The authors are thankful to the nurses at the AMC that have facilitated the tissue collection. We would also like to acknowledge A.M.A. van der Laan for excellent technical support with the SHG and the two-photon imaging.

このプロトコルは、人間の研究倫理委員会のLUMCとAMCガイドラインに従っています。 1.手術手順及び組織収集注：デュピュイトラン拘縮の外科的切除のための様々な技術が存在するが、現在のゴールドスタンダードは、部分的な筋膜切除術15です。ほとんどの患者は、一日手術クリニックで治療されている。 <ol><li>患者と麻酔専門医の好みにし、患者の合併症による一般的または局所麻酔下に手術を行う。これらの考慮事項は本稿の範囲を超えています。切開の前に、麻酔が十分であることを確認するために、鋭利なもので皮膚に触れる。無血分野における外科的可視化を容易にするために、止血帯を使用してください。 </li><li>無菌プレッピングとドレーピングした後、ペンで予想される切開をマークします。どちらか縦方向にOルーペ倍率の下で、メスで皮膚を切開するrのさらなる拘縮を防止するために、ジグザグ切開を使用しても十分な露光を可能にする。 </li><li>はさみ解剖を使用して、基礎となる契約筋膜の掌から皮膚と皮下層を解放。病気のコードは正中線に向かって変位させることができるので、指の神経血管束を特定し、保護する。線維性組織（結節および/またはコード）で概説された後、メスを用いて鋭くし、地域（小計）それを切り出す。血腫の形成を防ぐために、手順の最後に止血帯制御下細心の止血を行う。 </li><li>皮膚を閉じるには、皮膚の部分的な延長を得るために、追加のZ-plastiesを使用しています。 </li><li>これらの研究のために線維性コードの唯一の結節部分、疾患の最も活発なと細胞の一部を使用しています。外科医は巨視的識別を行う必要があります。の手のひらの上で孤立した結節は、多くの場合、前駆体またはコードですが、彼らは通常、症状を引き起こさないようにほとんどない、切除されている。我々は切除ものは、契約指のコードの一部であった結節た。 handpalm（ 図1A）でコードのハード厚い部分によってこれらの結節を特定します。 </li><li>外科医は、組織を除去した後、直ちに、10％FCSおよび1％（P / S）を補充したDMEM培地を含む50mlチューブに滅菌ピンセットを使用して転送する。湿った氷（4℃）のボックスに、この培地中で2時間の最大のための組織を維持（ 例えば、細胞培養施設への操作室からの組織の輸送）。 </li><li>次のステップの準備をしながら、湿った氷（4℃）でサンプルを保管してください。材料および細胞培養室の調製は、10〜20分を要する。 </li></ol>楽器、培養培地と文化インサートの調製注：特に記載のない限り、全ての手順を室温で実施される。 <ol><li> DMEM 500mlのを準備し、10％FCSおよび1％（P / S）を補充し、フィルタのterilize。 37℃でメディアをPrewarm。 </li><li>オートクレーブ鉗子、湾曲した刃メイヨーはさみのペア（長さ150〜170ミリメートル）と滅菌容器内Metzenbaumのハサミや店舗。 </li><li>層流下、無菌の12ウェル培養プレートを開く。 12ウェルプレート（ 図1B、下パネル）の各ウェルに1つの培養インサート（孔径0.45μm、直径12mm）を配置します。 </li><li>挿入物の膜上に直接ウェル上にピペッティングにより予め温め（37℃）の培養培地600μlの12ウェルプレートを記入し、ではない。インキュベーターにプレートを置き（37℃、5％CO 2）（ 図1B、上パネル）。 <ol><li>代わりに、24ウェルプレートを使用し、ウェル当たり300μlの培地を追加。メニスカス層は、液体および膜インサートの下部との間に形成されたときにウェル当たり培地の体積は最適である。 注：ウェルの底の媒体は、ニトロセルロースmembrを通って拡散図1B（下部パネル）のスキームに示すように、ANEメニスカス層を形成する。 </li></ol></li></ol> 3.組織の調製およびex vivo組織培養のセットアップ注：特に記載のない限り、全ての手順を室温で実施される。 <ol><li> 100ミリメートルペトリ皿に50ミリリットルチューブからコードの結節部分を転送し、予め温め（37℃）培地10mlを追加します。組織は全体の手順の間に液体と接触していることを確認してください。 <ol><li> Metzenbaumはさみを使ってperinodular脂肪層を削除します。脂肪組織を捨てる。鉗子と湾曲した刃ハサミを使用することで、横方向に小さな断片（200μmの最大厚さ）に組織を切断する。 </li></ol></li><li>層流フードにインキュベーターから12ウェルプレートを転送します。挿入物の膜は（ウェット）透明になって、したがって、媒体と接触していることを確認してください。 </li><li>鉗子を使用して外層を（組織上の張力を適用しない）に触れることにより、組織の一部を慎重に持ち上げます。組織は、空気中間期に残るように細胞培養インサートのメンブレン上に1組織部分を配置します。文化/ウェル同じインサート上の2つの組織の部分の最大。 </li><li>組織は組織が膜をオフに浮くことも、完全に媒体によって覆われてもされていないような媒体と縦に接触して、メンブレン上に平らに置かれていることを確認します。空気の泡を避けてください。 注：この段階では、成長因子またはメディアへの関心の阻害剤を添加することが可能である。例えば、反復および/または濃度曲線における試験化合物（A、B、C、D、E）。実験は適切に設定されていることを確実にするために、通常の成長条件下で組織の少なくとも2コントロール（未処理）の作品を含める。組織培養インキュベーターで3-7日間、組織をインキュベートする。 </li><li>過剰発現した場合、レンチウイルスまたはアデノウイルス構築のいずれかで組織に感染するか、電子をノックダウン実行される目的遺伝子の必要性（ 図2）のxperiments。鉗子を用いて35ミリメートル皿に12ウェルプレートから組織部分を転送します。 <ol><li>高力価ウイルスを10μlの最大音量を使用してください。 </li><li>選択されたウイルスの10μlのを含む50μlのPBSでロードされたインスリン注射器で解剖顕微鏡下で注入を実行します。組織の中心に垂直に針を置きます。 </li><li>ゆっくりと注射器の内容を注入する。直接針を撤回しないでください。組織を穿刺すると、針が他の側を通って行くが、（組織の中心付近）組織自体の中に針を維持させてください。 </li><li>バック12ウェルプレートに組織を転送する培養プレートを閉じ、インキュベーター（37℃、5％CO 2）内に置きます。 </li></ol></li></ol> 4.ホールマウント免疫蛍光染色および三次元再構成注：すべてのプロを特に明記しない限りceduresはRTで行う。後述の全体マウント免疫染色およびイメージングのためのプロトコルは、他の組織16-19のために使用される以前に報告された方法から適応したものです。バッファおよび材料は、表1及び物質一覧に記載されている。 <ol><li> PBSを含む2ミリリットルマイクロ遠心チューブに培養プレートからの転送組織。回転プラットフォーム上のPBS溶液中で5分間洗浄2倍。回転プラットフォーム上のPFA（2 mlのマイクロチューブ内の組織あたり1.5ミリリットル溶液）バッファリングされた4％で、O / N、4℃で組織を固定してください。 </li><li> PFAを除去し、5分間ずつPBSで3回洗う。 </li><li>回転プラットフォーム上で室温で2時間、25％メタノール溶液中に浸漬することにより組織を脱水する。回転プラットフォーム上で室温で2時間、各ソリューションに浸さ組織と徐々にメタノールの割合（50％、75％、100％）を増やします。 </li><li> 、4℃で3週間、DMSO /メタノール溶液（透過化工程）における組織を転送するとして以前に18に説明。 注：この段階では、組織を-20℃で100％メタノール中で長期間保存することができる。 </li><li>染色手順16、17に進みます。徐々に組織（75％-50％-25％-0％メタノールシリーズ）を再水和する。一定の撹拌の下、4℃でRTまたはO / Nで2時間ごとに再水和ステップを実行します。 </li><li> 4℃で1％ウシ血清アルブミン（BSA）および20％DMSO O / Nを含有するPBS中で一次抗体とサンプルをインキュベートする。抗α平滑筋アクチン：PBS商用銘柄を使用して、次の割合で抗体を使用する（1：500、マウス）、抗コラーゲンタイプI（1：500、ヤギ）、抗コラーゲンタイプIII（1：500、ヤギ）。 </li><li> 4℃（変更PBS溶液3〜4回）で48時間、PBSで広範囲に洗浄します。 </li><li> 1で適切な二次抗体（アレクサ555抗マウスアレクサ488抗ヤギ）を希釈する：1％（BSA）および20％DMSOを含有するPBS中で250希釈。 4℃でO / Nインキュベートします。 </li><li> 4で48時間、PBS中で広範囲に洗ってください最後の洗浄工程でPBS中に1：500; 76 CおよびTO-PRO-3、核対比でインキュベート1に希釈した。 注：TO-PRO-3（ヘリウムネオン633nmのレーザー線を使用）遠赤色蛍光DNA色素であり、他のチャンネルとの同時イメージングのために組み合わされる。この場合、I型コラーゲン/ III型コラーゲン（488 nm）を、α平滑筋アクチン（555 nm）の中で、TO-PRO-3（647ナノメートル）。 </li><li>ゆっくりと組織を脱水メタノールシリーズ（25％-50％-75％）に組織を移す。一定の攪拌下、4℃でRTまたはO / Nで2時間毎に脱水工程を行う。 <ol><li>ポリプロピレンチューブ中に組織を転送します。サリチル酸メチルでクリア組織（化学フードの下ハンドル）18または代替使用BABB液19として。組織が透明になるまで、一定の攪拌下、室温でインキュベートする。マウントスライドとハードセット封入（ 図1C、上部パネル）で密閉カバーガラスの間に。 </li></ol></li><li>倒立共焦点マイクロ上の画像サンプル高NA 63Xおよび/ ​​または100倍油浸対物レンズ（ 図1C）を備えたスコープ。 <ol><li>顕微鏡メーカーが提供する洗浄液でレンズを清掃してください。 </li><li>対物レンズ上の油の一滴を適用します。顕微鏡ステージ上の標本でスライドを置き、サンプルに焦点を当てる。 </li></ol></li><li>レーザーライン488 nmの、514 nmおよび633 nmの持つ3つのチャンネルの蛍光の同時イメージングのための顕微鏡の構成を設定します。 </li><li>単一XY画像又は複数の焦点面画像（Zスタック）（ 図3A）を取得する。 3D再構成を実行するためのZスタックの増加幅を使用してください。高解像度の画像を得るために、平均スキャン（≥3）の数を低い走査速度を使用し、1,024×1024ピクセルの解像度の16ビットの画像を取得する。 </li><li> Zスタック取得した画像を分析します：最初の画像ファイル（XYZ）の名前を変更して保存します。共焦点顕微鏡のソフトウェアプログラムを使用して、最大強度projeを構成3D再構成画像にZスタック画像のction。 <ol><li> 「プロセスツール」で、XYZファイルを選択し、「可視化」と「3Dプロジェクション」の下をクリックします。 （蛍光シグナルが飽和している場合、または「平均」）投影方法で「最大」と入力します。単一の投影のためにX、Y、およびZ平面を変更し、投影ツール（ 図3Bにおいて、r1）を適用しない。 </li></ol></li><li>目的を表示するためのアニメーション（共焦点ソフトウェア）で3Dプロジェクションを作成するために、Zスタック画像を使用してください。プロセスツールで、XYZファイルを選択し、「可視化」と「3Dプロジェクション」の下をクリックします。 <ol><li> 「ムービーの作成」をクリックします。度でスタート回転角度を入力します（ 例えば 、映画の出発点として、0°、Y軸）と「セットスタート」をクリックしてください。ムービー（ 例えば、180°または360の終点と度数で終了回転角度（Y軸）を入力する6;完全な回転のため）と &quot;セット終了」をクリックしてください。 </li><li>投影方法として「最大」（または「平均」蛍光シグナルが飽和している場合）を選択する。 3D再構成の回転のための「フレーム数」（回転数を削減するなど、20回転以上）を入力します。 「適用」をクリックします。各回転角度（;回転R4、R10、R18 図3B）用のイメージファイルを作成し、「TIFF」ファイルなどのビジュアルファイル（ 例えば、「aviファイル」）（補足作品1）またはエクスポートなどのムービーを書き出す。 </li></ol></li></ol> 5.コンバインド第二高調波発生（コラーゲン）および培養中のエクスビボ組織上の二光子励起蛍光（エラスチン）イメージング注：特に記載のない限り、全ての手順を室温で実施される。 <ol><li> TI（未確定）インキュベーターからトランスウェルプレートを取り外し、シングルを配置培地500μlを含む35ミリメートル細胞培養プレートでssue一部。 </li><li>長軸がプレートの上に平らになるように組織を配置します。しかし、常に濡れていない浮動組織を保管してください。 </li><li>組織（ 図1C）と直接接触して多光子顕微鏡の水浸対物レンズを配置します。 </li><li> 800nm ​​の励起波長で画像を取得し、371から425ナノメートル（SHG、コラーゲン）および474から532ナノメートル（自己蛍光、エラスチン）（図3C）の間に放出された光を集める。 20X / 1.0 NA水浸対物レンズを用いてフェムト秒レーザーを備えた直立共焦点顕微鏡において、二光子顕微鏡法を行う。プロセスの共焦点は、製造業者のソフトウェアとスタックします。 注：コラーゲン分子の近赤外レーザーによる励起は、異なる深さで天然コラーゲン構造の高コン​​トラスト画像を作成する。 </li></ol>

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3D器官培養：著者は、デュピュイトラン病のための特許出願している。 ＃GB1307200。商用ライセンスとサービス契約を利用できます。

ex vivoでの人間の結合組織を培養する最も重要なステップは実行可能性を確保するための外科的除去後の組織の直接の使用である。組織は常に培地または生理食塩溶液中に留まるべきである。無菌培養を維持する。組織の横断切片は、最大200μmの厚さを有するべきである。組織培地と接触しているが、完全に浸水しないときのex vivo培養系でセットアップすることが最適である。?...

デュピュイトラン病（DD）、良性の線維増殖性疾患が原因の手のひらの上で結節及びコードの形成に指の永久的な屈曲を引き起こす。病気の広がりは、北欧の白人の中でも特に高いが、疾患の根底にある遺伝的病因は、1不明のまま。 DDの主な特徴は、恒久的に細かい動きを破壊し、腱や手のひらの皮膚と指の間のスペースを占有しているタフな繊維組織を形成する細胞外マトリックス（ECM）タンパク質（ 例えば、コラーゲン）の過剰生産である手2の、3。疾患の再発が線維1,4の原因として、基礎となる遺伝的変化を示唆している。有効な治療は、細胞および分子レベルで直接制御できない線維性のメカニズムを標的とすることができる。 線維症に関する我々の最近の研究は、の開発に私たちをリードしてきました新規な薬物検査の潜在的なヒト線維性組織の短期培養を可能にする三次元培養系。このシステムは、2D線維芽細胞培養の制限アプローチを克服し、線維症5の仲介にTGFβ経路活性化のエクソンスキッピングによって達成部分的なダウンレギュレーションの役割を、定義するために貢献してきました。 私たちは、筋線維芽細胞と周囲のECM 5、6の間の相互作用を研究するために培養したDD患者からex vivoでの人間の切除標本の方法を開発した。DD結合組織線維化の研究だけでなく、他の線維性の疾患は、切除した外科の病理組織学的分析に依存している標本、組織及び初代培養または細胞選別手順の確立からの線維芽細胞を単離する。彼らは実験者による病気の性質または治療的介入の外因性の操作を許可しないので、これらのアプローチは非常に静的です。加えて、一次のceLL培養は、培養条件に適応する傾向があり、それらの遺伝子発現特性にも早期の継代（継代3間および6）7、8の間に、すべての通過時の生体内の状況から本質的に異なっている。私たちは、廃棄物の外科的材料を維持するために管理している患者特有の特性の研究及び抗線維症または抗炎症性薬剤化合物のスクリーニングを可能にする期間のex vivoでの培養条件。 システムは、DD線維芽細胞ならびに他の細胞型9を培養する際に、以前に観察されたように、取り付けの際に組織の変質を防止するため、プラスチックを含む培地と組織の接触を可能にするではなく、ニトロセルロース膜に基づいている。 DD組織自体は、これらのタンパク質を大量に生成するのでないコラーゲンゲルまたは他のECMタンパク質基質は、必要とされない。これは、ネイティブのECM微小環境と売上高の罪の維持のために有利であるCEのマトリックス基質は組織構造および機能10、11の重要な調節因子である。例えば、フィブロネクチン、ラミニンおよびコラーゲンなどのECMタンパク質は、のように、同様の上皮細胞12に頂端-基底極性のために示された線維芽細胞の前後極性、13に影響を与える可能性。極性細胞は、細胞の移動および遺伝子発現、 例えば、膜上のα1β1インテグリンのアクセシビリティは、私が14型コラーゲンへの細胞接着に影響を与えるを決める外分子の非対称な分布を有する。この3Dモデルの主な目標は、天然の微小環境を維持することであったため、人工ECMマトリクス基板は使用しなかった。 簡単に言えば：切除標本を均等に無菌環境で切断され、nitrocellularメンブレン上に置いた。注射による投与の治療が必要とされる場合、それらは、膜上に配置された後に組織が注入される。治療は、INJを経由して投与するために必要としない場合ection次に、化合物（1％ウシ胎児血清（FCS）、1％ペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）を、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））を培養培地に添加される。以前5に記載のように培養物を、30％ショ糖溶液を介して処理組織を4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定した後10日目の最大、OCTコンパウンドに包埋し、-80℃で保存のために維持される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>high glucose, heat inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture inserts</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PIHA01250</td>
			<td>0.45um pore size, 12mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type I</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1310-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti- &#945; smooth muscle actin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-collagen type III</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>1330-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor555 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOPRO-3</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylsalicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsccope glass coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>BB024060A1</td>
			<td>24x60mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope SuperFrost slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>AA00000102E</td>
			<td>76x26mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD HardSet Mounting Medium</td>
			<td>Vector laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP5 II confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Argon-488, 514 nm and HeNe-633 nm laser lines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 710 NLO upright confocal microscope</td>
			<td>Jena, Germany</td>
			<td></td>
			<td>equipped with femtosecond Spectra - Physics Deep See MP laser (Santa Clara, United States) using a Plan -Apochromat 20x/1.0 NA 
			water-immersion objective.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

human dupuytren's ex vivo culture for the study of myofibroblasts and extracellular matrix interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

エキソビボの方法は、結合組織の三次元培養は、同様にECMとDDの組織を構成する他の細胞成分および線維症の潜在的に他の種類との関係を理解するための簡単かつ堅牢なアップ方式である。さらにこのシステムは、異なる細胞型および線維性負荷20への影響に対する化合物の効果を試験するための信頼性の高い方法を可能にする。 デュピュイトラン線維症?...

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Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

デュピュイトラン病（DD）は、手のひらの線維増殖性疾患である。ここでは、三次元（3D）培養系においてDDから培養切除標本のプロトコルを提示する。このような短期培養系は、3次元構造の保存および線維性組織の分子特性を可能にする。

人間デュピュイトラン<em&gt;エクスビボ</em筋線維芽細胞と細胞外マトリックス相互作用の研究のために&gt;文化

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

10.3K ビュー.  Leiden University Medical Center. デュピュイトラン病（DD）は、手のひらの線維増殖性疾患である。ここでは、三次元（3D）培養系においてDDから培養切除標本のプロトコルを提示する。このような短期培養系は、3次元構造の保存および線維性組織の分子特性を可能にする。 

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Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

遺伝子デリバリーの患者の組織及び審査のex vivoでの文化

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

医学

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

人間の神経内分泌腫瘍療法の研究のための三次元モデルとしての人間の神経内分泌腫瘍細胞株

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

ヒューマン<em&gt;生体外</em&gt;動脈硬化性プラークのモデルは、病変生物学を研究する

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

人間の伏在静脈のための手順<em&gt;生体外</em&gt;灌流および外部補強

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

アン<em&gt;エクスビボ</emヒト乳癌でホルモンの作用を研究するために&gt;モデル

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

生体内および生体外では腹膜脂肪にミルキースポット構造の卵巣がん転移性コロニー形成を研究するためのアプローチで

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Kinomicプロファイリングと薬物反応検査のための3D人間バイオゲル培養システムと患者由来の神経膠芽腫細胞を用いた微小腫瘍の発生

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

リン-31磁気共鳴分光法：測定するためのツール<em&gt;インビボ</emヒト骨格筋における&gt;ミトコンドリア酸化的リン酸化能力

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

マウス網膜細動脈Ex Vivoでの反応性の測定の準備手順

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...