The authors thank Dr. Eric Rhodes for preparing the clones used in the development of Standard curve reagent, Brian McMinn for assistance in sample processing, Larry Wymer for statistical analysis, Dr. Mark Borchardt, U.S. Department of Agriculture, Marshfield, WI, for supplying the Sabin poliovirus serotype 3 used in this study and Dr. H. W. Virgin, Washington University, St. Louis, MO, for murine norovirus. The authors also acknowledge Gretchen Sullivan for assistance in preparation of stock laboratory reagents, Dr. Mohammad Karim for propagation of murine norovirus stocks, and local private well owners and utilities for allowing us to collect water samples. Although this work was reviewed by EPA and approved for publication, it may not necessarily reflect official Agency policy. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

注：使用データシートには、プロトコルのすべてのステップを追跡するために、例えばデータシートは、補足材料表S2、S4に示されています。 1.標準曲線の準備<ol><li> TSMを使用して、2.5×10 8粒子/ mlの濃度になるように、製造業者によって供給された濃度から、それを希釈することにより標準曲線試薬（ 例えば 、アーマードRNA EPA-1615）の作業ストックを準備します（/ mlの2.5×10 8 GC） IIIバッファ。 -20℃で1.5 mlのマイクロ遠心チューブとストアを使用して250μlのアリコートに作業用ストックを分割します。 注 ：代替標準曲線の試薬 ​​として使用するための準備作業のウイルスの株式およびプラスミドの手順については、補足材料プロトコルステップS1を参照してください。 </li><li>作業ストック一定分量の一つ以上を解凍します。 、2.5×10 7の濃度を与え、2.5×10 6、2.5×1.5 mlのマイクロチューブを使用して5〜10倍連続希釈液を調製します10 5、2.5×10 4、2.5×10 3、GC / mlです。 <ol><li> TSM IIIバッファの225μlに2.5×10 8 GC / mlの作業ストックの25μLを追加することで、最初の希釈を準備します。ボルテックスミキサーを使用して、5-15秒間混合します。 </li><li> TSM IIIバッファの225μlにステップ1.2.1で製造した希釈液の25μlのを追加することで、次の希釈を準備します。再び混合し、次の3つの10倍希釈液を準備するために同様のプロセスを続行します。 </li></ol></li><li>標準曲線作業ストックからのRNAとすぐに第3の手順を用いて5希釈液を抽出します。 </li></ol> 2.第三紀濃度<ol><li>上部試料室に、1×PBS、0.2％ウシ血清アルブミン（BSA）の少なくとも10ミリリットルを添加することによって収集された各試料についての遠心濃縮器（分子量30,000カットオフ）を準備します。そのソリューションは、薄いチャネル濃度室を満たしていることを確認した後、4℃でO / Nを保持します。 <ol><li&gt;流体を捨てます。過剰のBSAを除去した後、水を廃棄し、滅菌試薬グレードの水の少なくとも10mlでコンセントレータ1時間をすすぎます。 </li></ol></li><li>別々の遠心濃縮にSに等しい各試験サンプル、アッセイのサンプル量から二水濃縮物の量を追加します。 <ol><li>式1を使用して、Sを計算します <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq1.jpg" /> Dをアッセイオリジナル水試料の容量である場合には、TSVは、総サンプル量で、FCSVは最終濃縮サンプルボリュームです。 Sの計算の例については、補足材料S2を参照してください。 </li></ol></li><li>遠心20スイングバケットローターで4℃で3,000-6,000×gで各試験サンプル - 30分。薄いチャネル濃度室でボリュームを確認してください。 <ol><li>ボリュームは、20分以上再度400μlの、遠心分離機よりも大きい場合。番目のサンプルまで遠心分離し続けます電子薄いチャネル濃度室未満400μlに減少しました。上清を除去しないでください。 </li></ol></li><li>ウイルス回収を増加させるための無菌0.15 Mリン酸ナトリウム、pHは7〜7.5の1mlで遠心濃縮の側面を洗ってください。サンプルが400未満μlに減少されるまで、3,000-6,000×gで、4℃で再び遠心分離。この洗浄工程をさらに1回繰り返します。 </li><li> 、100〜200μlのマイクロピペットを用いて慎重に測定し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブ（ すなわち 、マイクロチューブに200μlのを転送し、残りの流体が完全に描画することができますまで、マイクロピペットを調整することで、残りの濃縮物を測定するために、各濃縮サンプルを転送）ピペット先端に。 0.15 Mリン酸ナトリウム、pHは7〜7.5は400±2μlに最終容量を調整するために、追加します。 </li><li> processeすることはできません任意の濃サンプル3.保留に進むことで、すぐに核酸を抽出dはすぐに超えない24時間4℃で。 </li></ol> 3.核酸単離<ol><li>ラベルされた1.5mlの微小管を分離するために、ステップ1.3からステップ2.5または標準曲線希釈から各試験サンプルから三次濃縮のステップ3.3で説明し、200μlのように調製した抽出緩衝液200μlを追加します。 -70℃以下に残りの三次濃縮液を凍結。以下の例外を除いて、血液試料のスピンプロトコルの核酸抽出キットを製造者の指示に従って、各試料から核酸を抽出します。 </li><li>水試料にプロテアーゼを追加したり、核酸抽出キット付属の抽出緩衝液を使用しないでください。 </li><li>キャリアRNAを抽出緩衝液を準備<ol><li>キャリアRNAの310μgの含有するバイアルにキャリアRNA希釈緩衝液の310μLを加えます。溶解した後、約50μLを含む6アリコートに分割する混ぜます。 -20で保存°C。 </li><li> 0.027μgの/μlとキャリアRNAの濃度を得るための抽出緩衝液1ml当たり解凍したキャリアRNAの28μLを追加します。抽出キットに付属のものの代わりにキャリアRNA-改正抽出緩衝液を使用してください。 </li></ol></li><li>リボヌクレアーゼを添加することにより溶出バッファーのマスター溶液を調製する（RNアーゼ）阻害剤抽出キットで提供される溶出緩衝液への400単位/ mlの最終濃度まで。 <ol><li>カラムにRNaseインヒビターで溶出緩衝液50μlを配置することにより、スピンカラムを結合核酸から溶出RNA。 1分間待ってから、室温で1分間、6,000×gで遠心します。 </li><li>ステップ3.4.1を繰り返し、その後、列を削除し、廃棄します。 </li></ol></li><li>ステップ3.4.2からのRNA抽出物のアリコートを準備します。 6標準曲線作業ストックの一定分量と、少なくとも15μlの各を含む各標準曲線の希釈を準備します。少なくとも含む他のすべてのRNAサンプルの4アリコートを準備22μlの各。それらは4時間以内に逆転写することによって処理することができる場合、4℃で各サンプル、標準曲線コントロールの1つのアリコートを保存し、それ以外の場合は、-70℃以下にすべてのアリコートを保存します。 </li></ol> 4.逆転写（RT） <ol><li> 10倍に等しい（マイクロリットル中）に存在するオリゴヌクレオチドのナノモル（ナノモル）の数量を用いて各バイアルにPCRグレードの水の量を添加することにより、表1にリストされた各オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの100μMストック溶液を調製しますバイアル（バイアルラベルにか、製造元の仕様書に示されるように（例えば、）363μlの36.3ナノモルを含むプライマーを懸濁します。溶解するために混ぜます。 <ol><li>ソリューションの作業10μMのを準備するために、PCRグレードの水で100μMのソリューションを1:10に希釈します。 </li></ol></li><li> 表2のガイドを使用して、クリーンルーム内でのRTマスターミックス1と2を準備します。RT Masteのピペット16.5μLウェルマルチチャンネルピペットを用いて各PCRプレートにミックス1 R。 </li><li>解凍、凍結した場合、各フィールドのサンプルとラボ強化さサンプルマトリックスからの核酸抽出物（LFSM; すなわち 、播種水マトリックス試料）。 <ol><li> RNase阻害剤の400単位/ mlを含有する溶出緩衝液中で5と1：25：各フィールドとLFSMサンプル1を希釈します。 </li><li> 、研究室試薬ブランク（LRB、すなわち、試薬グレードの水を使用して、負の品質管理）、性能評価（PE;解凍、凍結した場合、しかし、ラボ要塞はブランク（ すなわち 、シードされた試薬グレードの水を使用して、ポジティブな品質管理LFB）を希釈していません; すなわち 、播種試薬グレードの水サンプルは、試験の開始前に実験室の性能）、パフォーマンステスト（PTを評価するために使用される; すなわち 、試験中に実験室での性能を評価するために使用される分析者に未知の力価を有する播種試薬グレードの水サンプル）、NAバッチネガティブ抽出制御、または標準曲線のセットからRNAを抽出しました。 </li></ol&gt; </li><li> （RTプレート例については、図S1を参照）試験サンプルおよびコントロールの三重井戸を使用して、別々のPCRプレートのウェルに、すべての試験サンプル、コントロール、および標準曲線からのRNAの6.7μLを置 ​​き、標準曲線のために井戸を複製します。 <ol><li>テンプレートを含まないコントロール（NTC）のための独立したPCRプレートのウェルに溶出緩衝液の6.7μLを置きます。 2-8 RTプレートあたりNTC、最初のサンプルのための2つを使用して、すべての第四の追加のサンプルについて、2つ以上を含みます。 </li><li>プレート全体に負の抽出とNTCコントロールを配布します。 </li></ol></li><li>耐熱プレートシーラーでPCRプレートをシール。 5-10秒間のサンプルを混合した後、≥500×gで簡単に遠心します。 </li><li> 99℃で4分間プレートをインキュベートした後、サーマルサイクラーで4℃に急速に冷却します。 ≥500 XG簡単で再び遠心分離。 </li><li>慎重にプレートシールを除去し、各ウェルにRTマスターミックス2の16.8μlを添加します。セアル≥500×gで混合し、短時間の遠心分離に続いて、耐熱性のプレートシーラー、と再びプレート。 </li><li>サーマルサイクラーでプレートを置き、42℃、99℃で5分、で60分間続いた後、4℃の保持サイクルにより、25℃で15分間実行します。 </li><li>プロセス直ちにまたは定量PCR（ステップ5）、またはストアサンプルで8時間内で以下を-70℃で、それらを処理することが可能になるまで。 4℃で8時間以内に処理することができる店舗のサンプル。 </li></ol> 5.リアルタイム定量PCR（定量PCR） <ol><li>いずれの試験サンプルを実行する前にG型肝炎試薬のロットごとに肝炎G Cqの値を意味するかを決定します。 <ol><li> NTCコントロール（ステップ4.1.1）のために記載したように調製10の反復を用いてRTアッセイを実行します。 （5.5.3までの流れ5.2）以下に説明するように、肝炎GのqPCRアッセイを実行します。 10回の平均はCq値を計算します。 </li><li> RTマスターミックス1中のG型肝炎試薬量を調整した （表2）、必要に応じて、25及び32単位の間の平均Cqの値を取得します。水の容積を変化させることにより上昇または下降量を補償することは、アッセイあたり16.5μLでのRTマスターミックス1最終容量を維持するために追加されました。 </li><li>調整された量を反映するために、5.1.2および変更表2にステップ5.1.1を繰り返して調整を確認してください。 </li></ol></li><li>私は肝炎のためのノロウイルスgenogroup II、マウスノロウイルスについては、表7（ノロウイルスgenogroupのV）、 および表8 は 、表6、ノロウイルスgenogroupためエン ​​テロウイルスについては、表3のガイドを使用して、クリーンルーム内でのqPCRマスターミックスを調製し、 表4 および表5 G.ミックスは、各マスターミックスして、≥500×gで簡単に遠心します。 </li><li>各定量PCRアッセイのためによくし、別々のプレートあたり14μLを使用して、標識された光学反応プレートの適切なウェルにPCRマスターミックスを追加します（図S2 </stron図S1におけるRTのレイアウトに基づいて、定量PCRアッセイのための可能なレイアウトのためのG&gt;）。 </li><li>凍結した場合、室温でステップ4.8からRTプレートを解凍します。プレートミキサーを使用して混合した後、≥500×gで簡単に遠心します。 </li><li>光学反応プレートの適切なウェルに適切なcDNAの6μLを分注します。 ≥500 XG簡単で光反応プレートと遠心機でサンプルを混ぜます。 <ol><li>他のすべてのqPCRアッセイを実行する前に希釈されていないと希釈フィールドとLFSMサンプルの肝炎GのqPCRアッセイを実行します。フィールドまたはあるLFSMサンプル&lt;エンテロウイルスやノロウイルス定量PCRアッセイのための意味肝炎G Cqの値よりも大きい1 Cqを値の最低希釈を使用してください。 </li><li>メーカーの指示に従って定量PCRサーマルサイクラーソフトウェアをセットアップします。標準として標準曲線サンプルを識別し、それぞれの標準曲線希釈に、 表9に示したゲノムコピー値を入力します。 </li><li&gt;は95℃と60℃で1分で15秒間の45サイクル、続いて95℃で10分間定量PCRサーマルサイクラーでプレートを実行します。 </li></ol></li><li>各標準曲線は表10に与えられた許容可能な値を満たしているかどうかを決定します。例については、補足材料セクションS3を参照してください。 <ol><li>式2を使用して、標準曲線の全体的な標準偏差（STDDEV）を算出 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq2.jpg" /> Cqの各標準曲線の複製について報告された値であり、Cqのは複製の各セットの平均値であり、#Cqは正の値（ すなわち 、未確定ではない）を持っているすべての標準コントロールの複製のためのCqを値の合計数であり、＃性感染症は、正の値を持っている標準コントロールの数です。 </li><li>定量PCRサーマルサイクラー・ソフトウェアは、各標準曲線の傾きを計算していない場合は、式3を用いて勾配を計算し、60; <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq3.jpg" /> Cqには、使用される最高と最低の希釈液の平均値であり、GCのログをどこ表9から使用される最高と最低の希釈のためのゲノムコピー値のログです。 </li><li>式4を用いて、R 2の値を計算します。 <img alt="式（4）" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq4.jpg" /> Cqには、すべての Cqを値の平均であるとログGCは各反復の平均ログのGC値です。 </li><li>式（5）使用して％の効率を計算します。 <img alt="式（5）" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq5.jpg" /></li></ol></li><li> 表10に指定された条件と、各サンプルの平均GC値を満たす標準曲線に基づいて、すべてのテストサンプル用のサーマルサイクラーソフトウェアによって計算されたGC値を記録します。で基準を満たしていない標準的な曲線を持つ任意のサンプルを再実行<strong&gt;表10または任意の負のコントロールは（LRB、NAバッチネガティブ抽出制御、またはNTC）が陽性です。再実行する際に判定基準を満たすために失敗したり、偽陽性のコントロールを持っている任意のサンプルを再処理。 </li><li>式6を用いて、各試験サンプルのためリットル当たりGC（GCのL）を決定します。 <img alt="式6" src="/files/ftp_upload/52646/52646eq6.jpg" /> GCは、ステップ5.7からの平均のゲノムコピー数であり、係数「199」は、第三級濃度の間に発生する容量削減の総希釈率で、RNA抽出およびRT-qPCRのステップ、DFは阻害を補償する希釈係数であります、およびDは、リットルでアッセイオリジナル水試料の体積です。 GC Lの計算の例については、補足資料のセクションS4を参照してください。 </li><li> 199により、ステップ5.5からの平均GC値を乗算し、0.3で割って合計LFBのGCおよびLRBのサンプルを計算します。 </li></ol>

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	<li>Borchardt, M. A., Spencer, S. K., Kieke, B. A., Lambertini, E., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+in+nondisinfected+drinking+water+from+municipal+wells+and+community+incidence+of+acute+gastrointestinal+illness.">Viruses in nondisinfected drinking water from municipal wells and community incidence of acute gastrointestinal illness.</a> Environ. Health Perspect. 120 (9), 1272-1279 (2012).</li><li>Ye, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+detection+of+enteric+viruses+in+source+water+and+treated+drinking+water+in+Wuhan,+China.">Real-time PCR detection of enteric viruses in source water and treated drinking water in Wuhan, China.</a> Curr. Microbiol. 65 (3), 244-253 (2012).</li><li>Williamson, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+viruses+in+New+Zealand+drinking-water+sources.">Enteric viruses in New Zealand drinking-water sources.</a> Water Sci. Technol. 63 (8), 1744-1751 (2011).</li><li>Lambertini, E., Borchardt, M. A., Kieke, B. A., Spencer, S. K., Loge, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+of+viral+acute+gastrointestinal+illness+from+nondisinfected+drinking+water+distribution+systems.">Risk of viral acute gastrointestinal illness from nondisinfected drinking water distribution systems.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (17), 9299-9307 (2012).</li><li>Chigor, V. N., Okoh, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+RT-PCR+detection+of+hepatitis+A+virus,+rotaviruses+and+enteroviruses+in+the+Buffalo+River+and+source+water+dams+in+the+Eastern+Cape+Province+of+South+Africa.">Quantitative RT-PCR detection of hepatitis A virus, rotaviruses and enteroviruses in the Buffalo River and source water dams in the Eastern Cape Province of South Africa.</a> Int. J. Environ. Res. Public Health. 9 (11), 4017-4032 (2012).</li><li>Fout, G. S., Martinson, B. C., Moyer, M. W., Dahling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+reverse+transcription-PCR+method+for+detection+of+human+enteric+viruses+in+groundwater.">A multiplex reverse transcription-PCR method for detection of human enteric viruses in groundwater.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (6), 3158-3164 (2003).</li><li>Hewitt, J., Bell, D., Simmons, G. C., Rivera-Aban, M., Wolf, S., Greening, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastroenteritis+outbreak+caused+by+waterborne+norovirus+at+a+New+Zealand+ski+resort.">Gastroenteritis outbreak caused by waterborne norovirus at a New Zealand ski resort.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7853-7857 (2007).</li><li>Jack, S., Bell, D., Hewitt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+contamination+of+a+drinking+water+supply+at+a+hotel+resort.">Norovirus contamination of a drinking water supply at a hotel resort.</a> New Zealand Med. J. 126 (1387), 98-107 (2013).</li><li>Anderson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+waterborne+outbreak+of+Norwalk-like+virus+among+snowmobilers-Wyoming,+2001.">A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers-Wyoming, 2001.</a> J. Infect. Dis. 187 (2), 303-306 (2003).</li><li>Parshionikar, S. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Waterborne+outbreak+of+gastroenteritis+associated+with+a+norovirus.">Waterborne outbreak of gastroenteritis associated with a norovirus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69 (9), 5263-5268 (2003).</li><li>U.S. Environmental Protection Agency Office of Water. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 820-F-12-058: Recreational Water Quality Criteria. , 1-63 (2012).</li><li>Wade, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapidly+measured+indicators+of+recreational+water+quality+and+swimming-associated+illness+at+marine+beaches:+a+prospective+cohort+study.">Rapidly measured indicators of recreational water quality and swimming-associated illness at marine beaches: a prospective cohort study.</a> Environ. Health. 9, 66 (2010).</li><li>Fout, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Method 1615: Measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and RT-qPCR (EPA/600/R-10/181). , 1-91 (2012).</li><li>Cashdollar, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+EPA+Method+1615+for+Detection+of+Enterovirus+and+Norovirus+in+Water.">Development and Evaluation of EPA Method 1615 for Detection of Enterovirus and Norovirus in Water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (1), 215-223 (2013).</li><li>Gibson, K. E., Schwab, K. J., Spencer, S. K., Borchardt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+and+mitigating+inhibition+during+quantitative+real+time+PCR+analysis+of+viral+nucleic+acid+extracts+from+large-volume+environmental+water+samples.">Measuring and mitigating inhibition during quantitative real time PCR analysis of viral nucleic acid extracts from large-volume environmental water samples.</a> Water Res. 46 (13), 4281-4291 (2012).</li><li>Fuentes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+multiplex+one-step+qRT-PCR+for+hepatitis+A+virus,+norovirus+GI+and+GII+quantification+in+bivalve+mollusks+and+water.">Standardized multiplex one-step qRT-PCR for hepatitis A virus, norovirus GI and GII quantification in bivalve mollusks and water.</a> Food Microbiol. 40, 55-63 (2014).</li><li>Coudray, C., Merle, G., Martin-Latil, S., Guillier, L., Perelle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+extraction+methods+for+the+detection+of+hepatitis+A+virus+in+lettuces+using+the+murine+norovirus+as+a+process+control.">Comparison of two extraction methods for the detection of hepatitis A virus in lettuces using the murine norovirus as a process control.</a> J. Virol. Methods. 193 (1), 96-102 (2013).</li><li>Sen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPA 815-B-04-001: Quality assurance/quality control guidance for laboratories performing PCR analyses on environmental samples. , 1-56 (2004).</li><li>Schlueter, V., Schmolke, S., Stark, K., Hess, G., Ofenloch-Haehnle, B., Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+transcription-PCR+detection+of+hepatitis+G+virus.">Reverse transcription-PCR detection of hepatitis G virus.</a> J. Clin. Microbiol. 34 (11), 2660-2664 (1996).</li><li>De Leon, R., Shieh, C., Baric, R. S., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+enteroviruses+and+hepatitis+A+virus+in+environmental+samples+by+gene+probes+and+polymerase+chain+reaction.">Detection of enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples by gene probes and polymerase chain reaction.</a> Proc. Water Qual. Technol. Conf. , 833-853 (1990).</li><li>Monpoeho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+enterovirus+RNA+in+sludge+samples+using+single+tube+real-time+RT-PCR.">Quantification of enterovirus RNA in sludge samples using single tube real-time RT-PCR.</a> BioTechniques. 29 (1), 88-93 (2000).</li><li>Jothikumar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+noroviruses+by+using+TaqMan-based+one-step+reverse+transcription-PCR+assays+and+application+to+naturally+contaminated+shellfish+samples.">Rapid and sensitive detection of noroviruses by using TaqMan-based one-step reverse transcription-PCR assays and application to naturally contaminated shellfish samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (4), 1870-1875 (2005).</li><li>da Silva, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+removal+of+noroviruses+during+wastewater+treatment,+using+real-time+reverse+transcription-PCR:+different+behaviors+of+genogroups+I+and+II.">Evaluation of removal of noroviruses during wastewater treatment, using real-time reverse transcription-PCR: different behaviors of genogroups I and II.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (24), 7891-7897 (2007).</li><li>Butot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+various+real-time+RT-PCR+assays+for+the+detection+and+quantitation+of+human+norovirus.">Evaluation of various real-time RT-PCR assays for the detection and quantitation of human norovirus.</a> J. Virol. Methods. 167 (1), 90-94 (2010).</li><li>Loisy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+RT-PCR+for+norovirus+screening+in+shellfish.">Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish.</a> J. Virol. Methods. 123 (1), 1-7 (2005).</li><li>Reynolds, K. A., Gerba, C. P., Pepper, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+infectious+enteroviruses+by+an+integrated+cell+culture-PCR+procedure.">Detection of infectious enteroviruses by an integrated cell culture-PCR procedure.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62 (4), 1424-1427 (1996).</li><li>Ming, H. X., Zhu, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantification+of+infectious+enterovirus+from+surface+water+in+Bohai+Bay,+China+using+an+integrated+cell+culture-qPCR.">Rapid quantification of infectious enterovirus from surface water in Bohai Bay, China using an integrated cell culture-qPCR.</a> Mar. Pollut. Bull. 62 (10), 2047-2054 (2011).</li><li>Parshionikar, S., Laseke, I., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+propidium+monoazide+in+reverse+transcriptase+PCR+to+distinguish+between+infectious+and+noninfectious+enteric+viruses+in+water+samples.">Use of propidium monoazide in reverse transcriptase PCR to distinguish between infectious and noninfectious enteric viruses in water samples.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (13), 4318-4326 (2010).</li><li>Sanchez, G., Elizaquivel, P., Aznar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+infectious+hepatitis+A+viruses+by+propidium+monoazide+real-time+RT-PCR.">Discrimination of infectious hepatitis A viruses by propidium monoazide real-time RT-PCR.</a> Food Environ. Virol. 4 (1), 21-25 (2012).</li><li>Kim, S. Y., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+propidium+monoazide+to+distinguish+between+viable+and+nonviable+bacteria,+MS2+and+murine+norovirus.">Using propidium monoazide to distinguish between viable and nonviable bacteria, MS2 and murine norovirus.</a> Lett. Appl. Microbiol. 55 (3), 182-188 (2012).</li><li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R., Stetler, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPA/600/R-95/178: ICR Microbial Laboratory Manual, I.1-ApD-23. , (1996).</li><li>Abbaszadegan, M., Stewart, P., LeChevallier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+detection+of+viruses+in+groundwater+by+PCR.">A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), 444-449 (1999).</li><li>Lambertini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+of+enteroviruses,+adenoviruses,+and+noroviruses+from+drinking+water+by+use+of+glass+wool+filters.">Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74 (10), 2990-2996 (2008).</li><li>Rodriguez, R. A., Thie, L., Gibbons, C. D., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+the+effects+of+environmental+inhibition+in+quantitative+real-time+PCR+detection+of+adenovirus+and+norovirus+in+recreational+seawaters.">Reducing the effects of environmental inhibition in quantitative real-time PCR detection of adenovirus and norovirus in recreational seawaters.</a> J. Virol. Methods. 181 (1), 43-50 (2012).</li><li>Iker, B. C., Bright, K. R., Pepper, I. L., Gerba, C. P., Kitajima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+commercial+kits+for+the+extraction+and+purification+of+viral+nucleic+acids+from+environmental+and+fecal+samples.">Evaluation of commercial kits for the extraction and purification of viral nucleic acids from environmental and fecal samples.</a> J. Virol. Methods. 191 (1), 24-30 (2013).</li><li>Fey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+real-time+PCR-based+approach+for+accurate+quantification+of+bacterial+RNA+targets+in+water,+using+Salmonella+as+a+model+organism.">Establishment of a real-time PCR-based approach for accurate quantification of bacterial RNA targets in water, using Salmonella as a model organism.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3618-3623 (2004).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water.">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> J. Water Health. 9 (1), 27-36 (2011).</li><li>Kim, M., Ko, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+characterization+of+the+inhibitory+effects+of+salt,+humic+acid,+and+heavy+metals+on+the+recovery+of+waterborne+norovirus+by+electropositive+filters.">Quantitative characterization of the inhibitory effects of salt, humic acid, and heavy metals on the recovery of waterborne norovirus by electropositive filters.</a> J. Water Health. 11 (4), 613-622 (2013).</li><li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water.">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75 (8), 2393-2399 (2009).</li><li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses,+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater.">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> J. Appl. Microbiol. 109 (2), 635-641 (2010).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ソースと飲料水のウイルス汚染の大規模国家の研究では、複数の分析ラボを使用する必要があります。これらの条件下での標準的な方法は、複数の研究室で生成されたデータが比較可能であることを保証するために必要とされます。ウイルス検出のための多くの公表された分子的方法が、非常に少数の標準化された分子の方法があります。 EPAメソッド1615は、具体的には、RT-qPCRにより水マトリックス中エンテロウイルスやノロウイルスの検出のために設計された標準化された方法です。 16,17と春に肝炎の検出ウイルスとノロウイルスに適用されている。標準化された分子法は、食品（2013年4月7日CEN / ISO TS 15216から1とCEN / ISO TS 15216から2）でウイルス検出のために利用可能です水16。すべての標準的な方法は、実験室による汚染に間およびイントラ実験室変動や偽陽性のデータを最小限にするために品質性能のコントロールや基準を含める必要があります。さらに、Eを誤ったデータを低減するために、PA法1615は、処理し、一方通行の作業の流れの間に仕事の分離を定めた分子法のEPAの指導、18の後に続きます 。これは、G型肝炎1,19内部統制およびRT-qPCRの15の阻害剤に起因する偽陰性の結果を最小限に抑えるための手順が含まれています。これは、すべてのフィールドデータがフィールド1リットル当たりのゲノムコピーで表現または飲料水をサンプリングするようにサンプリングし、水を分析し、両方の水の標準化されたボリュームと一緒に定量的アッセイを使用しています。効率的な単一の管（ワンステップ）RT-PCRアッセイは、市販されているが、この方法は、意図的に独立したアッセイを使用します。これは、各反応でアッセイすることができる試料の量を最小化するという欠点を有しているが、複数のプライマーセットを使用することでより大きな柔軟性を与えます。 RT-のqPCRアッセイは、によって制限され、のみ使用プライマーおよびプローブと同じくらい良い、おそらく何のプライマーセットは、グループ内のすべてのウイルスの亜種を検出しませんされています。エンテロウイルスプライマーセットがあるため選ば​​れましたそれは、20,21はエンテロウイルス血清型の多種多様を検出し、それによって検出されたウイルスは、未処理の地下1の消費による健康への影響に関連している、保存された5 &#39;非コード領域を標的とします。二つのプライマーセットは、Iが22,23 genogroupノロウイルスの検出のために使用されます。最初は、若い子供の健康への影響との間には強い相関関係に起因して選択し、ウイルス1を検出しました。彼らは株24,25の広い多様性を検出するので、私はプライマーセット第genogroupとgenogroup IIノロウイルスに使用するプライマーセットを選択しました。 水の中のウイルスRNAを検出するための定量PCRおよびRT-qPCRの手順の主な利点にもかかわらず、いくつかの制限があります。まず、消毒剤によって不活性化されるものを含む感染性および非感染性両方のウイルス粒子は、これらの方法によって増幅することができます。 Borchardtの結果は、これが未処理の地下水fの問題のあまりであることを示唆しています地域社会と同様のROMの帯水層は、消毒地表水1の場合よりも勉強しました。培養可能なウイルスのため、この問題は、培養物26,27との組み合わせでPCRを使用して克服することができます。この問題はまた、核酸架橋剤28-30の使用を介していくつかのウイルスの対処されてきました。この後者のアプローチは、ウイルス、次亜塩素酸により不活性化し、UVにより不活性化にとって有効ではないため、より効果的です。 これらの分子の手順の第2の制限は、典型的にアッセイすることができる濃縮試料の量は、培養手順6,31に使用されるものよりもはるかに小さいことです。この問題は、多くの場合、いずれかのサンプルは小さい体積中に再懸濁し、又は第三のサンプル濃縮工程6,32,33を添加することによってすることが可能な有機凝集による二次標準濃度のためのポリエチレングリコールベースの手順を置換することによって処理されます。方法1615は、centrifを使用していますugal限外ろ過は、第三級の濃度を提供します。遠心限外濾過、水と試験サンプル中の任意のウイルスの両方の濃度および分子アッセイの小分子インヒビターが低下コンポーネント30,000未満ダルトンを除去します。水中に存在した任意のウイルスのための&gt; 10 5の全体的な濃縮係数のこの三次濃縮工程の結果がテストされています。 第三の制限は、環境試料中の分子の手順の阻害剤の存在です。阻害剤を除去するための多くのアプローチが開発されてきたが、何のアプローチは、本質的な阻害のレベルを推定するように設計された内部対照を利用して、すべての水マトリックスおよびウイルス型6,34,35のために有効ではありません。この方法で使用される肝炎G試薬は、すべての反応および抑制を推定するためのRT-qPCRのアッセイにおいて、ウイルスRNAの一定のレベルを提供することによって、この要件を満たします。とき、tの最高の彼は、サンプル濃縮物は限りウイルス濃度は、濃度14,15阻害剤よりも高くなっているように希釈することができ、除去アプローチは阻害を削除することができない阻害剤。 本明細書中に記載の標準曲線の手順は、利点と主要な制限の両方を持っています。利点は、試薬が、単一の制御は、全てのアッセイに使用されることを可能にする、単一の試薬に供給するに必要なすべてのコンポーネントを使用することです。この試薬は、特にノロウイルスアッセイのために有利です。ノロウイルス粒子は、それが非常に困難な標準として使用するためのウイルス粒子を得ることができる感染した個体から得ることができます。多くの重要な利点は、RNA標準は、RNA 36の正確な定量化のために不可欠であるものとして、それは、一つの試薬 ​​のすべての標的のRNAウイルスのRNA標準を提供することです。しかし、正確にウイルスを定量する能力は、マトリックス効果は考慮されないという事実によって制限されます。これは、ゲノムのコピーを意味します数値は、絶対的とみなすことができず、相対的な用語でのみ考慮されるべきです。これは、標準曲線ワーキングストックのアリコートの十分な数（ステップ1.2）は、完全な研究をカバーするために準備することをお勧めします。例えば、各250μlのアリコートを6 RTプレートに十分な試薬を提供します。それは研究が500サンプルの分析が必要になることが知られている場合、12のアリコートの最小値は、（アリコートあたりRTプレート/ 6 RTプレートあたり500サンプル/ 7サンプル）を必要とされるであろう。 EPAメソッド1615は、パフォーマンスベースの方法です。多くのメーカーは、本明細書で指定されたものと同等の試薬を作り、これらの試薬があれば、性能基準が満たされているように置換され得ます。また、正のRT-qPCRのコントロールとして機能し、標準曲線は、パフォーマンスの問題のトラブルシューティングを行うには価値があります。性能は、RNAの分解、試薬貯蔵寿命、冷凍庫の故障、機器のキャリブレーション、および技術的なエラーに辞退することができます。パフォーマンスの問題が容疑者でなければなりませんこれらは標準曲線のための性能仕様を満たさない場合、EDは、標準曲線を図4に示したものと異なる場合、または。 RT-のqPCRアッセイは、非常に堅牢です。完全な失敗は、RNAまたは技術的なエラー（たとえば、欠けている試薬）の不適切な取り扱いに起因する可能性が高いです。細心の注意は、リボヌクレアーゼからRNAの分解を低減するために、抽出し、RT工程間のRNAサンプルの取り扱いに注意が必要です。 地下から地上と試薬グレードの水およびマウスノロウイルスの回収からポリオウイルスの回収率は、EPAメソッド1615の性能受け入れ基準（ 表11）を満たし、他33,37,38によって報告されたものと類似しています。 LFBサンプルからのマウスノロウイルスの回収率は、ポリオウイルスのものよりはるかに低かったとポリオウイルス固有の合格基準を満たしていないだろう。試薬グレードの水から下のマウスノロウイルスの回復の理由は不明です。本明細書の結果と同様に、カリムとcolleaゲスは、水道水39から4％のノロウイルスGI.1の回復を報告しました。リーら 37は、マウスノロウイルスと18％の人間ノロウイルスGII.4それぞれ、ディスクフィルターを用いて蒸留水から26％の平均回収率を報告しました。リーや同僚と同様の条件を用いて、金とコはそれぞれ38、これらのウイルスのために46％と43％の回収率を観察しました。ギボンズら 40海水からのヒトノロウイルスGII.4の回収率100％を中心に得られるが、キムとコ38は、類似または海水よりも高い濃度で蒸留水に塩を添加すると、著しくマウスウイルスの回収率を低下させ、得られたことがわかりましたGII.4回復で約2倍の減少です。

定量的PCR（定量PCR;この原稿で使用される用語の定義については、補足資料を参照）、逆転写定量PCR（RT-qPCRを）は、環境や飲料水の中に人間の腸内ウイルスを検出し、定量化するため、特に行う多くのウイルスのための貴重なツールであります複製または細胞培養系では不十分複製しません。どちらのツールは、多くのウイルス型は世界1-6全体の環境や飲料水の中に存在していることを実証しました。彼らは飲料水で見つかったウイルスが流行患者7-10によって流されたものと同一であることが示されているような疾患のアウトブレイク調査の間に増幅されたゲノム断片の塩基配列決定と相まってこれらの使用は、水性ウイルス伝播の証拠を提供してきました。 定量PCRおよびRT-qPCRの両方が便利な公衆衛生上のツールです。例えば、米国環境保護庁（EPA）によって行われた研究からのデータは強い関係があることが示されました定量PCRやレクリエーション水域における健康影響によりトゥイーン指標の測定。その結果、EPAの最終2012レクリエーション水質基準は、レクリエーションビーチ11,12を監視するための定量PCR法を含んでいます。 RT-qPCRの1によって測定されるようにBorchardtらはまた、地下水に未処理の地下水やウイルスを使用して、地域社会における急性胃腸炎との間に強い関連性を発見しました。 本稿の目的は、EPAメソッド1615 13,14の分子アッセイ成分を記述することです。このアッセイは、陽電フィルタを通過し、環境や飲料水の元の体積に基づいてリットル当たりエンテロウイルスとノロウイルスゲノムコピー（GC）の定量的な推定値を提供するために、RT-qPCRのを使用しています。分子の手順の概要を図1に示されている。プロトコル部1は、標準曲線を調製するための手順を詳述します。これらの規格は、RNが含まれている試薬から調製されます全てのプライマー/プローブセットの標的配列のコピー。第2節では、第三級濃度の手順を説明します。第3節では、濃縮水と対照試料からRNAを抽出するための手順を説明します。各試験サンプルからのRNAを逆三重アッセイおよびプライム転写（第4）のランダムプライマーを使用して転写されます。 （; 図2第5項）、各逆転写反応からcDNAをqPCRにより三重に分析されている5つの別々のウイルス特異的なアッセイに分割されます。アッセイは、多くのエンテロウイルスとノロウイルスおよびRT-qPCRを15に阻害されている試験サンプルを同定するためのG型肝炎RNAを含む試薬を検出するように設計されている科学文献（ 表1）からのプライマーおよびプローブを使用します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL tube chamber</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CHAM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#176;C cool brick</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>BRIK-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X PCR Buffer II and 25-mM MgCl2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>N8080130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-20 &#176;C freezer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97043-346</td>
			<td>Must be a manual defrost freezer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70 &#176;C or colder freezer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MBF700LSAO-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well chamber</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CHAM-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2818-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armored RNA EPA-1615</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>Custom order</td>
			<td>Used for quantifying the RT-qPCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Armored RNA Hepatitis G virus</td>
			<td>Asuragen</td>
			<td>42024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Steris</td>
			<td>Amsco Lab Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>NuAir Laboratory Equipment Supply</td>
			<td>Labgard 437 ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>10856</td>
			<td>Crystalline grade or better</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AVE</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1026956</td>
			<td>Carrier RNA dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer AVL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19073</td>
			<td>Extraction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carrier RNA</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Use carrier RNA supplied with Buffer AVL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-562-23 or 05-562-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge rotors</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>339080, 336380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cool safe box</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CSF-BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler&#174; 480 Probes Master kit</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>4707494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-550</td>
			<td>Use ribonuclease- and deoxyribonuclease-free tubes with snap caps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcide III</td>
			<td>Fitzgerald</td>
			<td>99R-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;A&#39; film</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>HSA5001</td>
			<td>Heat resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal &#39;F&#39; film</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>MSA1001</td>
			<td>Freezer resistant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-plate spinner</td>
			<td>Labnet International</td>
			<td>MPS1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>L8-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-tube chamber</td>
			<td>Diversified Biotech</td>
			<td>CHAM-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical reaction plate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4314320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR nucleotide mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>U1515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>HSS9601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR-grade water</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3315932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>U.S. Biological</td>
			<td>D9820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate mixer</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>MicroPlate Genie</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prionex gelatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G0411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>Includes Buffers AW1 (first wash buffer), AW2 (second wash buffer), AE (elution buffer); ethanol must be added to Buffers AW1 and AW2 before use; Do not use Buffer AL supplied with the kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative PCR thermal cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4351405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Random primer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>C1181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Reservoir</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-381-27E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>367501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2515 or N2615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX reference dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript II or III Reverse Transcriptase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18064-022 or 18080044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-058-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4314879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator units</td>
			<td>Sartorius-Stedim</td>
			<td>VS2022</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

epa method 1615. measurement of enterovirus and norovirus occurrence in water by culture and rt-qpcr. part iii. virus detection by rt-qpcr

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

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EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

epa-method-1615-measurement-enterovirus-norovirus-occurrence-water

Research

JoVE Journal

Environment

12.6K ビュー.  U.S. Environmental Protection Agency. Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

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A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

水からのウイルス濃度のため、小容量の手順

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

環境学

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

エンテロウイルスと文化とRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615計測。 II。総培養可能なウイルスアッセイ

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted through ion exchange. The resultant production bleed water (PBW) contains contaminants such as arsenic and other heavy metals. Samples of PBW from an active ISR uranium facility were treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs). CuO-NP treatment of PBW reduced priority contaminants, including arsenic, selenium, uranium, and vanadium. Untreated and CuO-NP treated PBW was used as the liquid component of the cell growth media and changes in viability were determined by the MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay in human embryonic kidney (HEK 293) and human hepatocellular carcinoma (Hep G2) cells. CuO-NP treatment was associated with improved HEK and HEP cell viability. Limitations of this method include dilution of the PBW by growth media components and during osmolality adjustment as well as necessary pH adjustment. This method is limited in its wider context due to dilution effects and changes in the pH of the PBW which is traditionally slightly acidic&#160;however; this method could have a broader use assessing CuO-NP treatment in more neutral waters.

Removal of Trace Elements by Cupric Oxide Nanoparticles from Uranium In Situ Recovery Bleed Water and Its Effect on Cell Viability

Production bleed water (PBW) was treated with cupric oxide nanoparticles (CuO-NPs) and cellular toxicity was assessed in cultured human cells. The goal of this protocol was to integrate the native environmental sample into a cell culture format assessing the changes in toxicity due to CuO-NP treatment.

ウランの酸化銅ナノ粒子による微量元素の除去<em&gt;その場での</em&gt;回復ブリード水と細胞生存率への影響

In situ recovery (ISR) is the predominant method of uranium extraction in the United States. During ISR, uranium is leached from an ore body and extracted ...

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

VacuSIP, an Improved InEx Method for In Situ Measurement of Particulate and Dissolved Compounds Processed by Active Suspension Feeders

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

VacuSIP、のための改良INEX方法<em&gt;その場で</em&gt;微粒子と溶解した化合物の測定は、アクティブサスペンションフィーダによって処理します

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide (GFH), with little effort and high reliability. The phosphonate, e.g., nitrilotrimethylphosphonic acid (NTMP), is brought into contact with the GFH in a rotator in a solution buffered by an organic acid (e.g., acetic acid) or Good buffer (e.g., 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) [MES] and N-cyclohexyl-2-hydroxyl-3-aminopropanesulfonic acid [CAPSO]) in a concentration of 10 mM for a specific time in 50 mL centrifuge tubes. Subsequently, after membrane filtration (0.45 &#181;m pore size), the total phosphorus (total P) concentration is measured using a specifically developed determination method (ISOmini). This method is a modification and simplification of the ISO 6878 method: a 4 mL sample is mixed with H2SO4 and K2S2O8 in a screw cap vial, heated to 148-150 &#176;C for 1 h and then mixed with NaOH, ascorbic acid and acidified molybdate with antimony(III) (final volume of 10 mL) to produce a blue complex. The color intensity, which is linearly proportional to the phosphorus concentration, is measured spectrophotometrically (880 nm). It is demonstrated that the buffer concentration used has no significant effect on the adsorption of phosphonate between pH 4 and 12. The buffers, therefore, do not compete with the phosphonate for adsorption sites. Furthermore, the relatively high concentration of the buffer requires a higher dosage concentration of oxidizing agent (K2S2O8) for digestion than that specified in ISO 6878, which, together with the NaOH dosage, is matched to each buffer. Despite the simplification, the ISOmini method does not lose any of its accuracy compared to the standardized method.

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric hydroxide, with little effort and high reliability. In a buffered solution, the phosphonate is brought into contact with the adsorbent using a rotator and then analyzed via a miniaturized phosphorus determination method.

最適化された小型リン定量法を用いた粒状水酸化第二鉄に酸の吸着を確認する手順

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

ティラピア湖ウイルスを使用して従来 RT-PCR および SYBR の検出グリーン Rt-qpcr

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. A stable isotope approach is necessary to follow and quantify the fate of fertilizer derived N (FDN) through the soil-crop system. The purpose of this paper is to describe a small-plot research&#160;design utilizing non-confined 15N enriched microplots for multiple soil and plant sampling events over two growing seasons and provide sample collection, handling, and processing protocols for total 15N analysis. The methods were demonstrated using a replicated study from south-central Minnesota planted to corn (Zea mays L.). Each treatment consisted of six corn rows (76 cm row-spacing) 15.2 m long with a microplot (2.4 m by 3.8 m) embedded at one end. Fertilizer-grade urea was applied at 135 kg N&#8729;ha-1 at planting, while the microplot received urea enriched to 5 atom % 15N. Soil and plant samples were taken several times throughout the growing season, taking care to minimize cross-contamination by using separate tools and physically separating unenriched and enriched samples during all procedures. Soil and plant samples were dried, ground to pass through a 2 mm screen, and then ground to a flour-like consistency using a roller jar mill. Tracer studies require additional planning, sample processing time and manual labor, and incur higher costs for 15N enriched materials and sample analysis than traditional N studies. However, using the mass balance approach, tracer studies with multiple in-season sampling events allow the researcher to estimate FDN distribution through the soil-crop system and estimate unaccounted-for FDN from the system.

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

A microplot design for 15N tracer research is described to accommodate multiple in-season plant and soil sampling events. Soil and plant sample collection and processing procedures, including grinding and weighing protocols, for 15N analysis are put forth.

15窒素分析のためのマイクロプロット設計と植物および土壌サンプル調製

Many&#160;nitrogen fertilizer studies evaluate the overall effect of a treatment on end-of-season measurements such as grain yield or cumulative N losses. ...

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in vegetable production annually. Phytophthora capsici is soil-borne and a persistent problem in vegetable fields due to its long-lived survival structures (oospores and chlamydospores) that resist weathering and degradation. The main method of dispersal is through the production of zoospores, which are single-celled, flagellated spores that can swim through thin films of water present on surfaces or in water-filled soil pores and can accumulate in puddles and ponds. Therefore, irrigation ponds can be a source of the pathogen and initial points of disease outbreaks. Detection of P. capsici in irrigation water is difficult using traditional culture-based methods because other microorganisms present in the environment, such as Pythium spp., usually overgrow P. capsici making it undetectable. To determine the presence of P. capsici spores in water sources (irrigation water, runoff, etc.), we developed a hand pump-based filter paper (8-10 &#181;m) method that captures the pathogen&#8217;s spores (zoospores) and is later used to amplify the pathogen&#8217;s DNA through a novel loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay designed for the specific amplification of P. capsici. This method can amplify and detect DNA from a concentration as low as 1.2 x 102 zoospores/mL, which is 40 times more sensitive than conventional PCR. No cross-amplification was obtained when testing closely related species. LAMP was also performed using a colorimetric LAMP master mix dye, displaying results that could be read with the naked eye for on-site rapid detection. This protocol could be adapted to other pathogens that reside, accumulate, or are dispersed via contaminated irrigation systems.

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

We developed a method to detect Phytophthora capsici zoospores in water sources using a filter paper DNA extraction method coupled with a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay that can be analyzed in the field or in the lab.

ループ媒介等熱増幅を用いた灌漑水中フィ トフトーラカプシ の検出

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Electrostatic Method to Remove Particulate Organic Matter from Soil

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of roots and plant material from soil can result in highly variable carbon measurements. Methods to remove the plant material are often limited to the largest, most visible plant materials. In this manuscript we describe how electrostatic attraction can be used to remove plant material from a soil sample. An electrostatically charged surface passed close to dry soil naturally attracts both undecomposed and partially decomposed plant particles, along with a small quantity of mineral and aggregated soil. The soil sample is spread in a thin layer on a flat surface or a soil sieve. A plastic or glass Petri dish is electrostatically charged by rubbing with polystyrene foam or nylon or cotton cloth. The charged dish is passed repeatedly over the soil. The dish is then brushed clean and recharged. Re-spreading the soil and repeating the procedure eventually results in a diminishing yield of particulates. The process removes about 1 to 5% of the soil sample, and about 2 to 3 times that proportion in organic carbon. Like other particulate removal methods, the endpoint is arbitrary and not all free particulates are removed. The process takes approximately 5 min and does not require a chemical process as do density flotation methods. Electrostatic attraction consistently removes material with higher than average C concentration and C:N ratio, and much of the material can be visually identified as plant or faunal material under a microscope.

Removing recently deposited and incompletely decomposed plant material from soil samples reduces the influence of temporary seasonal inputs on soil organic carbon measurements. Attraction to an electrostatically charged surface can be used to quickly remove a substantial amount of particulate organic matter.

土壌から粒子状有機物を除去する静電法

Estimations of soil organic carbon are dependent on soil processing methods including removal of undecomposed plant material. Inadequate separation of ...