する。ガラスパスツールピペットを使用して列にこれを適用するとgの下を滴らすることができますravity。 </li><li>これ以上のドリップが落ちないときは、真空下で残りの液体を除去。 </li><li>真空下、40℃で窒素下、CEおよび乾燥回収した画を溶出する乾燥ヘキサン2×1.0 mLの洗浄でカラムを洗浄サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li><li>タンクトレイに新しいスクリューキャップのガラス管にラベルされたタグを配置し、乾燥ヘキサン2×1.0ミリリットルの洗浄を追加してタグを溶出：メタノール：酢酸エチル（100:5:5）を真空下。 </li><li> 40℃の窒素下で乾燥回収した画。サンプルは週までの注意のために蓋をし ​​て、この段階で-20℃で保存することができます：酢酸エチルは危険です。 </li></ol> 4。 CEの10からFAMEの調製<ol><li> 。分離のCE分（ステップ3.19で収集）し、ボルテックス注意を乾燥トルエン0.5ミリリットルを追加します。トルエンは危険です。 </li><li> 2％（vでメチル化試薬を調製（乾燥メタノール/体積）は1.0 mlのサンプル当たり要求されるH 2 SO 4）。ガラスや蓋付きの適切なプラスチック容器に乾燥メタノールの量を分配し、H 2の必要量を追加し、SO 4滴下し、転倒混和注意 ：濃硫酸は危険です。 </li><li>乾燥トルエンに溶解したサンプルをメチル化試薬の1.0ミリリットルを加え、しっかりとチューブにキャップをし、穏やかに混合。 </li><li> 50℃で2時間、試料を加熱する</li><li> 2時間後に火からチューブを取り外します。一度クール（0.25M KHCO 3 0.5MK 2 CO 3）水溶液を中和する1.0ミリリットルを追加注意 ：重炭酸カリウムおよび炭酸カリウムは危険です。 </li><li> 1.0ミリリットル乾燥ヘキサンと渦を追加します。 </li><li> 2分、室温で低ブレーキ用250×gで遠心分離する。 </li><li>名声を含んでいる上相を収集し、新しい非スクリューキャップ使い捨てガラス管に移す。 </li><li>下で収集名声を乾かし40℃の窒素サンプルは一週間までのため蓋をし、この段階で-20℃で保存することができる。 </li></ol> 5。 CE FAME 14から遊離コレステロール汚染の除去 （遊離コレステロールは、サンプルを汚染することができます。無料のコレステロール除去をしてなくても例えば、クロマトグラフトレースの図1を参照）。 <ol><li> SPEタンクに廃液チューブを配置し、タンクの上にシリカゲルSPEカートリッジを配置します。 </li><li>真空下での乾燥ヘキサンで3回1ミリリットルの洗浄と重力の下、1×1ミリリットルでカラムを洗浄します。 </li><li>廃棄物の洗浄を取り外し、タンクに新しい廃液チューブを追加します。 </li><li> 1ミリリットル乾燥ヘキサン、渦のCE名声を溶かす。 </li><li>ガラスパスツールピペットを用いてカラムに適用され、重力の下を滴下することができます。 </li><li>真空下でのヘキサンで3回1ミリリットルの洗浄でカラムを洗浄します。 </li><li>廃棄物の洗浄を外し、タンクラベルCEの名声に新しい非スクリューキャップチューブを配置します。 </li><li>溶出2×1ミリリットル乾燥ヘキサンでのCE FAME：ジエチルエーテル（95:5 v / v）で洗浄する。 </li><li> 40℃の窒素下で乾燥する。サンプルは週までの注意のために蓋をし ​​て、この段階で-20℃で保存することができます：ジエチルエーテルは危険です。 </li></ol> 6。 GCオートサンプラーバイアルにFAMEの転送<ol><li> 、渦をサンプリングして、GCのオートサンプルバイアルに転送する75μlの乾燥ヘキサンを追加します。 </li><li> 、サンプル渦と同じGCオートサンプルバイアルに転送し、さらに75μlの乾燥ヘキサンを追加します。サンプルは、月までのために蓋をして、この段階で-20℃で保存することができます。 </li></ol> 7。ガスクロマトグラフ14を用いた分析<ol><li>ガスクロマトグラフ上で名声を分析します。の例では、最大セット：30 MX X 0.25ミリメートル0.25ミクロンBPX-70温度プロトコル溶融シリカキャピラリカラム： 初期温度115℃、245℃、Hに18.5分、傾斜60℃/分を保持し、200℃まで2分、勾配10℃/分を保持旧4分。 コラム：ヘリウムガス、流量1.0、圧力14.6と速度29。 インジェクタ：温度= 300℃、 検出器：水素流量40.0、空気の流れ184.0、ガスヘリウムを構成している、45.0を流量、温度= 300℃、 </li><li> （CEの名声分析用など 25:1）に応じて分割比を設定します。 </li><li>適切なソフトウェアを使用して、各ピーク下の面積を決定し、標準と比較することによって名声を識別します。例えば、クロマトグラムについては、図2を参照してください。 </li><li>総脂肪酸の割合として、個々の脂肪酸の寄与を計算するために、ピークデータ下の面積を使用する。 </li><li>添加量は、内部標準の面積で割ることにより脂肪酸の絶対濃度を計算する。用いる組織量内の各脂肪酸の絶対濃度を得るために、この結果により、各脂肪酸の領域を分割する。 </li></ol>

<ol>
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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+erythrocyte+membrane+Trans+and+marine+fatty+acids+between+1999+and+2006+in+older+Americans.">Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans.</a> J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).</li><li>Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+matter+of+fat:+An+introduction+to+lipidomic+profiling+method.">A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method.</a> J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).</li></ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

ガスクロマトグラフィーは脂肪酸分析のために使用する正確な技術であり、その高い再現性が臨床分析に適したこの技術を認める。適切なGCカラムは、使用可能なカラムは、固定相、カラムの長さと内径の極性の変化を有する、関心対象の脂肪酸の同定を可能にするために使用されなければならない。この分析方法では、溶融シリカキャピラリーカラムの使用は、良好な熱安定性およびその?...

ガスクロマトグラフィー（GC）は、肥満症（および糖尿病などの関連疾患）、または妊娠3などの補充または生理学的状態の間脂質プールおよび細胞膜1,2への脂肪酸の取り込みを同定および定量するために使用される十分に確立された技術である- 5。それはまた、食品中の脂肪のタイプおよび量を分析するのに適している。実験食を特徴付けるだけでなく、食品業界は、規制に準拠していることを確実にする場合に便利です。例えば、GC、その標識が正しく、規制が6,7に接着されるように、このような栄養補助食品のような製品内のアイデンティティおよび脂肪酸の量を確認するために使用することができる。脂肪酸の分析では、健康と病気、食事変更の影響、および生理的状態8の変化の影響での脂質代謝への貴重な洞察を提供することができます。妊娠中にサンプルを研究するため、GCの使用が重要に提供してきました脂肪酸と複合脂質の恒常3の変化についての情報。 クロマトグラフィー分離の前に、脂質は、典型的には、クロロホルムとメタノールの溶媒混合物中の脂質の溶解度を用いてサンプルから抽出される。塩化ナトリウム相9,10を含有する水性および有機脂質への混合物の分離を容易にするために添加される。関心対象の複合脂質クラスは、固相抽出（SPE）によって総脂質抽出物から分離することができる。この分離技術は、それらの極性または結合親和性に基づいた脂質クラスを溶出する。 Triacyglycerols（TAG）およびコレステリルエステル（CE）を合わせた画分、さらにクラス、ホスファチジルコリン（PC）として最初に溶出され、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、および非エステル化脂肪酸（NEFA）は、溶出溶媒の極性を増加させることによって溶出される。 CEからのタグの分離は、新鮮なのSPE cartri、タグの結合を利用DGE、CEが溶出することができるようにする。 TAGは、次いで溶出溶媒9,10の極性を増加させることによって溶出させることができる。この方法は、複数のサンプルが比較的小さいサイズのサンプル（ 例えば、&lt;100μlの血漿または血清、&lt;100 mgの組織）は11,12分析することができることを意味する薄層クロマトグラフィーを用いて達成されるよりも高い収率で同時に分離することができる。 GCは、最初、1950に記載された十分に確立された技術であり、これは、次いで、液 - 液系における移動相は蒸気で置き換えることができることが示唆された。当初は石油分析のために使用されるが、そのような急速に主要な関心が依然としてあるアミノ酸分析および脂質生化学などの他の分野に拡大した。以前に使用した充填カラムからこのようなキャピラリカラムの開発など、GC機器や技術の進歩により、脂肪酸があることができるかが私たちの現在の技術につながっているGCは、日常的な調査13の広い範囲で脂肪酸を同定および定量するために使用され、その結果、より低い温度でより効率的に分離する。 GCは、それらが熱分解することなく、妥当な温度で溶出するのに十分に揮発性になることができるようにするために誘導体化される脂肪酸を必要とする。これは、通常、分析のためにエステル、チオエステル、またはアミドを形成するために水素を含む官能基の置換を含む。メチルエステルは一般的にメチル化によって製造される誘導体を、研究されている。この方法では、複合脂質中のエステル結合が脂肪酸メチルエステル（FAME）を形成するtransmethylatedされている遊離脂肪酸を放出するために加水分解される。 GCにより決定FAMEの結果として生じるプロファイルは、脂肪酸組成物と呼ばれ、簡単に異なる実験群9,10の間で比較することができる。技術は個々を、両方の割合ができますUALの脂肪酸およびそれらの濃度を測定する。 栄養学研究において、食品業界内の脂肪酸を分析するためのGCの使用に加えて、この技術は、分析の幅広い分野で使用できる。例えば、GCを用いて、環境分析は殺虫剤および土壌水の汚染を測定することが含まクロロベンゼン含有量を測定解析する。毒物学では、GCはまた、尿、個人の血液試料中の違法な物質を同定するために使用されている等のスポーツパフォーマンスエンハンサー12及び炭化水素の複雑な混合物を分離する能力は、石油化学分析12のための石油産業におけるこの技術が人気となる。 妊娠は、多価不飽和脂肪酸アシ有意な母体組織の脂肪酸組成の変化、具体的にはω-3の含有量が第（n-3）およびω-6（n-6）系に関連付けられているDS（PUFA）3。現在の研究では、異なる油供給源と低および高脂肪食を与えた処女と妊娠ラットから採取した肝臓組織の脂肪酸組成の分析においてその使用を記述することにより脂肪酸の測定におけるGCの使用を例示する。ここで提供される実験食は低脂肪大豆油ベースの食、高脂肪大豆油ベースの食事療法（130.9グラム総脂肪/ kgの総脂肪）または高脂肪亜麻仁油ベースの食事療法（130.9グラム総脂肪/ kgであった20日間のために提供食）、。これらの食事の完全な栄養素と脂肪酸組成は、以前に14に記載されている。大豆油食はリノール酸（18:2 n-6系）に富み、亜麻仁油食は、α-リノレン酸が豊富に含まれている間、いくつかのα-リノレン酸（18:3 n-3系）が含まれている。これらの高脂肪食は、リノールα-リノレン酸にする（それぞれ8:1 1:1の配給）の異なる飼料を表しています。個々の脂質クラスの分離とGCによる分析のための方法は、我々であるLL設立され、検証され、以前に10ではなく、ここに見つかった詳細な技術的説明なしに公開されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Methanol:</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M/4056/17</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes - HPLC Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform:</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C/4966/17</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes - HPLC Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHT:</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>W218405</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Dust fumes - Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Anhydrous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H/0406/17</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes - HPLC Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>695084</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Burns - 99.85%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Burns - 99.999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>209619</td>
			<td>99% ACS Reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium bicarbonate</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>237205</td>
			<td>99.7% ACS Reasgent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10204340</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes - 99+% GLC SpeciFied</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>T/2300/15</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethyl ether</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>309966</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Fumes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen (oxygen free) cylinder</td>
			<td>BOC</td>
			<td>44-w</td>
			<td>&#39;CAUTION&#39; Compressed gas - explosion risk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminopropyl silica SPE cartridges</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>12102014</td>
			<td>Cartridge - Bead mass 100mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel SPE cartidges</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>14102010</td>
			<td>Cartridge - Bead mass 100mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular seives</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>334324</td>
			<td>Pellets, AW-300, 1.6mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass test tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB59527</td>
			<td>Non-screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw thread glass test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB59555</td>
			<td>13mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caps for screw thread test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB51353</td>
			<td>To fit 13mm tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solida phase extraction (SPE) tank</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td>VacElut 20 Manifold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer stopcocks for SPE tank</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>12131005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Sigma- Aldrich</td>
			<td>2656-194GB-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC vials</td>
			<td>Kinesis</td>
			<td>STV 12-03TS</td>
			<td>Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC vial lids</td>
			<td>Kinesis</td>
			<td>SCC09-0.2B</td>
			<td>Short thread 9mm blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC inlet liners</td>
			<td>SGE Analytical science</td>
			<td>092002</td>
			<td>Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC septa</td>
			<td>SGE Analytical science</td>
			<td>041856</td>
			<td>11mm, MN material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GC column</td>
			<td>SGE Analytical science</td>
			<td>054612</td>
			<td>Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25&#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatograph</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HP 6890 series</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of gas chromatography to analyze compositional changes of fatty acids in rat liver tissue during pregnancy

ガスクロマトグラフィー（GC）を高精度かつ再現性の高い結果が得られ、組織、細胞、血漿/血清から脂質の脂肪酸含量を同定および定量するために使用される高感度な方法である。代謝および栄養の研究においてGCは、脂肪酸濃度の変化の評価は、介入の後、または妊娠などの生理的状態の変化の間に可能にする。アミノプロピルシリカカートリッジを使用して固相抽出（SPE）は、トリアシルグリセロール、様々なリン脂質、およびコレステリルエステル（CE）を含む主要な脂質クラスの分離を可能にする。 SPEと組み合わさGCは、種々の高および低脂肪食を給餌されたバージン及び妊娠ラットの肝臓におけるCE画分の脂肪酸組成の変化を分析するために使用した。肝臓CEのω-3およびω-6脂肪酸含有量に大きなダイエット/妊娠相互作用効果は、妊娠中の女性が食物manipulatに対して異なる応答を有することを示してありよりイオンは処女雌の間で見られます。

この方法の成功は、正確かつクロマトグラムにも表示される可能性が「ノイズ」と汚染を低減するために、きれいな溶媒および試薬を使用しているプロトコルを以下に依存します。汚染されたサンプルは、曲線下面積の計算の精度を低下させること、分析することがより困難である。プロトコルが明確な左右対称、明確に定義されたピークとし、最小限のバックグラウンドノイズで正常にク?...

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The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

妊娠は、母体組織の脂肪酸組成に有意な変化をもたらす。脂質プロフィールは、ラットの間で個々の脂質クラス内の脂肪酸の同定および定量は、妊娠中の種々の高および低脂肪食を給餌できるように、ガスクロマトグラフィーを介して得ることができる。

妊娠中にラット肝組織中の脂肪酸の組成変化を分析するために、ガスクロマトグラフィーの使用

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

29.9K ビュー.  University of Southampton. 妊娠は、母体組織の脂肪酸組成に有意な変化をもたらす。脂質プロフィールは、ラットの間で個々の脂質クラス内の脂肪酸の同定および定量は、妊娠中の種々の高および低脂肪食を給餌できるように、ガスクロマトグラフィーを介して得ることができる。 

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Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue located at or near the N-terminus of a helix is often more acidic than that at or near the C-terminus 1-6. Although extensive experimental studies on the acid-base properties of peptides have been carried out in the condensed phase, in particular in aqueous solutions 6-8, the results are often complicated by solvent effects 7. In fact, most of the active sites in proteins are located near the interior region where solvent effects have been minimized 9,10. In order to understand intrinsic acid-base properties of peptides and proteins, it is important to perform the studies in a solvent-free environment.
We present a method to measure the acidities of oligopeptides in the gas-phase. We use a cysteine-containing oligopeptide, Ala3CysNH2 (A3CH), as the model compound. The measurements are based on the well-established extended Cooks kinetic method (Figure 1) 11-16. The experiments are carried out using a triple-quadrupole mass spectrometer interfaced with an electrospray ionization (ESI) ion source (Figure 2). For each peptide sample, several reference acids are selected. The reference acids are structurally similar organic compounds with known gas-phase acidities. A solution of the mixture of the peptide and a reference acid is introduced into the mass spectrometer, and a gas-phase proton-bound anionic cluster of peptide-reference acid is formed. The proton-bound cluster is mass isolated and subsequently fragmented via collision-induced dissociation (CID) experiments. The resulting fragment ion abundances are analyzed using a relationship between the acidities and the cluster ion dissociation kinetics. The gas-phase acidity of the peptide is then obtained by linear regression of the thermo-kinetic plots 17,18.
The method can be applied to a variety of molecular systems, including organic compounds, amino acids and their derivatives, oligonucleotides, and oligopeptides. By comparing the gas-phase acidities measured experimentally with those values calculated for different conformers, conformational effects on the acidities can be evaluated.

The determination of the gas-phase acidities of cysteine-containing oligopeptides is described. The experiments are performed using a triple quadrupole mass spectrometer. The relative acidities of the peptides are measured using collision-induced dissociation experiments, and the quantitative acidities are determined using the extended Cooks kinetic method.

オリゴペプチドの気相酸性度の決定

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

化学

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Quantitative Detection of Trace Explosive Vapors by Programmed Temperature Desorption Gas Chromatography-Electron Capture Detector

The direct liquid deposition of solution standards onto sorbent-filled thermal desorption tubes is used for the quantitative analysis of trace explosive vapor samples. The direct liquid deposition method yields a higher fidelity between the analysis of vapor samples and the analysis of solution standards than using separate injection methods for vapors and solutions, i.e., samples collected on vapor collection tubes and standards prepared in solution vials. Additionally, the method can account for instrumentation losses, which makes it ideal for minimizing variability and quantitative trace chemical detection. Gas chromatography with an electron capture detector is an instrumentation configuration sensitive to nitro-energetics, such as TNT and RDX, due to their relatively high electron affinity. However, vapor quantitation of these compounds is difficult without viable vapor standards. Thus, we eliminate the requirement for vapor standards by combining the sensitivity of the instrumentation with a direct liquid deposition protocol to analyze trace explosive vapor samples.

Trace explosive vapors of TNT and RDX collected on sorbent-filled thermal desorption tubes were analyzed using a programmed temperature desorption system coupled to GC with an electron capture detector. The instrumental analysis is combined with direct liquid deposition method to reduce sample variability and account for instrumentation drift and losses.

プログラムされた温度脱着ガスクロマトグラフィー - 電子捕獲型検出器による微量爆発性気体の定量的検出

The direct liquid deposition of solution standards onto sorbent-filled thermal desorption tubes is used for the quantitative analysis of trace explosive ...

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. Kinesins display differences across the superfamily both in ATP turnover and in microtubule interaction. These differences tailor specific kinesins to various functions such as cargo transport, microtubule sliding, microtubule depolymerization and microtubule stabilization. To understand the mechanism of action of a kinesin it is important to understand how the chemical cycle of ATP turnover is coupled to the mechanical cycle of microtubule interaction. To dissect the ATP turnover cycle, one approach is to utilize fluorescently labeled nucleotides to visualize individual steps in the cycle. Determining the kinetics of each nucleotide transition in the ATP turnover cycle allows the rate-limiting step or steps for the complete cycle to be identified. For a kinesin, it is important to know the rate-limiting step, in the absence of microtubules, as this step is generally accelerated several thousand fold when the kinesin interacts with microtubules. The cycle in the absence of microtubules is then compared to that in the presence of microtubules to fully understand a kinesin&#8217;s ATP turnover cycle. The kinetics of individual nucleotide transitions are generally too fast to observe by manually mixing reactants, particularly in the presence of microtubules. A rapid mixing device, such as a stopped-flow fluorimeter, which allows kinetics to be observed on timescales of as little as a few milliseconds, can be used to monitor such transitions. Here, we describe protocols in which rapid mixing of reagents by stopped-flow is used in conjunction with fluorescently labeled nucleotides to dissect the ATP turnover cycle of a kinesin.

Kinesins are characterized by nucleotide-dependent interaction with microtubules: a cycle of ATP turnover coupled to a cycle of microtubule interaction. Here, we describe protocols to analyze the kinetics of individual nucleotide transitions in the ATP turnover cycle of a kinesin using fluorescently labeled nucleotides and stopped-flow fluorescence.

キネシンのATPターンオーバーサイクルを分析するためにストップトフロー蛍光および標識ヌクレオチドの使用

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular identity and function. Each of the seven PtdInsPs varies in their distribution and abundance, which are tightly regulated by specific kinases and phosphatases. The abundance of PtdInsPs can change abruptly in response to various signaling events or disturbance of the regulatory machinery. To understand how these events lead to changes in the amount of PtdInsPs and their resulting impact, it is important to quantify PtdInsP levels before and after a signaling event or between control and abnormal conditions. However, due to their low abundance and similarity, quantifying the relative amounts of each PtdInsP can be challenging. This article describes a method for quantifying PtdInsP levels by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, which is incorporated into PtdInsPs. Phospholipids are then precipitated and deacylated. The resulting soluble 3H-glycero-inositides are further extracted, separated by high-performance liquid chromatography (HPLC), and detected by flow scintillation. The labeling and processing of yeast samples is described in detail, as well as the instrumental setup for the HPLC and flow scintillator. Despite losing structural information regarding acyl chain content, this method is sensitive and can be optimized to concurrently quantify all seven PtdInsPs in cells.

Phosphoinositides are signaling lipids whose relative abundance rapidly changes in response to various stimuli. This article describes a method to measure the abundance of phosphoinositides by metabolically labeling cells with 3H-myo-inositol, followed by extraction and deacylation. Extracted glycero-inositides are then separated by high-performance liquid chromatography and quantified by flow scintillation.

高速液体クロマトグラフィー結合フローシンチレーションにより放射性標識およびホスホイノシチドの細胞レベルの定量化

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

Facile Preparation of 4-Substituted Quinazoline Derivatives

Reported in this paper is a very simple method for direct preparation of 4-substituted quinazoline derivatives from a reaction between substituted 2-aminobenzophenones and thiourea in the presence of dimethyl sulfoxide (DMSO). This is a unique complementary reaction system in which thiourea undergoes thermal decomposition to form carbodiimide and hydrogen sulfide, where the former reacts with 2-aminobenzophenone to form 4-phenylquinazolin-2(1H)-imine intermediate, whilst hydrogen sulfide reacts with DMSO to give methanethiol or other sulfur-containing molecule which then functions as a complementary reducing agent to reduce 4-phenylquinazolin-2(1H)-imine intermediate into 4-phenyl-1,2-dihydroquinazolin-2-amine. Subsequently, the elimination of ammonia from 4-phenyl-1,2-dihydroquinazolin-2-amine affords substituted quinazoline derivative. This reaction usually gives quinazoline derivative as a single product arising from 2-aminobenzophenone as monitored by GC/MS analysis, along with small amount of sulfur-containing molecules such as dimethyl disulfide, dimethyl trisulfide, etc. The reaction usually completes in 4-6 hr at 160 &#186;C in small scale but may last over 24 hr when carried out in large scale. The reaction product can be easily purified by means of washing off DMSO with water followed by column chromatography or thin layer chromatography.

A protocol for facile preparation of 4-substituted quinazoline derivatives from 2-aminobenzophenones, thiourea and dimethyl sulfoxide is presented.

4-置換キナゾリン誘導体の簡便な準備

Reported in this paper is a very simple method for direct preparation of 4-substituted quinazoline derivatives from a reaction between substituted ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic acids containing three to six carbons), such as malate and citrate, are critical to the proper functioning of many biological systems, where they function in cellular respiration and can serve as indicators of cell health. In foods, organic acid content can have significant impact on taste, with increased SCCA levels resulting in a sour or &#34;acid&#34; taste. Because of this, methods for the rapid analysis of organic acid levels are of particular interest to the food and beverage industries. Unfortunately, however, most methods used for SCCA quantification are dependent on time-consuming protocols requiring the derivatization of samples with hazardous reagents, followed by costly chromatographic and/or mass spectrometric analyses. This method details an alternate method for the detection and quantification of organic acids from plant material and food samples using free zonal capillary electrophoresis (CZE), sometimes simply referred to as capillary electrophoresis (CE). CZE provides a cost-effective method for measuring SCCAs with a low limit of detection (0.005 mg/ml). This article details the extraction and quantification of SCCAs from plant samples. While the method provided focuses on measurement of SCCAs from coffee beans, the method provided can be applied to multiple plant-based food materials.

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

This article presents a method for the detection and quantification of organic acids from plant material using free zonal capillary electrophoresis. An example of the potential application of this method, determining the effects of a secondary fermentation on organic acid levels in coffee seeds, is provided.

植物組織からの有機酸を定量化するためにキャピラリー電気泳動を使用した：テストケースを調べます<em&gt;コーヒーノキアラビカ</em&gt;種子

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Raman and IR Spectroelectrochemical Methods as Tools to Analyze Conjugated Organic Compounds

In the presented work, two spectroelectrochemical techniques are discussed as tools for the analysis of the structural changes occurring in the molecule on the vibrational level of energy. Raman and IR spectroelectrochemistry can be used for advanced characterization of the structural changes in the organic electroactive compounds. Here, the step-by-step analysis by means of Raman and IR spectroelectrochemistry is shown. Raman and IR spectroelectrochemical techniques provide complementary information about structural changes occurring during an electrochemical process, i.e. allows for the investigation of redox processes and their products. The examples of IR and Raman spectroelectrochemical analysis are presented, in which the products of the redox reactions, both in solution and solid state, are identified.

A protocol of step-by-step Raman and IR spectroelectrochemical analysis is presented.

ラマン散乱とツールとしての IR 分光電気化学法共役有機化合物を分析するには

In the presented work, two spectroelectrochemical techniques are discussed as tools for the analysis of the structural changes occurring in the molecule ...

A Two-Step Pyrolysis-Gas Chromatography Method with Mass Spectrometric Detection for Identification of Tattoo Ink Ingredients and Counterfeit Products

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. In this method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography mass spectrometry (py-GC-MS) volatile compounds are analyzed during a first desorption run. In the second run, the same dried sample is pyrolyzed for analysis of non-volatile compounds such as pigments and polymers. These can be identified by their specific decomposition patterns. Additionally, this method can be used to differentiate original from counterfeit inks. Easy screening methods for data evaluation using the average mass spectra and self-made pyrolysis libraries are applied to speed up substance identification. Using specialized evaluation software for pyrolysis GS-MS data, a fast and reliable comparison of the full chromatogram can be achieved. Since GC-MS is used as separation technique, the method is limited to volatile substances upon desorption and after pyrolysis of the sample. The method can be applied for quick substance screening in market control surveys since it requires no sample preparation steps.

This method for two-step pyrolysis online coupled to gas chromatography with mass spectrometric detection and data evaluation protocol can be used for multi-component analysis of tattoo inks and discrimination of counterfeit products.

タトゥーインク成分および偽造製品の同定のための質量分光検出を用いた2段階熱分解-ガスクロマトグラフィー法

Tattoo inks are complex mixtures of ingredients. Each of them possesses different chemical properties which have to be addressed upon chemical analysis. ...

Nitrogen Compound Characterization in Fuels by Multidimensional Gas Chromatography

Certain nitrogen-containing compounds can contribute to fuel instability during storage. Hence, detection and characterization of these compounds is crucial. There are significant challenges to overcome when measuring trace compounds in a complex matrix such as fuels. Background interferences and matrix effects can create limitations to routine analytical instrumentation, such as GC-MS. In order to facilitate specific and quantitative measurements of trace nitrogen compounds in fuels, a nitrogen-specific detector is ideal. In this method, a nitrogen chemiluminescence detector (NCD) is used to detect nitrogen compounds in fuels. NCD utilizes a nitrogen-specific reaction that does not involve the hydrocarbon background. Two-dimensional (GCxGC) gas chromatography is a powerful characterization technique as it provides superior separation capabilities to one-dimensional gas chromatography methods. When GCxGC is paired with a NCD, the problematic nitrogen compounds found in fuels can be extensively characterized without background interference. The method presented in this manuscript details the process for measuring different nitrogen-containing compound classes in fuels with little sample preparation. Overall, this GCxGC-NCD method has been shown to be a valuable tool to enhance the understanding of the chemical composition of nitrogen-containing compounds in fuels and their impact on fuel stability. The % RSD for this method is &#60;5% for intraday and &#60;10% for interday analyses; the LOD is 1.7 ppm and the LOQ is 5.5 ppm.

Here, we present a method utilizing two-dimensional gas chromatography and nitrogen chemiluminescence detection (GCxGC-NCD) to extensively characterize the different classes of nitrogen-containing compounds in diesel and jet fuels.

多次元ガスクロマトグラフィーによる燃料中の窒素化合物の特性解析

Certain nitrogen-containing compounds can contribute to fuel instability during storage. Hence, detection and characterization of these compounds is ...