このプロトコルは、学部生が出版可能な結果につながる可能性のある本物の研究を行うための簡単で実行可能な方法です。主な利点は、学生が自分で決めた問題について独自の研究を行うことができることです。まず、9ミリリットルのガラス製パスツールピペットをブンゼンバーナーの炎で慎重に曲げて溶液スプレッダーを作り、ピペットの開口部を閉じます。
次に、ペトリプレート上に各スプレッドが広がる前にスプレッダーをエタノール滅菌します。マイクロピペッターを使用して、100マイクロリットルの希釈液を寒天の中心に置き、滅菌スプレッダーで表面全体に静かに広げる。その後、覆ったペトリ皿を脇に置き、溶液を乾くまで表面に浸します。
12時間を超える曝露期間の場合、線虫を添加する前に50マイクロリットルの大腸菌の一晩培養物をプレートに加えるが、12時間以下の急性実験では、プレート上に大腸菌を有する必要はない。マイクロピペットを使用して、線虫のプレート上に1ミリリットルの滅菌水を置く。次に、線虫を持ち上げるために水を振り回し、線虫と一緒に液体を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに取り除く。
10分後、線虫が重力によって落ち着いたら、少なくとも500マイクロリットルの水を慎重に取り除き、捨てる。その後、線虫を再懸濁し、切り取られた黄色のピペットチップを使用して、各処理プレートに50〜100マイクロリットルの懸濁したワームを除去し、各プレートに少なくとも10匹の成虫があることを確認する。スライドの片側だけにラベルテープを貼って均一な厚さのパッドを形成し、その間に清潔な未使用のスライドをベンチトップに置き、スライドを2枚用意します。
マイクロピペッターを使用して、溶融したアガロースの10マイクロリットルの滴をスライドの中央に置きます。次に、別のきれいなスライドをスライドと垂直な上に置き、アガロースドロップがラベリングテープの厚さを形成するように圧力をかけて、ドロップを平らにします。その後、一定の圧力をかけて 2 つのスライドを分離します。
次に、このスライドを寒天側を上にしてベンチトップに置き、1〜2分間乾燥させてから使用してください。調製したスライドの線虫をアガロースパッドで追加するには、1モルのアジ化ナトリウムを含む5マイクロリットルの水滴を寒天パッドに加え、ワームを麻酔して動員します。次に、線虫を移す前後に滅菌する必要があるワームピックを使用して、治療スライドあたり10個の線虫を液滴に移す。
次に、鉗子を使ってカバースリップを斜めに置き、ゆっくりと下げて追加します。その後、準備したウェットマウントを蛍光顕微鏡の上に置き、最初に10倍の倍率と位相コントラストの下でワームを観察し、次に位相コントラストと蛍光照明で40倍の倍率でワームを観察しました。準備したウェットマウントを一度に1つずつ顕微鏡ステージに置き、顕微鏡ステージクリップを使用して所定の位置に固定し、最も低い倍率対物レンズ(通常は10倍)でウェットマウントの表示を開始し、明視野または位相コントラストを使用して線虫を視覚化し、焦点を合わせます。
線虫が視野に入ったら、顕微鏡の細かいフォーカスノブを使って線虫に焦点を合わせ、ダイヤルを回して照明を蛍光に切り替え、カメラに光を向けてデジタル画像をキャプチャします。次に、イメージングソフトウェアを使用して照明を調整して、ニューロンが明るく照らされるが過飽和にならないようにします。ある時点で、セル画像と同じ倍率で定規の別の画像を取得して、その図の倍率スケールを提供します。
ドーパミンニューロンがGFPを発現した株を用いてドーパミンニューロン形態に及ぼすマンガン含有農薬の影響を、明るいシグナルを示すものとして検討した。しかし、蛍光シグナルは、ニューロンが長期間光にさらされると漂白する。この手順は、行動やその他のデータを含めることができる複数週の学生主導のプロジェクトの一部にすることができます。
