C.elegans毒物学的アッセイは貴重です。このプロトコルは、384ウェルプレートの化学物質でC.elegansを処理し、ビデオをキャプチャし、毒物学的関連表現型を定量化する方法を説明します。この方法は、化学物質の潜在的な急性毒性を同定し、予測するのに役立つ可能性があります。
この定量技術は、液体媒体を用いた384ウェルプレートでの12〜24時間の化学処理後にC.elegansの33パラメータを自動的に分析するために開発されました。C.elegansは、新しい化学物質の迅速な毒性評価の良いモデルとして貴重です。マウスとして、新しい化学物質の毒性スクリーニングや試験、または食品添加剤として汚染する化合物、医薬化合物、外因性化合物等の環境に適用することができる。
プロトコルを注意深く読んで、常にステップバイステップで従ってください、そして、あなたは良いものになるでしょう。視覚的なデモンストレーションは、ユーザーが各ステップの操作と操作の結果を見やすくします。この手順のデモンストレーションは、張と高茶ハンを含みます。
彼らは私の研究室の大学院生です。まず、新しい化学物質の予備的なワーム致死性試験を実施し、最高用量を決定し、最低用量(最低濃度は100%致死率)、最大濃度は100%非致死性である。この実験では、塩化カドミウムの7つの勾配濃度を調製する。
最高の濃縮水溶液の2倍を調製するには、8ミリリットルのK培地で満たされた遠心管に塩化カドミウム固形粉92.8ミリグラムを溶解する。混ぜる渦。粉末が完全に溶解した後、ピペットを使用して最大10ミリリットルを充填します。
K培地で希釈して他の濃度レベルを調製する。超クリーンベンチでは、無菌の先端を使用してストリークプレートから大腸菌OP50の単一コロニーを選び、100ミリリットルのLBスープでフラスコに入れてコロニーを接種します。インキュベーターシェーカーで摂氏37度で一晩育ててください。
90ミリリットルのプラスチックペトリプレートにNGMを注ぎます。各プレートに300マイクロリットルの大腸菌OP50溶液をシードします。N2ワームは、ほとんどのワームが成人期に達するまで、20°CのOP50を2〜3日間、2〜3日間インキュベートします。
滅菌水で、15ミリリットルの無菌円錐形遠心分離管にグラビッドワームを洗い流して収穫します。ワームは少なくとも2分間落ち着かせてください。水を吸い込み、5ミリリットルの漂白剤バッファーを追加します。
チューブを5分間ボルテックスし、遠心分離機にチューブを入れ、1300の相対的な遠心力で30秒間回転し、卵をペレットします。上清を吸引するためにピペットを使用してください。卵を洗うためにチューブに殺菌水5ミリリットルを加え、チューブを5秒間渦に入れます。
1300の相対遠心力で、30秒間チューブを遠心分離します。上清を取り除き、滅菌水を5ミリリットル加え、再び洗浄します。OP50と新しいNGMプレートに卵をピペット。
一晩摂氏20度でインキュベートします。翌朝、孵化したワームはL1ステージに達する。約40時間後、ワームはL4段階に達する。
K培地では、L4段虫をペトリプレートから50ミリリットルの無菌コニカルチューブに洗い流します。管からガラススライドへのワーム液のピペット50マイクロリットル。ステレオ顕微鏡では、ピペットを使用して、K培地の100マイクロリットルあたり約40匹の動物にワームの濃度を調整します。
調製した培地の50マイクロリットルを384ウェルプレートの各ウェルに加えます。これらの同期されたL4段階のワームは、化学物質による治療に従う準備ができています。化学物質を追加する前に、同期化されたワームを自動ステージに置いて384ウェルプレートを配置し、プログラムされた取得手順でビデオカメラを設定します。
384ウェルプレートでは、ワームは各個々の化学物質の6〜7用量で処理され、8つの平行井戸には2回の化学溶液の50マイクロリットルが含まれています。コントロールとしてK培地の8つの平行ウェルの少なくとも3つのグループを準備します。各井戸に対して2倍の化学溶液の50マイクロリットルを加えます。
時間をゼロ時間ポイントとして設定します。その後、384ウェルプレートを摂氏20度に設定したインキュベーターシェーカーに入れ、毎分80回転します。所望の時間の後、インキュベーターからプレートを取り出し、自動段階に移します。
12時間、24時間でプレートの各井戸のビデオを撮り、ワームのフェノタイプをチェックします。実験ビデオの処理を開始するには、ビデオファイルをコンピュータに転送します。グラフィカルユーザーインターフェイスを介して、ソース画像ディレクトリを選択するために、選択ボタンをクリックします。
中間結果ディレクトリを追加します。中間の結果には、セグメント化された画像が含まれ、処理された画像の視覚的な観察に役立ちます。インターフェイスに最終結果ディレクトリを追加します。
インターフェイスの [ワーム サイズ] テキスト ボックスで、ワーム サイズの平均パラメータを 2,000 に設定します。インターフェイスで移動比率のしきい値を 0.93 に設定します。[解析] ボタンをクリックして、画像処理を開始します。
開発されたプログラムは、ワームを認識し、自動的に型を定量することができます。本実験では、33の特徴的な特徴を、3つの時点、ゼロ時間、12時間、24時間で塩化カドミウム処理のために定量した。実験画像は、化学物質濃度が増加するにつれて、ワームがより迅速に死んだことを示しています。
当初、コントロールと化学処理の間に有意な差はなかった。12時間の治療の後、高濃度で処理されたワームは、より低い濃度または対照群よりもまっすぐかつ湾曲しなくなった。ワームボディを覆う領域の長軸長は、時間が増加するにつれて増加した。
また、長軸と短軸の長さの両方で、より低い化学濃度から高い化学濃度への勾配傾向もあります。ワームの運動性は、面積と比率に基づいて、同様のパターンを示した。最初に有意差は認められなかった。
時間が経つにつれて、対照群のワームは運動性の安定した減少を示した。12時間及び24時間後、塩化カドミウムで処理したワームは、対照群と比較して運動性に有意な差を示した。さらに、より高濃度治療の下でのワームは、より低濃度の治療下のワームと比較して、弱い運動性を示した。
要約すると、この技術は、複数の領域で迅速な毒性評価の方法を開きます。食品媒介性毒物症の毒性の緊急解析、医薬品化合物の安全性評価、急性毒性スクリーニング、新薬品の検出、環境外因性化合物に応用できる研究者。塩化カドミウムは、低毒性物質である。
取扱い時に手袋とマスクを着用し、操作手順に従ってください。
