当社のプロトコルは、細菌汚染を避けることに明確な焦点を当てた原発線維芽細胞の分離のための簡単かつ迅速なアプローチを提供し、これは大きな問題になる可能性があります。特に初心者向け。私たちの技術の主な利点は、そのシンプルさです。
それは広範な手動スキルや経験を必要としないので、それは簡単に短いトレーニング期間内に誰もが学ぶことができます。この技術を発表するマンジャ・ニューは、研究室の技術者です。解剖を始める前に、使い捨て手袋を2組着用し、1組を他方の上に置きます。
そして、ポリスチレンパッドにマウスを固定します。毛皮を70%エタノールで消毒し、動物が浸されたことを確認します。そして、エタノール殺菌手術鉗子と外傷性ハサミを使用して、泌尿生殖管のすぐ上の皮膚をカップに入れた。
最初の切開から首まで中線に沿って3〜4センチメートルカットし、手足にリリーフカットを追加します。そして、腹腔を覆う筋肉への最適なアクセスを達成するためにパッドに皮膚を固定します。次いで、新鮮な70%エタノールで腹筋を2回消毒する。
エタノールが乾燥したら、手袋の最初のペアを取り除きます。そして、腹腔と胸部を開くために筋肉層を切開するために鉗子とはさみの新しい滅菌セットを使用してください。目的の器官を取り除くために、組織を突き刺すことなく外科用鉗子で各器官をそっとつかむ。
そして、臓器の入り口付近で供給血管を慎重に切断するためにはさみを使用します。各器官を無菌、冷たいPBSのチューブに入れ、チューブをしっかりと閉じます。器官が集められると、各管を湿った氷の上に置く。
すべての臓器が収穫されたら、滅菌細胞培養フードに入れる前に70%エタノールでチューブをスプレーします。手袋の新鮮なペアを身に着けて、無菌の6センチメートルのペトリ皿の半分に各臓器を転送するために無菌鉗子を使用しています。そして、余分な血液を除去するために新鮮なPBSで臓器を簡単に洗います。
各ペトリ皿の後半にすすい出した器官を移し、余分なPBSを取り除きます。2つの無菌メスを使用して、臓器を1〜2ミリメートルの断片にミンチする。そして、滅菌ヘラを使用して、組織片を新しい、個々の、無菌、15ミリリットルのチューブに移します。
各チューブに0.25%トリプシン溶液の2ミリリットルを追加します。そして、チューブを37°Cの細胞培養インキュベーターに5分間入れます。インキュベーションの終わりに、10秒間毎分約1400回転でチューブを渦付けする。
そして、チューブあたり胎児子牛血清を補充適切な培養培地の4ミリリットルでトリプシン反応を逮捕する。次に、各チューブにコラゲアーゼ配合液の適切な量を加えます。そして、10分間摂氏37度の超音波水浴にチューブを置きます。
超音波処理の終わりに、10秒間チューブをそっと渦を出します。チューブを超音波水浴に戻す前に、さらに10分間。2回目の超音波処理の終わりに、10秒以上のチューブを渦。
そして、70%エタノールでチューブを消毒します。細胞培養フードでは、個々の40マイクロメートルストレーナーを通して細胞懸濁液を新しい無菌15ミリリットルチューブにフィルター処理します。遠心分離により細胞を回収する。
1チューブあたり新鮮な培地の1ミリリットルでペレットを再懸濁します。そして、適切なめっき密度で適切な細胞培養容器内の細胞を参照してください。次いで、細胞を細胞培養インキュベーターに一晩入れる。
翌朝、各培養物をPBSで3回洗ってから、新鮮な培地を添加し、培養器に細胞を戻す。このプロトコルを使用して、後の実験で使用するために生き生きと線維芽細胞を得ることができる。例えば、アミノ蛍光染色や増殖実験など。
成体線維芽細胞は、平らな紡錘形細胞であり、一般的に単層で増殖する複数の細胞プロセスを有する。しかし、異なる器官からの線維芽細胞集団における明確な形態学的差異は観察され得る。例えば、腎線維芽細胞は心臓、肺または肝線維芽細胞よりも小さく、高密度で成長する。
単離された線維芽細胞は高い増殖率を示し、およそ6日後に90%を超える光学合流に達する。ここで、特徴的なα平滑筋アクチンマイクロフィラメントを有する分化された筋線維芽細胞が観察できる。これらの細胞は、心臓、腎臓、肝臓、および肺細胞培養において豊富に見られる。
単離および培養細胞の約20〜30%だけが整然と発現するが、配列されたα平滑筋アクチンマイクロフィラメントは、培養7日後にビメンチンおよびフィジジンドメイン受容体2に対して事実上全ての細胞が陽性である。最も重要なことは、細菌汚染を避けなければならないので、手順全体を通して正しい技術を使用することです。一次線維芽細胞の単離後、細胞はあらゆる種類の精神医学実験および特徴付けに使用することができる。
免疫細胞化学の増殖や創傷治癒エッセイ、または分子生物学的評価など。
