The authors thank Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study; Mary Jean See, Nancy Schable, and Jenifer Jones of Dynamac Corporation for preparation of BGM cultures; Nichole E. Brinkman, Shannon M. Griffin, Brian R. McMinn, Eric R. Rhodes, Eunice A. Varughese, Ann C. Grimm, Sandhya U. Parshionikar, and Larry Wymer for contributions in the overall evaluation of USEPA Method 1615; Gretchen Sullivan for technical assistance; and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by USEPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

注：定義のリストのための補足的な材料セクションS1を参照してください。 USEPAメソッド1615に関連したQA手順は補足材料セクションS2に記載されています。 1.フィルター溶出手順<ol><li>最初の溶出<ol><li>バッファリング1.5％牛肉エキス、pHが9.0の500ミリリットルを置き、メスシリンダー中で室温まで温めました。フィルターカートリッジハウジングを開き、完全に電気陽性フィルターをカバーするために牛肉エキスの十分な量を追加します。フィルターハウジング蓋を交換し、滅菌したビーカーに残った牛肉エキスを注ぎます。 </li><li>接触時間の1分後、その圧力容器または蠕動ポンプを使用して、ゆっくりとフィルターを通して滅菌ビーカーに残っているとともに、ハウジング内の牛肉抽出液を通過させます。 2Lのガラスビーカーに溶出液を収集します。 </li></ol></li><li> 2回目の溶出<ol><li>バッファリング1.5％牛肉エキスの追加の500ミリリットルを使用して、手順1.1を繰り返しますしかし、15分にステップ1.1.2での接触時間を増加させます。 </li><li> 2回目の溶出からの最初の溶出​​からそれを含む2リットルのビーカーに牛肉エキスを追加します。ビーカーに滅菌攪拌棒を追加します。 </li></ol></li></ol> 2.有機凝集濃度の手順<ol><li>少なくとも5分間、0.525％の次亜塩素酸ナトリウムとの組み合わせ型pH電極を滅菌します。無菌の dH 2 Oを有する電極をすすぎ、その後、0.05 Mチオ硫酸ナトリウムで脱塩素。 pHが4と7標準を使用してpH計を校正。 </li><li>撹拌プレート上で溶出液を入れたビーカーを置きます。プレートをオンにして、渦が形成されるまで攪拌速度を上げます。 </li><li>溶出液に1.2 M HClを滴下することにより、ゆっくりと3.5±0.1に溶出液のpHを調整します。急速な添加は、ウイルスを不活性化するため、塩酸滴下を追加します。沈殿物が形成し始めるようこの間の溶出液が白濁します。 </li><li>混合SPEを削減ゆっくりと攪拌に編し、その後30分間、室温で3.5±0.1で溶出液のpHを監視し、維持し続けます。 </li><li> 4℃で2500×gで15分間一つ以上の遠心ボトルや遠心分離機に沈殿した牛肉エキス懸濁液を注ぎます。遠心機からボトルを取り出して、いずれかの吸引またはゆっくりペレット状の沈殿物の損失を防ぐために、上清をデカントします。上清を捨てます。 注：沈殿物の量と質で牛肉エキスのロット間のかなりの変動がある場合もあります。他のロットからそれが困難で溶解しながら、いくつかのロットから生成した沈殿物を迅速に溶解します。 </li><li>沈殿物を含む遠心ボトルに、0.15Mリン酸ナトリウムの30ミリリットルを追加します。 <ol><li> 0.15 Mリン酸ナトリウム、5分以内に溶解牛肉​​エキスロットからの沈殿物のためのpH 9.0を使用してください。沈殿物が完全に溶解した後、10分間攪拌し、その後、2.7のステップにすぐ進みます。 </li><li>他のすべての沈殿物のために0.15 Mリン酸ナトリウム、pHが7.0から7.5を使用してください。 、またはより困難な沈殿物のために溶解するために10〜15分間攪拌し、オービタルシェーカー上で160 rpmで沈殿物を振盪することにより、ピペットで攪拌中に繰り返し上下ソリューションを描くことによって、滅菌スパチュラでそれらを破ります、またはこれらの手順の組み合わせによって。 注：複数の遠心分離ボトルを使用して、リン酸ナトリウム未満の30ミリリットルを使用して沈殿物を結合した​​後、1瓶やビーカーに沈殿物を合成後のボトルをすすぐために30ミリリットルの残りの部分を使用します。 </li><li>合わせた沈殿物を平底遠心分離ボトル内にある場合、瓶に攪拌棒を加えます。 2.6.5に進みます。 </li><li>合わせた沈殿物が円錐形の底部を有する遠心分離ボトル内にある場合は、小さなガラスビーカーにそれを転送し、ビーカーにスターラーバーを追加します。 </li><li>マグネチックスターラー上に瓶やビーカーを置き、PRまで攪拌ecipitateは完全に溶解しました。 </li><li> 0.525％の次亜塩素酸ナトリウムとの組み合わせ型pH電極を再滅菌し、工程2.1に記載のように0.05 Mチオ硫酸ナトリウムを用いて脱塩素。 pHは7と10の規格を使用してpH計を校正。ゆっくりと、1M NaOHで9.0に完全に溶解させ、沈殿物のpHを調整した後、10分間攪拌します。 </li></ol></li><li>攪拌棒を外し、4,000-10,000×gで、4℃で10分間溶解した沈殿物を遠心分離します。 </li><li>ペレットを乱さないように注意しガラスビーカーに上清を注ぎます。ビーカーに攪拌棒を追加し、ペレットを捨てます。 </li><li>マグネチックスターラー上にビーカーを置き、溶液をかき混ぜます。 7.0から7.5にpHを調整するのが賢明1.2 M HClのドロップを追加します。 </li><li>フィルターは、1.5％牛肉エキスの15ミリリットル、0.05 Mグリシン、pHが7.0〜7.5で前処理されたプレフィルターを含む滅菌フィルターを通過させることにより、上清を滅菌します。 </li><li>アッセイサンプルVolumE（S）の計算。 <ol><li>空白空白ラボ要塞を除くすべての試験サンプルおよびラボ試薬のためにSを計算するために使用する式（1）、 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq1.jpg" width="100" />式（1） D（アッセイしたオリジナル水試料の体積）は、地下水の500 Lであり、TSV（総サンプル量）は、フィールドサンプルの量は、実験室で受信された5インチ陽電カートリッジフィルター、およびFCSV（最終濃縮サンプルボリューム）を通過させますステップ2.10でろ過以下の体積です。例では、補足的な材料セクションS4.1に示されています。 </li><li>そしてブランクラボ試薬（LRB、 すなわち 、試薬グレードの水を使用して、負の品質管理）0.3によってFCSVを乗じて、ブランクラボ要塞（ すなわち 、シードされた試薬グレードの水を使用して、正の品質管理LFB）のためにSを計算します。 </li></ol></li><li> THREにFCSVを分割Eのサブサンプル。 <ol><li> 1.04倍アッセイサンプル量と同量のサブサンプル1と2を準備します。彼らは、全培養可能なウイルスアッセイ（サブサンプル1、ステップ4）を用いて分析または24時間内の分子アッセイ（図示せず）のために処理することができない場合は-70℃以下にこれらのサブサンプルを凍結します。それ以外の場合は、4℃で保持します。 </li><li>で、または-70℃以下に残りの容量（サブサンプル3）をフリーズします。 </li></ol></li><li> 10でSを分割することにより種菌の体積を計算します 。 </li></ol> 3.総培養可能なウイルス素量アッセイ注：すべての手順については、常に細胞単層を乱さないように注意してくださいソリューションを追加します。 <ol><li>デカントまたは3-6日後に分割でBGM細胞の単層を含む試験容器から吸引メディアとその後除去メディアに等しい平衡塩溶液の量を追加します。 </li><li>細胞培養TEからバランスのとれた塩溶液をデカントまたは吸引目の容器を使用し、次いで、細胞培養試験容器に接種されました<ol><li> （補足材料セクションS2.4）総培養可能なウイルス量子アッセイ対照と一緒に接種物の容積に等しいサブサンプル1の体積で各試験サンプルのための10試験容器を接種します。 </li><li> LFBとラボ強化さサンプルマトリックス（LFSM; すなわち 、播種水マトリックスサンプル）の場合は、希釈剤としてサブサンプル3および0.15 Mリン酸ナトリウム、pHが7.0から7.5を使用して5-、25-、および125倍希釈液を準備します。希釈液を作製するための手順の一例を補足材料セクションS3に示されています。ステップ3.2.1で希釈していないサブサンプル1を接種した血管に加えて、各試験容器に接種物のボリュームを使用して、各希釈系列のための10洗浄した細胞培養試験容器を接種します。 </li><li>インキュベーションの14日後、すべての10連でCPEを持っている（ステップ3.2.2に接種したもの以外の）ステップ3.2.1から任意の試験サンプルについては、事前に（ステップ3.3を参照してください）5-、25-、および125-を削減する、とサブサンプル3の625倍希釈液を接種10は、全培養可能なウイルス量子の新しいセットと一緒に各試験容器に接種物のボリュームを使用して、各希釈系列のための細胞培養試験容器を洗浄しアッセイ対照（補足材料セクションS2.4）。 </li><li>前後に血管を傾けることによって、細胞単層の表面上に接種物を配布します。存在する任意のウイルスを細胞に吸着することができるように、すべての15-20分1-5振動/分で、または血管の揺り動かしながら機械的ロッキングプラットフォーム上で80-120分間室温で試験容器をインキュベートします。 </li><li>予め温め維持培地を追加し、36.5±1℃で試験容器をインキュベートします。 </li></ol></li><li>最初の3日間、毎日顕微鏡を用いて、各試験容器内のCPEの出現を探し、その後、またはに設定冷凍庫に≥75％のCPEを示す日までの14転送任意の試験容器2〜3日ごとにそれらを調べます以下-70℃です。最終日に血管を調べた後-70℃以下に残りのすべての文化や総培養可能なウイルス量子アッセイ対照をフリーズします。 </li><li>すべての文化を解凍し、0.2μmの滅菌フィルターを通してすべてのCPE陽性試験容器からの媒体の≥15％をフィルタリングします。指定されたボリュームが目詰まりにフィルタを通過することができない場合は、濾過前に1,500-18,000×gで4℃で10分間、培地を遠心します。 </li><li>洗浄BGMの試験容器を使用して、すべての第1通路試験容器の第2の通路を実行します。 <ol><li>すべての負の試験容器から、正の血管から濾過さ媒体から解凍した培地の10％を表し接種量で新しい試験容器を接種します。 </li><li>ステップ3.2.4-3.4.3を繰り返しますが、ステップ3.3で説明したように2 回目に1 回目の通路上の負及び正だった任意の試験容器を凍結します。 3 番目のパスを実行唯一のマイナスアッセイ対照と第2通路内の 1 回目の通過時に負と陽性であった細胞培養物を使用して、2 回目の通過のために説明したように年齢。 </li></ol></li><li>彼らは1 番目と2 番目の通路の両方でCPEまたは、CPEは、第2および第3の通路の両方で、2 番目の通路まで発生していない場合はを表示したときに、ウイルス陽性と個々の試験容器を特定します。 </li><li>すべての試験サンプルのウイルス力価を計算するために、 表S2に示すように設定されたデフォルトのプログラム設定でUSEPAの最確数の電卓を使用します。 <ol><li>入力MPN / mlの値（M mL）および上部（CL UML）と下位（CL 1mLの ）95％信頼限界/ mlの値を決定する計算に各試験サンプルのためのステップ3.6からのウイルス陽性の複製試験容器の数。 </li><li> O式2を使用して対応する試験サンプルのMPN / L値（Mの L）btain。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/52437/52437eq2.jpg" width="100" />式（2） M mLのステップ 3.7でMPN / mlの値であり、Sは、 分析試料の体積であり、そしてDは、 アッセイ され た元の水試料の体積です。 </li><li> M mLの値のCL UML値を代入することにより、上側信頼限界/ Lを計算します。 M mLの値のCL 1mLの値を代入することにより信頼下限/ Lを計算します。計算例は補足材料セクションS4.2に示されています。 </li><li> 0 / D 1≤などの報告M mLの値。例えば、地下水試料の0.002 MPN / L（≤1/500 L）≤。 </li><li> MPNとブランク要塞各ラボの95％信頼限界値とラボのReを計算します第1のSにより計算で得られた値/ mlに乗算した後、0.3によって、結果を分割することによってブランクエージェント。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bradbury, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Source+and+transport+of+human+enteric+viruses+in+deep+municipal+water+supply+wells.">Source and transport of human enteric viruses in deep municipal water supply wells.</a> Environ. Sci. Technol. 47 (9), 4096-4103 (2013).</li><li>Aslan, A., Xagoraraki, I., Simmons, F. J., Rose, J. B., Dorevitch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+adenovirus+and+other+enteric+viruses+in+limited-contact+freshwater+recreational+areas+and+bathing+waters.">Occurrence of adenovirus and other enteric viruses in limited-contact freshwater recreational areas and bathing waters.</a> J. Appl. Microbiol. 111 (5), 1250-1261 (2011).</li><li>Begier, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+outbreak+of+concurrent+echovirus+30+and+coxsackievirus+A1+infections+associated+with+sea+swimming+among+a+group+of+travelers+to+Mexico.">An outbreak of concurrent echovirus 30 and coxsackievirus A1 infections associated with sea swimming among a group of travelers to Mexico.</a> Clin. Infect. Dis. 47 (5), 616-623 (2008).</li><li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming,+2001.">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li><li>Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+gastroenteritis.">Norovirus gastroenteritis.</a> N.Engl.J. Med. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li><li>Khetsuriani, N., Lamonte-Fowlkes, A., Oberst, S., Pallansch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterovirus+surveillance--United+States.">Enterovirus surveillance--United States.</a> MMWR Surveill. Summ. 55 (8), 1-20 (2006).</li><li>Sawyer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enterovirus+infections:+diagnosis+and+treatment.">Enterovirus infections: diagnosis and treatment.</a> Semin. Pediatr. Infect. Dis. 13 (1), 40-47 (2002).</li><li>Abzug, M. J., Finn, A., Pollard, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteroviruses:+an+emerging+infectious+disease?+The+real,+the+speculative+and+the+really+speculative.">The enteroviruses: an emerging infectious disease? The real, the speculative and the really speculative.</a> Hot Topics in Infection and Immunity in Children. , (2008).</li><li>Harris, J. P., Edmunds, W. J., Pebody, R., Brown, D. W., Lopman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deaths+from+norovirus+among+the+elderly,+England+and+Wales.">Deaths from norovirus among the elderly, England and Wales.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1546-1552 (2008).</li><li>Ho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Epidemic+of+Enterovirus+71+Infection+in+Taiwan.">An Epidemic of Enterovirus 71 Infection in Taiwan.</a> New England J. Med. 341 (13), 929-935 (1999).</li><li>Bae, J., Schwab, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+murine+norovirus,+feline+calicivirus,+poliovirus,+and+MS2+as+surrogates+for+human+norovirus+in+a+model+of+viral+persistence+in+surface+water+and+groundwater.">Evaluation of murine norovirus, feline calicivirus, poliovirus, and MS2 as surrogates for human norovirus in a model of viral persistence in surface water and groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (2), 477-484 (2008).</li><li>Ward, R. L., Knowlton, D. R., Winston, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inactivation+of+enteric+viruses+in+fresh+water.">Mechanism of inactivation of enteric viruses in fresh water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 52 (3), 450-459 (1986).</li><li>Kahler, A. M., Cromeans, T. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Source+Water+Quality+on+Chlorine+Inactivation+of+Adenovirus,+Coxsackievirus,+Echovirus,+and+Murine+Norovirus.">Effects of Source Water Quality on Chlorine Inactivation of Adenovirus, Coxsackievirus, Echovirus, and Murine Norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (15), 5159-5164 (2010).</li><li>Dahling, D. R., Wright, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+BGM+cell+line+culture+and+viral+assay+procedures+for+monitoring+viruses+in+the+environment.">Optimization of the BGM cell line culture and viral assay procedures for monitoring viruses in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 51 (4), 790-812 (1986).</li><li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EPA/600/R-95/178.">EPA/600/R-95/178.</a> ICR Microbial Laboratory Manual. , (1996).</li><li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water.">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li><li>USEPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=40+CFR+Parts+141+and+142+Revisions+to+the+Unregulated+Contaminant+Monitoring+Regulation+(UCMR3)+for+Public+Water+Systems+Final+Rule.">40 CFR Parts 141 and 142 Revisions to the Unregulated Contaminant Monitoring Regulation (UCMR3) for Public Water Systems Final Rule.</a> Federal Register. 77 (85), 26072-26101 (2012).</li><li>USEPA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=40+CFR+Part+141+National+Primary+Drinking+Water+Regulations:+Monitoring+Requirements+for+Public+Drinking+Water+Supplies;+Final+Rule.">40 CFR Part 141 National Primary Drinking Water Regulations: Monitoring Requirements for Public Drinking Water Supplies; Final Rule.</a> Federal Register. 61 (94), 24353-24388 (1996).</li><li>Shaw, S., Regli, S., Chen, J., McGuire, M. J., McLain, J. L., Obolensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+occurrence+and+health+risks+in+drinking+water+.">Virus occurrence and health risks in drinking water .</a> Information Collection Rule Data Analysis. , 437-462 (2002).</li><li>Lieberman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microbial monitoring of vulnerable public groundwater supplies. , (2002).</li><li>Lukasik, J., Scott, T. M., Andryshak, D., Farrah, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+salts+on+virus+adsorption+to+microporous+filters.">Influence of salts on virus adsorption to microporous filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 66 (7), 2914-2920 (2000).</li><li>Sedmak, G., Bina, D., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+an+enterovirus+sewage+surveillance+system+by+comparison+of+clinical+isolates+with+sewage+isolates+from+milwaukee,+wisconsin,+collected+august+1994.">Assessment of an enterovirus sewage surveillance system by comparison of clinical isolates with sewage isolates from milwaukee, wisconsin, collected august 1994.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (12), 7181-7187 (2003).</li><li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water.">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77 (10), 3500-3506 (2011).</li><li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water.">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li><li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples:+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies.">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> J Appl Microbiol. 115 (1), 1-11 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

USEPAメソッド1615 17（UCMR3）未規制汚染物質の監視規則の第三の監視サイクル中に使用するために開発され、主に地下水にウイルスの発生を測定するために設計されました。これは、情報収集ルール（ICR）法、15,18と共通のステップ数を共有するが、2つの小さな違いがあります。両方とも、最確数（MPN）の計算に基づいている定量でBGM細胞の単層上でCPEを生成するウイルスを測定するための量子アッセイを使用しています。方法1615が、様々な水マトリックスからウイルスを濃縮するための新しい電気陽性のフィルタの使用を可能にし、細胞培養試験容器の数が20から両方の軽微な変更は、方法全体のコストを削減10に希釈ごと複製減少します。反復数の減少は、労働力を減少させるが、わずかに低い検出限界をもたらします。地下水が地表水よりもウイルスの低い濃度を有することが期待されるものの、19,20番目アッセイしたサンプルの電子の量が違いを部分的に補償する、地表水の5倍です。少ない繰り返しの使用が最も地表水には十分だろうが、いくつかは、サンプル希釈が必要になります。 方法1615は、いくつかの重要なステップと制限があります。牛肉抽出物は、ロットごとに異なります。記載されているように各ロットは、ウイルスの溶出および二次濃縮工程を経てウイルス濃度の能力の有効性について試験されるべき補足材料セクションS2.3です。この方法は、BGM細胞培養物に接種し、ウイルス力価を決定するために試料の量を計算するための正確な公式を使用します。これらの式は厳密に従わない場合は不正確な結果が生成されます。適切な無菌技術は、細胞培養物を維持するために使用されなければなりません。 14日間のインキュベーション期間の間に苦痛を示す非感染BGM細胞培養コントロールは、おそらく細胞培養の維持の問題を示しています。細心の注意はまた、TAでなければなりません交差汚染を避けるための接種及び細胞培養フラスコに培地添加に伴うピペッティングステップの間ケン。補足材料セクションS2で説明した品質管理を厳格に守る必要があります。セクションS2はまた、品質問題のトラブルシューティングに関するアドバイスを提供します。 フィルタを電気陽性するウイルス吸着の主要なメカニズムは、フィルター上の正電荷の強さとその等電点に関連したウイルスの負電荷の強さと21をテストされている水のpHに関連する電荷相互作用です。フィルターからの溶出はまた、これらの相互作用の強さに影響されます。彼らはウイルス型の間であっても、同一タイプ内の菌株によって異なるため、フィルターからの溶出は一様ではありません。これは、任意の結果は環境水中に存在するウイルスの実際のレベルを過小評価してもよいことを意味します。単一BGM細胞株の使用は、ウイルスの発生を過小評価します。範囲主にポリオウイルスとエンテロウイルスB種の血清型だけでなく、いくつかのレオ14,15,22に限定され、この細胞株でCPEを生成することができます腸内ウイルスの。他の感染性ウイルスの型は検出されません。 地面と試薬グレード水からのポリオウイルスの回収率は、両方の性能評価のためのUSEPAメソッド1615パフォーマンス受け入れ基準を満たした（PE;開始前にアナリストの性能を評価するために使用されているアナリストに未知の力価を有する、すなわち 、シードされた試薬グレードの水サンプル研究の）とLFBサンプル（補足材料表S1）。培養の手順を使用して地下水から58％回収は、水道水23,24を使用して他の人が報告したものと同様です。変動係数100％の（CV）と111％とLFBサンプルからの平均回収率はまた、PEのサンプルについて観察されたものよりも高いにもかかわらず、メソッド性能受け入れ基準を満たしたDURICRをる。 ICRは、平均intralaboratory回収率は85％（; ICR PEデータベースからの未発表データのCV 58〜131％）に36から変化させながら、施設間回収率は92％の変動係数（CV）で56％であったわけ。高い回収率がより高い種子サンプル（122 42対％）の場合よりも低いシードLFBのサンプルについて、本研究で観察されました。 ICRは、計画された時点で、それは、低いシード値を受信したPEのサンプルを、それらの高い種を受信することがより低い回収率を有するであろうことが予想されました。 LFBサンプルについてここで観察されたものと同様の、ICR PEサンプルのポリオウイルスの回収は、シード値の（CV 100％）、54％（CV 69％）、44％（CV 71％）71％であった≤300MPN、300-それぞれ1500 MPN、および&gt; 1500 MPN、。 水試料25中の感染性ウイルスを測定するための多くの方法があります。この方法は、標準化の程度の他の方法に関してで重要です。標準化は、品質と性能のコントロールが含まれていないだけで、だけでなく、すべての分析ラボは、同一の方法を実行することを確実にするために定義されているボリュームと数式を使用しています。標準化せず、実験室全体で結果を比較することは困難であり、複数の分析研究室における大規模な研究を行う際に、従って標準化が不可欠です。内蔵の標準化と、この方法は、追加のウイルス型および細胞株が含まれるように、将来的に拡張することができます。研究は、メソッドへのアデノウイルスの混入のためのデータを提供するために進行中です。

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.
The penultimate sentence of the last paragraph of the Representative Results section was changed from:
 These controls performed similarly with a mean recovery of 111% and a coefficient of variation of 100% (Figure 2), 
 
 to: 
 
 These controls had a mean recovery of 82% and a coefficient of variation of 110% (Figure 2).
 
The third sentence of the fourth paragraph of the Discussion section was changed from:
 The mean recovery from the LFB samples of 111% with a coefficient of variation (CV) of 100% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR, 
 
 to: 
 
 The mean recovery from the LFB samples of 82% with a coefficient of variation (CV) of 110% also met the method performance acceptance criteria even though they are higher than that observed for PE samples during the ICR.

A correction was made to: <a href="www.jove.com/video/52437">EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay</a>. The values for Reagent Grade Water shown in Figure 2 were changed from a mean value of 111% with a standard error of 8% to a mean value of 82% with a standard error of 26%.

Erratum: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

腸溶性ウイルスはヒトの腸のシステムに感染し、糞口経路を介して送信されるウイルスの多様なグループです。これらのウイルスは、下水処理場や浄化槽排水、不適切に設計された、または壊れた浄化槽、壊れた下水道、合流式下水道のオーバーフロー、および他のポイントとの非点源1-4を介して表面と地面の水を入力してください。水性ウイルスからヒトへの感染および疾患は、汚染されたか、不十分な消毒した水の消費を介して、またはレクリエーションの水との接触を介して起こります。病気の症状が重度の胃腸炎に軽度伴ってもよいです。結膜炎;熱;上部呼吸窮迫。手足口病。心筋炎;無菌性髄膜炎;脳炎;麻痺;敗血症5-8、および死亡9,10。 USEPAメソッド1615は、環境や飲料水中の感染性腸内ウイルス粒子を測定するための手順を提供します。これらの水は含めることができます感染性および非感染性ウイルス粒子の混合物が、唯一の感染性​​粒子は、潜在的な健康被害をもたらします。感染性ウイルス粒子は、タンパク質カプシドの完全性の喪失、太陽光から起因するUV放射線への核酸の損傷、および11-13存在することができる任意の消毒剤による損傷から環境や飲料水の中で時間をかけて感染性を失います。メソッドで提供される総培養可能ウイルスの手順はバッファローミドリザル腎臓（BGM）細胞株における細胞変性効果（CPE）の生産に基づいています。この細胞株は、検出された感染性ウイルスの種類の範囲を特定のエンテロウイルス15に主に制限されていても、なぜなら環境ウイルス学の分野14,15におけるその広範な使用を選択しました。本稿の目的は、5インチの電気陽性カートリッジフィルターの溶出、二次濃度、および全培養可能なウイルスの測定のための方法1615の手順を記述することです。の評価全体的な方法はCashdollar ら 16に記載されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="624">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:120px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:149px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Beef extract, desiccated powder</td>
			<td style="width:120px;">BD Bacto</td>
			<td style="width:143px;">211520</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Cryogenic tubes</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:143px;">3775/945373</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Hank&#8217;s balanced salt solution</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">14170-112</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Mechanical rocking platform</td>
			<td style="width:120px;">Daigger</td>
			<td style="width:143px;">EF4907G</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Orbital shaker</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:143px;">14-285-729</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sterilizing filter with prefilter</td>
			<td style="width:120px;">VWR</td>
			<td style="width:143px;">28143-295</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sterilizing syringe filter</td>
			<td style="width:120px;">Corning</td>
			<td style="width:143px;">431219</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">pH Standards</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">33643, 33646, 33648</td>
			<td style="width:149px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">MEM</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">M1018 or M4642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Leibovitz L-15</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">L4386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Sodium bicarbonate, 7.5%</td>
			<td style="width:120px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:143px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:143px;">10082-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td style="width:120px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:143px;">15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Trypsin, EDTA</td>
			<td style="width:120px;">Invitrogen</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epa method 1615. measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and rt-qpcr. ii. total culturable virus assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

ウイルスは、3つの飲料水処理プラント及び電気陽性のフィルタを使用して、プライベートものソース地下水から濃縮しました。フィールドサンプルとLFSM制御からなる2つのサンプルセットは、別々の機会に処理プラントから回収し、一つのサンプルセットは、プライベートウェルから収集しました。各サンプルで使用される種子のMPN値を正確に起因し決定することができなかったため、全体的なウイルス回収は計算から除外された植物やプライベートウェル（1工場と別の1サンプルからの2つのサンプルの2からLFSMサンプルを用いて決定しました複製のフラスコの中で異常なCPE結果）へ。地下水試料からのポリオウイルスの回収は79％（ 図2）16の変動係数58％の平均を意味します。何の培養可能なウイルスは、重複播種していない地下水フィールドサンプルのいずれにおいても検出されませんでした。 この方法の性能はまた、LFB Sを用いて測定しました。二つの異なる種のレベルを使用して変更amples。ポリオウイルス1,000 MPNがで性能を試験するために使用されたのポリオウイルスの300 MPNの「低」力価は、USEPAメソッド1615 A​​ &quot;ハイ&quot;力価で使用される「標準的な」500 MPN LFBレベルより低いレベルでの性能を評価するために使用されましたLFSM制御のレベル。これらのコントロール111％で、平均回収率100％の変動係数（ 図2）と同様に行います。すべてのLRBサンプルは陰性であったし、すべてのLFBサンプルが合格範囲（補足材料表S1）内で行います。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig1.jpg" /> 図1のフィルタ溶出カートリッジフィルターを溶出するための圧力容器を使用するための概略図が示されています。正の空気圧は、カートリッジハウジングコン介して圧力容器内の牛肉抽出液を押し出すために使用され電気陽性カートリッジフィルターをtaining。蠕動ポンプは、牛肉抽出液を保持する容器内に配置され、ポンプの入口を、​​圧力容器の代わりに用いることができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig2.jpg" /> 地上から図2.平均ポリオウイルス回復（％）および試薬グレード水。平均回収率は、地上からのポリオウイルスのために示されています（ <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig3.jpg" /> ; N = 4）および試薬グレード水（ <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52437/52437fig4.jpg" /> ; N = 12）のサンプル。 12試薬グレードの水サンプルは、6が300 MPNを播種し、6は、ポリオウイルスの千MPNを播種含まれています。エラーバーは標準誤差を表します。

Watch this Scientific Journal Video about EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay at JoVE.com

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

エンテロウイルスと文化とRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615計測。 II。総培養可能なウイルスアッセイ

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

8.7K ビュー.  U.S. Environmental Protection Agency. Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

ビデオ: EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

水からのウイルス濃度のため、小容量の手順

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

環境学

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated HF183 marker. The EntHF183 duplex dPCR (referred as EntHF183 dPCR hereon) assay uses the same primer and probe sequences as its published individual quantitative PCR (qPCR) counterparts. Likewise, the same water filtration and DNA extraction procedures as performed prior to qPCR are followed prior to running dPCR. However, the duplex dPCR assay has several advantages over the qPCR assays. Most important, the dPCR assay eliminates the need for running a standard curve and hence, the associated bias and variability, by direct quantification of its targets. In addition, while duplexing (i.e. simultaneous quantification) Enterococcus and HF183 in qPCR often leads to severe underestimation of the less abundant target in a sample, dPCR provides consistent quantification of both targets, whether quantified individually or simultaneously in the same reaction. The dPCR assay is also able to tolerate PCR inhibitor concentrations that are one to two orders of magnitude higher than those tolerated by qPCR. These advantages make the EntHF183 dPCR assay particularly attractive because it simultaneously provides accurate and repeatable information on both general and human-associated fecal contamination in environmental waters without the need to run two separate qPCR assays. Despite its advantages over qPCR, the upper quantification limit of the dPCR assay with currently available instrumentation is approximately four orders of magnitude lower than that achievable by qPCR. Consequently, dilution is needed for measurement of high concentrations of target organisms such as those typically observed following sewage spills.

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay that can be used to simultaneously quantify Enterococcus spp. and the HF183 genetic markers as indicators of general and human-associated fecal contamination in recreational waters.

の同時定量のための二重デジタルPCRアッセイ<em&gt;エンテロコッカス属。</em&gt;およびWatersにおけるヒトの糞便関連HF183マーカー

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP、のための改良INEX方法<em&gt;その場で</em&gt;微粒子と溶解した化合物の測定は、アクティブサスペンションフィーダによって処理します

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide (GFH), with little effort and high reliability. The phosphonate, e.g., nitrilotrimethylphosphonic acid (NTMP), is brought into contact with the GFH in a rotator in a solution buffered by an organic acid (e.g., acetic acid) or Good buffer (e.g., 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) [MES] and N-cyclohexyl-2-hydroxyl-3-aminopropanesulfonic acid [CAPSO]) in a concentration of 10 mM for a specific time in 50 mL centrifuge tubes. Subsequently, after membrane filtration (0.45 &#181;m pore size), the total phosphorus (total P) concentration is measured using a specifically developed determination method (ISOmini). This method is a modification and simplification of the ISO 6878 method: a 4 mL sample is mixed with H2SO4 and K2S2O8 in a screw cap vial, heated to 148-150 &#176;C for 1 h and then mixed with NaOH, ascorbic acid and acidified molybdate with antimony(III) (final volume of 10 mL) to produce a blue complex. The color intensity, which is linearly proportional to the phosphorus concentration, is measured spectrophotometrically (880 nm). It is demonstrated that the buffer concentration used has no significant effect on the adsorption of phosphonate between pH 4 and 12. The buffers, therefore, do not compete with the phosphonate for adsorption sites. Furthermore, the relatively high concentration of the buffer requires a higher dosage concentration of oxidizing agent (K2S2O8) for digestion than that specified in ISO 6878, which, together with the NaOH dosage, is matched to each buffer. Despite the simplification, the ISOmini method does not lose any of its accuracy compared to the standardized method.

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide, with little effort and high reliability. In a buffered solution, the phosphonate is brought into contact with the adsorbent using a rotator and then analyzed via a miniaturized phosphorus determination method.

最適化された小型リン定量法を用いた粒状水酸化第二鉄に酸の吸着を確認する手順

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

ティラピア湖ウイルスを使用して従来 RT-PCR および SYBR の検出グリーン Rt-qpcr

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

15窒素分析のためのマイクロプロット設計と植物および土壌サンプル調製

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Electrostatic Method to Remove Particulate Organic Matter from Soil

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of roots and plant material from soil can result in highly variable carbon measurements. Methods to remove the plant material are often limited to the largest, most visible plant materials. In this manuscript we describe how electrostatic attraction can be used to remove plant material from a soil sample. An electrostatically charged surface passed close to dry soil naturally attracts both undecomposed and partially decomposed plant particles, along with a small quantity of mineral and aggregated soil. The soil sample is spread in a thin layer on a flat surface or a soil sieve. A plastic or glass Petri dish is electrostatically charged by rubbing with polystyrene foam or nylon or cotton cloth. The charged dish is passed repeatedly over the soil. The dish is then brushed clean and recharged. Re-spreading the soil and repeating the procedure eventually results in a diminishing yield of particulates. The process removes about 1 to 5% of the soil sample, and about 2 to 3 times that proportion in organic carbon. Like other particulate removal methods, the endpoint is arbitrary and not all free particulates are removed. The process takes approximately 5 min and does not require a chemical process as do density flotation methods. Electrostatic attraction consistently removes material with higher than average C concentration and C:N ratio, and much of the material can be visually identified as plant or faunal material under a microscope.

Removing recently deposited and incompletely decomposed plant material from soil samples reduces the influence of temporary seasonal inputs on soil organic carbon measurements. Attraction to an electrostatically charged surface can be used to quickly remove a substantial amount of particulate organic matter.

土壌から粒子状有機物を除去する静電法

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of ...

A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The rhizosphere chemistry of wetland plants is particularly challenging to capture because of steep oxygen gradients from the roots to the bulk soil. Here a protocol is described that effectively preserves root structure and rhizosphere chemistry of wetland plants through slam-freezing and freeze drying. Slam-freezing, where the sample is frozen between copper blocks pre-cooled with liquid nitrogen, minimizes root damage and sample distortion that can occur with flash-freezing while still minimizing chemical speciation changes. While sample distortion is still possible, the ability to obtain multiple samples quickly and with minimal cost increases the potential to obtain satisfactory samples and optimizes imaging time. The data show that this method is successful in preserving reduced arsenic species in rice roots and rhizospheres associated with iron plaques. This method can be adopted for studies of plant-soil relationships in a wide variety of wetland environments that span concentration ranges from trace-element cycling to phytoremediation applications.

We describe a protocol to sample, preserve, and section intact roots and the surrounding rhizosphere soil from wetland environments using rice (Oryza sativa L.) as a model species. Once preserved, the sample can be analyzed using elemental imaging techniques, such as synchrotron X-ray fluorescence (XRF) chemical speciation imaging.

元素イメージングのための湿地根と根層圏を保存する方法

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The ...