The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.

摂食細菌の調製注：このセクションでは、給紙細菌（ 大腸菌株 OP50）の調製を記載する。 <ol><li> Eの単一コロニーを分離無菌的にLB培地（LB）寒天プレートとから大腸菌株 OP50は、オートクレーブしたLBブロス300mlに接種する。 </li><li>飽和状態に達するまでに接種培養は、200rpmで、37℃でシェーカーで一晩増殖させる。 </li><li> 6無菌、予め秤量した50ミリリットルコニカルチューブにOP50を転送します。 6000 RPM（5000 XG）で5分間遠心分離することによって細菌をペレット化。 </li><li>上清を捨て、滅菌したM9 50mlで細菌を洗う。二回繰り返します。 </li><li>第二回目の洗浄後何M9がチューブ内に残っていないことを確認して、残りのM9を削除します。 </li><li>細菌ペレットを含むチューブを計量することによってペレットの重量を測定し、50ミリリットルコニカルチューブの重量を差し引く。 </li><li>ペレットIを再懸濁nはM9に100mg / mlの濃度で。 </li><li>それはワーム培養に使用されるまで4℃でOP50ソリューションを保管してください。 </li></ol>線虫成長培地（NGM）ペトリ皿の調製注：このセクションでは、C.プレートであるNGMペトリ皿、の調製を記載elegansのワームは、日常的に研究室で維持されている。 <ol><li> NGM寒天培地をオートクレーブ。 </li><li>滅菌手順を使用して、蠕動ポンプを使用して6センチメートルペトリプレートにNGM寒天溶液17mlを分注する。 注：プレート内の寒天の一定量を別のプレートから切り替えるときに顕微鏡を再集束の必要性を低減。 </li><li>寒天が固化してみましょうと余分な水分を蒸発できるようにするため、使用前に2〜3日間室温でプレートにしておきます。 </li><li>無菌技術を用いたNGMプレートをシード。 OP50液体培養の1-2滴を適用し、ガラス棒を用いて拡散。ことを確認していないすべての道のプレートの端に細菌の芝生を広げます。 </li><li> OP50の芝生がワームを成長させるのプレートを使用する前に、室温で1〜2日間増殖することを許可する。 </li></ol>同期ワーム人口の調製注：Cのライフサイクル虫は胚段階、4幼虫期（L1-L4）と成人期から構成されている。このセクションでは、ワームの年齢同期人口の製造を記載し​​ている。漂白処理後の線虫と接触する全ての材料は、無菌でなければならない。 <ol><li> 1日目- 、妊娠ワーム人口の調製 <ol><li>ワームの人口の大半が飢餓のL1幼虫で構成されているNGMプレートを使用してください。 </li><li>滅菌ワームとのL1幼虫が選ぶ収集し、新鮮に6cm NGMプレートにそれらを転送するには、OP50を播種。ワームの大半は妊娠大人になるまで20℃で約65時間インキュベートする。へプレート過密を回避し、ワームは細菌を破壊することなく成長させる、各新鮮なNGMプレートにL1幼虫の1つまたは2つ以上のクラスタを転送しないでください。 </li></ol></li><li> 4日目-シンクロナイズドL1幼虫人口の確立 <ol><li> M9 1-2 mlのそれらを洗浄することにより、NGMプレートから妊娠ワームを収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。 </li><li>妊娠ワームは約5〜10分間15ミリリットルコニカルチューブの底に沈降してみましょう。ワームペレットを乱すことなく、上清を取り除きます。 </li><li> 2-4マイクロ遠心チューブにワームペレットを移し、漂白剤/ NaOH溶液1ミリリットルを追加します。 RTで2〜3分間インキュベートする。死んでいるすべてのワームを確認するために、実体顕微鏡下で反応の進行状況を監視します。胚が死ぬことができるようになりましたが5分を漂白しないでください。 </li><li> 3000 RPM（900 XG）で1分間遠心分離することにより、ワームを収集します。上清を除去し、滅菌M9の1ミリリットルを追加反応を中和する。 </li><li> 3000 RPM（900 XG）で1分間遠心分離することにより、二回のワームを洗ってください。 </li><li>上清を除去し、最大で100〜200μlにM9を追加。 </li><li>ガラスパスツールピペットを使用すると、NGMプレートをクリアして、胚が孵化することを可能にするために20℃で少なくとも24時間のためにそれらをインキュベートするワーム/ M9ミックスのドロップを追加。 注：食べ物がないと幼虫の成長がL1段階で停止されます。 </li></ol></li><li> 5日目-シンクロナイズドL4幼虫人口の確立 <ol><li> M9 1-2 mlのプレートを洗浄することにより明確なNGMプレートからのL1幼虫を収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。 </li><li>約5分間の15ミリリットルコニカルチューブの底に死んだ成虫の堆積物をしましょう​​。 </li><li>新しい円錐形​​の15ミリリットルチューブ内のL1虫である上清を、収集し、2600 RPM（1,000 XG）で2分間遠心分離することによりワームを沈殿させる。 </li><li>上清ルを削除約500μlのAVING。 </li><li>実体顕微鏡を使用してドロップ10μlのワームの数をカウントすることによりM9溶液中のワームの濃度を決定する。少なくとも5滴を数える。 </li><li> 20-25ワーム/μlにワームの濃度を調整し、NGMプレートにワーム/ M9ミックス50μlのを追加OP50を播種。 </li><li>彼らはL4段階に到達するまでに成長するL1同期化された人口を可能にするために（週末を通してインキュベーションのために）15℃で65時間インキュベートする。 </li></ol></li></ol> 96ウェルプレート中で化学物質へのワームの4暴露注：このセクションでは、Pxol1の使用が記載されている:: Cを含むGFP転写レポーターエレガンス株は、異数性の誘導のためにスクリーニングする。 <ol><li> M9 1-2 mlのプレートを洗浄することにより明確なNGMプレートからL4幼虫を収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。 </li><li> L4ワームの底に沈降してみましょう約5〜10分間15ミリリットルコニカルチューブ。ワームペレットを乱すことなく、上清を取り除きます。 </li><li> M9 3〜5 mlを加え実体顕微鏡を用いて10μlの滴でワームの数をカウントすることによりM9溶液中のワームの濃度を決定する。各サンプルについて少なくとも5滴を数える。 </li><li> M9 1000ワーム/ mlの濃度でワームを再懸濁する。 </li><li> M9でセクション1の10倍からOP50細菌を希釈する。より低い温度では、ワームの開発に影響を与えるために再懸濁させ、細菌が室温に達することを確認してください。 </li><li>マルチチャンネルピ ​​ペットを用いて、第一（ステップ8.8）ワーム/ M9ミックス100μlのを追加し、2ミリリットル深い丸底96ウェルプレートの各ウェルに（ ステップ4.5から）で希釈OP50細菌の400μlを添加する。最後に、各ウェルを500μlの100ワームを持つことになります。 </li><li>提案され、最終的なconcentrを達成するために、被験化学物質または所望のウェルに適切な制御のどちらかの0.5μLを追加します。100μMのationが、濃度は一般的にCの化学画面で使用虫 12。 0.1％の最終濃度でエタノールまたはDMSO溶媒対照を公開します。 注：我々は、陽性対照としてノコダゾール（100μM）の使用をお勧めします。 </li><li>接着フィルムを使用してプレートをシール。ウェル間のクロスコンタミネーションを防ぐためにウェルプレートをシールしてください。 </li><li>アルミホイルでプレートを包みます。 </li><li>時間の適切な長さのために適切な温度（24または65時間）のシェーカー（170〜180 RPM）にプレートを転送します。部屋の温度は、ワームの成長に影響を与えます。 20℃前後の温度を維持する。 </li></ol> 384ウェルプレート中で、妊娠ワームの5.画像取得注：このセクションでは、大人の雌雄同体の子宮内の胚におけるGFPの発現を可視化するために、画像さらさPxol1 :: GFPワームに高いコンテンツ顕微鏡の使用が記載されている。のためにスクリーニングされる各384ウェルプレートに、4×96ウェルプレートからワームを使用する。 <ol><li>シェーカー中の化学暴露後に、10〜15分間、96ウェルプレートの残りは成虫がプレートの底に沈降することを可能にすることができます。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて、プレートの底にワームを邪魔しないように非常に気をつけながら、M9の350μlのを削除します。 </li><li> M9の1ミリリットルを繰り返しステップ5.1でワームを洗ってください。 </li><li>マルチチャンネルピペットを用いて、プレートの底にワームを乱さないVEYように注意しながら、M9の1ミリリットルを削除します。 </li><li>マルチチャンネルピペットを使用して、残りのM9にワームを再懸濁し、96ウェルプレートからワーム/ M9ミックス100μlのを収集し、黒壁/透明底384ウェルプレートのウェルにロードします。 384ウェルプレートの全てのウェルがロードされるまで、4×96ウェルプレートからワームを使用してプロセスを繰り返す。 注：すべてのウェルに増加させるために、同じ体積を有することが重要である画像取得プロセス中にオートフォーカスの効率と速度。各ウェルを80から100のワームとの間で含まれている必要があります。 </li><li>各ウェルにレバミゾール（100μM）の1μl加え、ワームは、約30分間インキュベートしましょう​​。 NOTE：レバミゾールアセチルコリン受容体アゴニストとして作用し、ワームを固定する。 </li><li>自動化されたイメージングを提供することが可能な広視野高含量顕微鏡にプレートに移す。 </li><li>画像取得のために、製造業者のガイドラインに従って高含量画像収集および解析ソフトウェアを使用します。ウェルあたり1画像を取得する4X対物レンズを選択する。 </li><li>画像取得を開始する前に、xは2160 2160への曝露と画像解像度の45ミリ秒にGFPの撮像パラメータを調整する。 </li><li>ウェル中のワームの総数で割ったGFP陽性虫の数などのデータを収集し、後者の指標は、ウェル間の比較的一貫している。 </li></ol>

<ol>
	<li>Office, U. G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+No.+GAO-06-1032T.">Report No. GAO-06-1032T.</a> Actions are needed to improve the effectiveness of EPA&#8217;s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).</li><li>Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+abnormalities+in+the+human+oocyte.">Chromosome abnormalities in the human oocyte.</a> Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).</li><li>Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy+in+humans:+incidence,+origin+and+etiology.">Trisomy in humans: incidence, origin and etiology.</a> Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).</li><li>Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deaths:+final+data+for+2006.">Deaths: final data for 2006.</a> Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).</li><li>Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meiosis+in+mammals:+recombination,+non-disjunction+and+the+environment.">Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).</li><li>Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome-counting+mechanisms+that+determine+nematode+sex.">X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex.</a> Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).</li><li>Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+msh-5+is+required+for+both+normal+and+radiation-induced+meiotic+crossing+over+but+not+for+completion+of+meiosis.">Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis.</a> Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).</li><li>Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Screening+Platform+for+the+Rapid+Assessment+of+Chemical+Disruption+of+Germline+Function.">A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function.</a> Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).</li><li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).</li><li>Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Medium-+and+high-throughput+screening+of+neurotoxicants+using+C.+elegans.">Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans.</a> Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ここで説明する方法は、生殖系列の毒物を同定するための最初の大規模な戦略を構成する。それは忠実に生殖細胞機能障害のためのプロキシとして使用されている初期胚で異数性の誘導を報告したGFPトランスジェニックPxol-1 :: GFP含む株を使用する必要があります。この方法は、Cの慎重な同期を伴う虫ワームの人口と自動化ハイコンテンツ顕微鏡によってGFP陽性ワームの?...

米国では商業用に登録さ約87000薬品、これらは潜在的な健康への影響1のためにテストされたのまだごく少数があります。テストされたもののうち、一部のみ、特に女性の生殖細胞の発生および分化の間、哺乳動物における早期の生殖イベントの変更を決定する際の困難さに一部起因生殖健康への影響について評価された。確かに、最初の減数分裂事象は、雌の哺乳類における胚発生の初期段階で行われ、スクリーニング目的に適した番号にアクセスして収集することは困難である。 生殖細胞は、世代間の重要なリンクを提供し、その適切な機能は、細胞の染色体分裂の複雑なプログラム減数分裂と呼ばれるの正確な実行に依存している。減数分裂プロセスの調節不全が減少生殖能力との産生をもたらす可能性染色体の異常な数の配偶子および胚は、条件が異数性と呼ばれる。減数分裂における染色体の分離エラーが人間の健康に非常に関連しています。染色体異常は1〜150で出生の頻度、21トリソミー、18と13だけでなく、最も一般的なタイプ2,3であるXとY染色体のエラーで、共通している。さらに、染色体の起源のものを含め先天性奇形は、環境の影響は、染色体分離や行動に影響を与えることができるという考えは5新しいものではないが、それでも十分に理解されていない米国4で乳児死亡の主要な原因である。それは人間の生殖能力、初期の開発および全体的な生殖に関する健康に干渉している私たちの環境に導入された化学物質のどの調査することが重要である。 哺乳動物モデルのこれらの制限に照らして、我々は、回虫生殖毒性を試験するためのハイスループットスクリーニングアッセイを開発した&lt;EM&gt; C。エレガンス。我々は、その小さなサイズ、低コスト、短い再生サイクル、生殖細胞の割合が高いと操作6の容易として一般的に使用される遺伝モデルシステムによって提供されるいくつかの重要な機能を動員している。ワームは、96ウェルプレートに、または大量の液体培養で増殖することができ、それらの透明性を直接蛍光レポーターを検出するためにプレート上に結像することができる。以下に記載のアッセイは、これらの特性を利用して、蛍光レポーターPxol-1を含むウォーム株を活用:: GFPの胚の異数性の生殖細胞を破砕した誘導を検出すること。 このレポーター株の使用は、主に雌雄同体のワームの人口の男性の一般的まれな出来事に基づいています。これらの男性（&lt;0.2％）が自然にX染色体7の分離の誤差に由来する。しかし、生殖細胞系列の中断などの頻繁に常染色体の分離におけるエラーにつながるそしてheterochromosomesのではなく、男性の表現型（Xの分配異常）ならびに胚性致死（常染色体の分配異常）の高められた発生率との両方を相関させる。胚の致死性の問題を回避しながら、容易に雄の誘導を検出するために、雄特異的プロモーター（XOL-1）は、依然としてワームの子宮内に含まれる初期胚におけるGFPの発現を駆動するために使用される。このように、GFPを発現する胚の外観は、異数性胚の存在のためにプロキシとして使用される。この方法は、以前に生殖細胞維持および分裂8,9に関与する遺伝子を同定するために使用されている。化学物質のスクリーニングに適合し、この菌株は、ハイスループットスクリーニングに媒体中で使用される。重要なことは、株は忠実に化学物質のaneugenicityを報告し、そのための哺乳動物の生殖エンドポイント10に関連している。ここに記載のアッセイは、見て、製薬および化学産業の設定で毒物学者に特に有用であろう急速生殖エンドポイントに向かっての化学物質の毒性を評価した。さらに、このアッセイは、完全に21世紀のレポート11に毒性で強調表示政府の優先事項と整合する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="975">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:129px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:255px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm vented, sharp edge Petri Dishes</td>
			<td style="width:129px;">Tritech</td>
			<td>T3315</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Agar</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-274</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:473px;">Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate</td>
			<td style="width:129px;">Corning</td>
			<td>P-DW-20-C-S</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bactopeptone</td>
			<td style="width:129px;">Apex</td>
			<td>20-261</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bacto-tryptone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1421-2</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Bleach</td>
			<td style="width:129px;">Clorox</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>AA12316-A1</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cholesterol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ICN10138225</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">DMSO</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>IC19018680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">E. coli (OP50)</td>
			<td style="width:129px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Ethanol 200 proof</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>EM-4455S</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Greiner CELLSTAR 384 well plates</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1937-32EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageXpress Micro XLS System&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Levamisole hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Fluka</td>
			<td style="width:119px;">31742</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>97061-438</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MetaXpress High Content Image Acquisition &#38; Analysis Software&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Rayon Films for Biological Cultures</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>60941-086</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:473px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S318</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:473px;">Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td style="width:129px;">VWR</td>
			<td>BDH0316</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:473px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ 745</td>
			<td style="width:255px;">This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:473px;">TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain&#160;</td>
			<td style="width:129px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:473px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:129px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">212750</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode caenorhabditis elegans

我々の環境中に存在する化学物質の何千もの生殖毒性を識別することは環境衛生の分野で最も食欲をそそる課題の一つとなっている。これは、（1）正確に生殖過程のキーの機能を再現し、（2）脊椎動物の多数を必要とせず、ハイスループット様式に、中で行うことができ、モデル系の不足に一部起因する。 ここでは、線虫C.でのアッセイを説明異数性胚の誘導を監視することにより、生殖細胞系の毒物の迅速な同定を可能にする虫 。 GFPレポーターラインを利用することにより、生殖細胞の破壊に起因する染色体分離におけるエラーは、容易に自動化蛍光顕微鏡により可視化し、定量化される。したがって、その毒性のための化合物の特定のセットのスクリーニングは、数日のうちに96の384ウェルプレート形式で実施することができる。正hの二次分析その染色体異常が減数分裂の破壊または初期胚染色体分配誤差に由来するかどうかを決定するために行うことができる。要するに、このアッセイは、化学物質曝露後の生殖細胞系の機能障害を迅速に評価するための迅速な初回通過戦略を表す。

このような微小管毒ノコダゾールなどの化学剤に対するPxol-1 :: GFPレポーター株の曝露（ 図1）は、DMSO対照と比較して露出した成体雌雄同体の子宮におけるGFP発現胚の高い割合の誘導を導く。 GFP陽性胚は、他の胚だけでなく、動物の腸内で観察された自家蛍光で観察弱いバックグラウンド蛍光よりも有意に明るい。露出されたワームは、直接384ウェルプレート上に結像され...

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Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

8.0K ビュー.  University of California, Los Angeles. We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

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Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

化学物質安全性のスクリーニングおよびシステム生物学データの生成のために発生毒性アッセイベースのヒト多能性幹細胞

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

発生生物学

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and seawater. Tests of the toxicity of chemicals and assessments of their ecological risks to aquatic organisms are frequently performed in freshwater, but the toxicity of chemicals to aquatic organisms depends on pH, temperature, and salinity. There is no method, however, for testing the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we used medaka (Oryzias latipes) because they can adapt to freshwater, brackish water, and seawater. Different concentrations of embryo-rearing medium (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, and 30x) were employed to test the toxicity of silver nanocolloidal particles (SNCs) to medaka eggs (1x ERM and 30x ERM have osmotic pressures equivalent to freshwater and seawater, respectively). In six-well plastic plates, 15 medaka eggs in triplicate were exposed to SNCs at 10 mg/L&#8722;1 in different concentrations of ERM at pH 7 and 25 &#176;C in the dark.
We used a dissecting microscope and a micrometer to measure heart rate per 15 sec and eye diameter on day 6 and full body length of the larvae on hatching day (section 4). The embryos were observed until hatching or day 14; we then counted the hatching rate every day for 14 days (section 4). To see silver accumulation in embryos, we used inductively coupled plasma mass spectrometry to measure the silver concentration of test solutions (section 5) and dechorionated embryos (section 6).The toxicity of the SNCs to medaka embryos obviously increased with increasing salinity. This new method allows us to test the toxicity of chemicals in different salinities.

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

メダカの卵を使用したシルバーナノコロイドの塩分依存毒性アッセイ

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

で活躍ERKの時空間解析<em&gt; C。エレガンス</em&gt;生殖細胞系列

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

線虫ニューロンの細胞内輸送を分析するための固定化

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are facilitated by the transparency of the animal, the ability to do forward and reverse genetic assays, the relative ease of generating fluorescently labeled proteins, and the use of fluorescent dyes that can either be microinjected into the early embryo or incorporated into its food (E. coli strain OP50) to label cellular organelles (e.g. 9-diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazine-5-one and (3-{2-[(1H,1&#39;H-2,2&#39;-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))methylidene]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimethylamino)ethyl]propanamidato)(difluoro)boron). Here, we present the use of a fluorescent pH-sensitive dye that stains intestinal lysosomes, providing a visual readout of dynamic, physiological changes in lysosomal acidity in live worms. This protocol does not measure lysosomal pH, but rather aims to establish a reliable method of assessing physiological relevant variations in lysosomal acidity. cDCFDA is a cell-permeant compound that is converted to the fluorescent fluorophore 5-(and-6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein (cDCF) upon hydrolysis by intracellular esterases. Protonation inside lysosomes traps cDCF in these organelles, where it accumulates. Due to its low pKa of 4.8, this dye has been used as a pH sensor in yeast. Here we describe the use of cDCFDA as a food supplement to assess the acidity of intestinal lysosomes in C. elegans. This technique allows for the detection of alkalinizing lysosomes in live animals, and has a broad range of experimental applications including studies on aging, autophagy, and lysosomal biogenesis.

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

A step-by-step guide to probe loss of lysosomal acidity in the intestine of C. elegans using the pH-sensitive vital dye 5(6)-carboxy-2&#39;,7&#39;-dichlorofluorescein diacetate (cDCFDA)

腸の生きている線虫のライソゾーム アルカリ化を評価します。

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

チミジン アナログ エドゥと線虫の生殖における細胞周期解析

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented protocol uses this model to determine the pathogenicity caused by the mitis group streptococci via the production of H2O2. The mitis group streptococci are an emerging threat that cause many human diseases such as bacteremia, endocarditis, and orbital cellulitis. Described here is a protocol to determine the survival of these worms in response to H2O2 produced by this group of pathogens. Using the gene skn-1 encoding for an oxidative stress response transcription factor, it is shown that this model is important for identifying host genes that are essential against streptococcal infection. Furthermore, it is shown that activation of the oxidative stress response can be monitored in the presence of these pathogens using a transgenic reporter worm strain, in which SKN-1 is fused to green fluorescent protein (GFP). These assays provide the opportunity to study the oxidative stress response to H2O2 derived by a biological source as opposed to exogenously added reactive oxygen species (ROS) sources.

Studying Oxidative Stress Caused by the Mitis Group Streptococci in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an excellent model to dissect host-pathogen interactions. Described here is a protocol to infect the worm with members of the mitis group streptococci and determine activation of the oxidative stress response against H2O2 produced by this group of organisms.

線虫剤群連鎖球菌によって引き起こされる酸化ストレスの勉強

Caenorhabditis elegans (C. elegans), a free-living nematode, has emerged as an attractive model to study host-pathogen interactions. The presented ...

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female reproductive tract. While in vitro studies suggest that sperm of internally fertilizing animals can respond to various cues from their surroundings, the inability to visualize their behavior inside the female reproductive tract creates a challenge for understanding sperm migration and mobility in its native environment. Here, we describe a method using C. elegans that overcomes this limitation and takes advantage of their transparent epidermis. C. elegans males stained with a mitochondrial&#160; dye are mated with adult hermaphrodites, which act as modified females, and deposit fluorescently labeled sperm into the hermaphrodite uterus. The migration and motility of the labeled sperm can then be directly tracked using an epi-fluorescence microscope in a live hermaphrodite. In wild-type animals, approximately 90% of the labeled sperm crawl through the uterus and reach the fertilization site, or spermatheca. Images of the uterus can be taken 1 h after mating to assess the distribution of the sperm within the uterus and the percentage of sperm that have reached the spermatheca. Alternatively, time-lapse images can be taken immediately after mating to assess sperm speed, directional velocity and reversal frequency. This method can be combined with other genetic and molecular tools available for the C.elegans to identify novel genetic and molecular mechanisms that are important in regulating sperm guidance and motility within the female reproductive tract.

Measuring Sperm Guidance and Motility within the Caenorhabditis elegans Hermaphrodite Reproductive Tract

Sperm must successfully navigate through the oviduct to fertilize an oocyte. Here, we describe an assay for measuring sperm migration within the C. elegans hermaphrodite uterus. This assay can provide quantitative data on sperm distribution within the uterus after mating, as well as on speed, directional velocity, and reversal frequency.

Caenorhabditis elegansふたなり生殖管内の精子の誘導と運動性の測定

Successful fertilization is fundamental to sexual reproduction, yet little is known about the mechanisms that guide sperm to oocytes within the female ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological conditions. Post-mitotic neurons represent a major cell type affected by aging. Although multiple mammalian models of neuronal aging exist, they are challenging and expensive to establish. The roundworm Caenorhabditis elegans is a powerful model to study neuronal aging, as these animals have short lifespan, an available robust genetic toolbox, and well-cataloged nervous system. The method presented herein allows for seamless isolation of specific cells based on the expression of a transgenic green fluorescent protein (GFP). Transgenic animal lines expressing GFP under distinct, cell type-specific promoters are digested to remove the outer cuticle and gently mechanically disrupted to produce slurry containing various cell types. The cells of interest are then separated from non-target cells through fluorescence-activated cell sorting, or by anti-GFP-coupled magnetic beads. The isolated cells can then be cultured for a limited time or immediately used for cell-specific ex vivo analyses such as transcriptional analysis by real time quantitative PCR. Thus, this protocol allows for rapid and robust analysis of cell-specific responses within different neuronal populations in C. elegans.

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for simple isolation of specific groups of live neuronal cells expressing green fluorescent protein from transgenic Caenorhabditis elegans lines. This method enables a variety of ex vivo studies focused on specific neurons and has the capacity to isolate cells for further short-term culturing.

回虫カエモルハブ炎エレガンスからの特定ニューロン集団の分離

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...