This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).

実験手順は、トーマス·ジェファーソン大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、欧州共同体理事会指令（63分の2010 / EU、609分の86 / EECおよび87から848 / EEC）に準拠して実施し、のためのNIHガイドました脳科学研究における動物の使用に関する神経科学のポリシーの管理と使用実験動物の、および社会。 1.複合筋活動電位（CMapを） <ol><li>動物の準備： <ol><li>効果にまたは注射（ケタミン、キシラジン、アセプロマジン）によって供給される1〜2％で吸入（イソフルラン）を用いてラットを麻酔。 95.0 mgのケタミン/ kgのキシラジンの10.0ミリグラム/ kgのアセプロマジンの0.075ミリグラム/ kgで次のように注射用麻酔の投与量です。 注：我々は、正常に吸入および注射麻酔薬の両方を使用し、このCMAP記録プロトコルを行う際問わないで、近づきます。 </li><li>動物は、適切なAで維持されなければなりません手術前nesthetic深さは、手術の結論を介して、開始され、術後のブプレノルフィンまで有効になっています。引っ込め応答が誘発されていないことを決定するために、簡単なつま先のピンチによって適切な麻酔を確認してください。さらに、綿棒で角膜反射をテストします。外科的手順では、麻酔深度が軽すぎるとなっていることを示唆している、心拍数や呼吸数が増加していないことを決定します。 </li><li>麻酔下ながら乾燥を防止するために、動物の目に獣医軟膏を適用します。 </li><li>外科医は手術を開始する前に、消毒剤（クロルヘキシジンスクラブ）で彼女/彼の手を洗う必要があります。外科医は、滅菌手袋、フェイスマスク、ガウンまたはクリーン白衣を着用してください。すべての機器を洗浄し、手術前にオートクレーブ処理されるべきです。滅菌が完了したことを確認するために、機器のレベルでオートクレーブする前に、機器のキット内の滅菌インジケータストリップを追加します。外科医べきストリップ上の行全体が手術を開始する前に、黒であることを確認します。同様に、オートクレーブテープを示すとボックスの外側をテープで固定します。手術は、同じ日に、いくつかの動物で行われる場合には、手術の間に器具を清掃し、ガラスビーズ滅菌器で滅菌します。必要に応じて、適切な時間に滅菌器具のハンドルを置く滅菌止血剤で楽器を除去、無菌フィールド内で冷却し、その後の官能性末端を配置することによってガラスビーズ滅菌器内器具の両端を滅菌適当な時間のためのガラスビーズ滅菌器への器具。 </li><li>動物を麻酔した後、ダウン背面に外科的ボード上となるようにテープを上に向け、腹部の場所は、外科用ボードに、動物の前肢を保護するために使用することができます。 </li><li>頭蓋底で始まる腹面の尾側を剃るし、正中線の両側腹部周辺はSHであることを確認AVED半ダイアフラムが記録されているに応じて。皮膚の剃毛表面にポビドンヨードを適用します。 </li></ol></li><li> CMAPの録音のための準備： <ol><li>尾への動物の準備、場所接地電極を皮下に続いて（ 図1）。 </li><li>反対下腹部に参照電極を皮下に配置します。 </li><li>自己接着面ストリップまたはディスク記録電極（表面帯状電極の寸法：0.5×3センチ）の上に導電性ゲルを配置し、その後、一方的な肋骨縁に沿って横方向に表面電極を配置します。 </li><li>経皮0.5センチメートル離れて気管に横方向および鎖骨に優れた刺激電極を配置します。皮膚を通して約1.0センチメートル深い電極を挿入します。その場所は、その後の刺激と一緒に移動しないように手で電極を固定します。 注：付着点の部位の皮膚に対して90°の角度刺激電極N。 </li></ol></li><li>複合筋活動電位（CMAP）録音： <ol><li>コンピュータ支援データ分析に続いて刺激/アンプを使用して電気生理学的記録を入手します。 </li><li>シングルプル刺激の刺激パラメータは、0.5ミリ秒、1.0 Hzの超最大パルスでなければなりません。刺激の振幅はV 6.0の間と8.0（ 図2A）である必要があります。 注：この実験の中で、動物間で同じ振幅で刺激強度を使用しています。目的は、刺激の最小の振幅を用いて、応答振幅を最大にすることです。それは刺激の時に発生する初期応答が、刺激アーティファクトであることに注意することが重要です。また、ケアは、その後急速CMAP応答が続いて刺激アーティファクト、後に安定/フラットベースラインが先行するCMAPの応答を得るために注意すべきです。そのような応答を得るためには、刺激の位置を変更する必要があるかもしれない、および/または記録電極。 </li><li>刺激の間に30秒待ってから、平均応答（ 図2B - C）を得るために一列に10刺激を繰り返します。ベースラインからピークに振幅を測定（ 図2A）。横隔神経/ダイアフラムが活性化されていないときに、動物の呼吸サイクルのフェーズ中に横隔神経刺激を行っています。手順は、反対側の半振動板に同じ動物に繰り返すことができます。 </li><li> NMJ染色が行われる場合、最終的なCMAP記録セッションの後、動物を灌流。毎週（または任意の間隔で）約一回、同じ動物で繰り返しCMAPの録音を行っています。 </li><li>生存CMAPの記録に続いて、動物が覚醒し、sternallyリカンベントまで回復中に循環温水暖房パッドに回復し、継続的に監視することができます。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。&lt;/ LI&gt; <li>一度sternallyリカンベント、（その後一日一回）最初の48時間、動物ごとに12時間を監視します。手術後の体重および流体損失安定するまで動物は（弛緩性皮膚、だる）を脱水していると思われる場合は、流体（;皮下;注射1〜2 mlのサイトは回転で1日2回、乳酸リンゲル液）を管理。彼らはワイヤーバー蓋フィーダに到達できない場合は食べることを奨励するために、必要に応じて急性術後期間中に小さな皿で軟化した食品と動物を提供します。 </li><li>手術の終了前には0.05mg / kgの用量でブプレノルフィンを投与し、その後12時間間隔で、最初の24時間（その後痛み/ストレスの兆候に依存）皮下注射を介して、（サイトが回転します）。痛みや苦痛の徴候は​​、その後に気づいている場合は、ブプレノルフィンで動物を扱います。痛み/苦痛を示す兆候は、活性の欠如、発声、（脱水）を食べたり飲ん不足、過度の体重減少、ガード、EXCを含みます能格かじるまたは切開部位でスクラッチ。痛みや苦痛を決定する際に使用される追加の基準は、外来刺激に無反応、一時的またはいわれのない発声、こじつけまたは異常呼吸、永続的な赤褐色鼻な眼放電、マークされた立毛を含みます。また、病気の動物を示唆する不衛生の証拠を監視します。動物がまだ処理の72時間後に苦痛であることが観察された場合、動物を安楽死させる（上記概説疼痛/ストレス条件に応じて、受信した後、鎮痛プロトコルは、上記）。 </li></ol></li></ol> 2.ダイアフラム神経筋接合部（NMJ）の分析<ol><li>動物の解剖： <ol><li>動物に注射用麻酔の過剰摂取の管理（：;腹腔内投与0.225ミリグラム/ kgで30.0ミリグラム/ kgのアセプロマジンで285.0ミリグラム/ kgのキシラジンでケタミン3回は、上記使用した用量）。過量投与に続いて、すべての動物は安楽死の第二の方法（開胸）Tを有していなければなりませんOの死を確認してください。死は、心臓や呼吸停止を観察することによって、動物の固定および拡張生徒に注目することによって確認する必要があります。 </li><li>メスや解剖ハサミが尾側正中線に沿ってzyphoidプロセスから切除を拡張して開腹を行っています。慎重にメスや鉗子を使用して、基礎となる筋肉から皮膚や結合組織を分離します。 </li><li> zyphoidプロセスを引き上げながら、振動板が骨の周囲に付着したままであることを確認して、全体の振動板を除去するために、解剖ハサミを使用しています。それはダイヤフラム全体の成功解剖を可能にする、横隔膜筋への損傷を防ぐことができますし、その後の染色のために筋肉をクリーニングに役立つように、これは重要です。 注：必要であれば、この時点で、動物を灌流することができます。 </li></ol></li><li>振動板のクリーニングと染色： <ol><li>全体解剖ダイアフラムを突き止める、優れた表面がガラス100ミリメートルペトリ皿中にシリコーンゴムに、上向きに実体顕微鏡を用いて20分間 - （PBS、1％リン酸緩衝生理食塩水で行った）、4％パラホルムアルデヒド。それはピンと張ったようにダイヤフラムを伸ばし、昆虫ピンを使用して、横隔膜筋自体（ 図3）をピン止めを避けるために、周囲の組織を突き止めます。 </li><li>慎重に＃5鉗子と小さなはさみで筋肉の唯一の優れた表面から結合組織をきれいに。 注：特に指定のない限り、この染色プロトコルは、ゆっくりと光から覆われ、室温でロッキングのすべての後続のステップを実行してください。横隔膜筋が常に完全に乾燥を避けるために、液体中に浸漬されていることを確認します。 </li><li>染色の前に、全ての必要な試薬調製：1×PBS、2％ウシ血清アルブミン（BSA）/ PBSを、0.1 M 1×PBS中の2％BSA / PBS、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で行われたグリシン、および0.2％TBP（0.2 2％BSA / PBS）中の％トリトンX100。 -20℃でメタノール - クールを事前にしてください。 </li><li> 1×PBS中で10分間の洗浄3倍。 </li><li> 2で行われた（0.1 Mグリシンでインキュベート30分間％のBSA / PBS）。 </li><li> 15分間RBTX（ローダミン結合αブンガロトキシン）溶液中でインキュベートします。ローダミン結合アルファブンガロトキシン1：1×PBSで400希釈を次のようにRBTXのためのソリューションです。 注：このプロトコルでは、ローダミンを用いているが、選択した任意のフルオロフォアは、染色のために使用することができます。 </li><li> 1×PBS中で10分間の洗浄3倍。 </li><li> -20℃の冷凍庫では、5分間MeOHでインキュベートします。 注：冷凍庫に筋肉を置く前にメタノールを追加し、直ちにインキュベーション期間の後溶液を除去しないでください。 </li><li> 1×PBS中で10分間の洗浄3倍。 </li><li> 1時間0.2％のTBPのブロック（0.2％トリトンを2％BSA / PBS製）。 </li><li>ロッキングしながら4℃で一晩、一次抗体溶液（0.2％でTBP）とインキュベートします。抗体の希釈液を次のようにSV2（1:10）とSMI-312（1：1,000）。 </li><li> 0.2％TBPで10分間3回洗浄します。 </li><li> FGM1（FITC結合ヤギ抗マウスIgGの1：100希釈を用いた二次抗体とインキュベートします1; 1時間揺動しながら、0.2％TBP）で行われました。 注：染色のためのプロトコルの残りの光から保護します。 </li><li> 1×PBSで10分間洗浄3倍。 </li><li>前取り付け、カバースリップに筋肉の優れた（上記参照）の表面上に再クリーン周囲の結合組織。 注：それはきれいにした後、染色した後、すぐにサンプルをマウントすることをお勧めします。必要な場合は、サンプルは、1×PBSでカバー蒸発を防ぐためにパラフィルムで包み、毎日PBSを変えて、1週間まで4℃で保存してもよいです。 </li><li>スライドガラス上にマウントされると、非hardsetベクタシールドでカバースリップ。乾燥を防ぐために、明確なマニキュアでカバースリップの端をシールします。店舗スライドは長期的に、-20℃で段ボールスライドフォルダに平らに。 </li></ol></li><li>分析と共焦点イメージング： <ol><li>定量的染色の形態を分析し、直立エピ蛍光を用いて、20Xと40X倍率下半ダイアフラムマウント顕微鏡。 注：ダイヤフラムは全体のマウントの方法で染色し、分析されているので、筋肉が非常に厚いです。静止画像は、非共焦点蛍光顕微鏡を用いて撮影されたときその結果、蛍光染色の大部分は、完全に焦点から外れています。このような理由から、これはあなたが常に適切に個々のNMJのそれぞれの形態を識別するために「上」と「下」の筋肉を介して集中することができますように顕微鏡でリアルタイムでNMJ分析を実施することをお勧めします。彼らは、シナプス後受容体クラスターへの空間的関係にある組織を通って移動すると、このアプローチを使用して、人は簡単に個々の運動軸索の軌跡をたどることができます。 </li><li>筋肉の腹対背の長さを測定することにより、特定の脊髄レベル（ 図4H）からの地形神経支配のパターンに基づいて、分析のための3つの別々のセクションに筋肉を分割。 </li><li>筋肉やMOVの腹側領域で始まります背る、表面筋線維上にある顔のNMJアンすべてを分析します。 RBTXが原因で標識するために使用され、より大きな抗体に比べて、毒素の小さなサイズに筋肉へのより深い浸透（これは貧しい抗体の浸透に解釈が困難な場合があるように、より深い表面から第3-4繊維よりも筋肉繊維を分析しないでくださいニューロン）。 </li><li>ニューロンの事前端子軸索の直径が太く、神経末端の全ての領域が完全に下にある筋肉アセチルコリン受容体（AChRs）と重複している場合、完全なように、各NMJを特定します。 </li><li>基礎となる筋肉AChRsの任意の領域が神経終末を対応する占有されていない場合は、部分的除神経のように各NMJを特定します。 </li><li>筋肉AChRsには、対応する神経終末を持っていない場合は、1つは、神経末端の欠如はのために単純ではないことを確認することができますように（それは、焦点の同じフィールドで標識されたニューロンと他のNMJを持つことも重要である完全に除神経として各NMJを特定うんちR筋肉のその領域における抗体の浸透）。 </li><li>乗算神経支配のように複数のプレターミナル軸索神経支配個々NMJがある場合（これは、この接合部での神経再生の除神経、おそらく試みのいくつかのレベルがあったことを示している）各NMJを特定します。 </li><li> NMJは、神経終末とその下AChRs間の完全なオーバーラップを持っていますが、（これはまた、神経再生における除神経と試みのいくつかのレベルの指標である）シンプレ端子軸索を持っているかのように薄く神経支配各NMJを特定します。 </li><li>各動物のための上記のNMJカテゴリーのすべてのための3識別された領域のそれぞれについて分析を行います。同じ実験群の他の動物からの結果と、各動物からのデータを平均します。マウス半ダイアフラムにおけるラットヘミダイヤフラム筋肉および150〜200に約200〜300の接合部は、実験群当たり少なくとも3（好ましくは5〜6以上）の動物で定量化する必要があります。 </li><li>高解像度の共焦点画像を入手し、使用共焦点顕微鏡でパブリケーションのD、。 </li><li> 20〜40ミクロ​​ンの深さ0.3μmのステップサイズでZ-スタックを取得し、全体のシナプスプロファイルが含まれていることを確認するために、各接合部の上下に追加の光学切片を収集します。 </li><li>最大強度の予測にZシリーズの画像を再構成するために収集ソフトウェアを使用してください。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophysiological+recording+of+the+compound+muscle+action+potential+for+motor+unit+number+estimation+in+mice.">Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice.</a> Neuromethods. 78, 225-235 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).</li><li>Lepore, A. 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我々は、開示することは何もありません。

呼吸機能が呼吸、特に絞り神経支配を標的治療法の開発、外傷性SCIとALSの両方に妥協されるように、臨床的に5,6に関連しています。総合呼吸機能を研究するために、組み合わされたアプローチの方法が使用されるべきです。 CMapを外部の横隔神経刺激を介して振動板の機能神経支配の程度を測定するが、延髄脊髄の呼吸ドライブ8内因性ではありません。また、これらの記録は...

筋萎縮性側索硬化症（ALS）は、上位と下位運動ニューロンとその結果としての筋肉麻痺の両方の損失に関連する衰弱運動ニューロン疾患です。診断時には、患者の生存率は、平均でのみ2〜5年1です。横隔膜運動ニューロン（PhMN）の損失は、ALSの病因の重要なコンポーネントです。患者は、最終的には、振動板のPhMN神経支配、インスピレーション2,3の主要な筋肉の損失に起因する死亡します。外傷性脊髄損傷（SCI）は、関連する呼吸困難の深刻な問題です。 SCIの約12,000の新しい症例が原因で脊髄への外傷性損傷に毎年4起こります。場所、種類及び重症度に対する疾患の不均一性にもかかわらず、SCIの症例の大部分は、多くの場合、衰弱し、永続的な呼吸障害をもたらす頸髄に外傷を伴います。 ALSおよびSCIに加えて、他の中枢神経系（CNS）疾患は、W関連付けることができi番目の横隔膜呼吸不全5,6。 横隔神経は、同側半ダイアフラムを神経支配し、それは同側頸髄のC3-C5レベルに位置PhMN細胞体から発生する遠心性運動神経です。 PhMN出力は吻側腹呼吸器グループ（rVRG）7として知られているエリアに脳幹から延髄脊髄の入力を降順によって制御されます。 rVRG-PhMNダイアフラム回路は、吸気呼吸の制御、ならびに他の非換気ダイヤフラムの動作の中心です。この回路に影響を与える様々な外傷と神経変性疾患は、呼吸機能および患者の生活の質の顕著な低下につながることができます。ダイヤフラム神経筋接合部（NMJ）でrVRG、PhMN生存、横隔神経の整合性と適切な神経支配からPhMNsに入力を降順通常の絞り機能に必要なすべてのです。これは、技術を使用することが重要であること定量的ALS、SCIおよび他のCNS ​​疾患のげっ歯類モデルにおいてインビボでこの回路を評価することができます。 このプロトコルでは、目標は、電気生理学的および形態学的レベルの両方で振動板のPhMN神経支配を評価するための実験的なツールを記述することです。複合筋活動電位（CMapを）指定された運動神経の全ての遠心性運動ニューロンの軸索を刺激した後、ターゲットの筋線維の脱分極誘発さの応答を分析することによって記録されています。この技術は、PhMNs 8半横隔膜の神経支配の機能を定量化するために麻酔したラットおよびマウスにおいてインビボで使用することができます。原因CMapを、すべての同時記録（あるいは、少なくとも、多くの/ほとんどの）全体の半横隔膜の筋線維を表すという事実のために、それはまた、疾患を追跡するために、絞りNMJで、個々の運動軸索と筋線維の表現型を調べるために有用です - このような部分やcompleなどと治療関連の形態学的変化TE除神経、再生発芽および再支配。これは筋肉9を通して個々のNMJの詳細な形態学的評価に続いて、振動板の全体マウント免疫組織化学（IHC）を介して達成することができます。 CMapをを組み合わせ、NMJ分析は、定量的にCNSおよびPNS疾患の齧歯類モデルで横隔膜神経支配を研究するための強力なアプローチを提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:273px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">T353-500</td>
			<td style="width:167px;">Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2% Bovine serum albumin (2% BSA)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A3059-100g</td>
			<td>Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">T9284-100mL</td>
			<td>Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.1M Glycine</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G-7126</td>
			<td>Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#945;-bungarotoxin</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">T1175</td>
			<td>Concentration 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SMI-312&#160;</td>
			<td style="width:273px;">Sternberger Monoclonals</td>
			<td style="width:131px;">SMI312</td>
			<td>Concentration 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SV2</td>
			<td style="width:273px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:131px;">SV2-Supernatant</td>
			<td>Concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FITC goat anti-mouse IgG1</td>
			<td style="width:273px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">3117731001</td>
			<td>Concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Silicone rubber</td>
			<td style="width:273px;">Sylgard, Dow Corning</td>
			<td style="width:131px;">Part # 184</td>
			<td>Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Vectashield fluorescent mounting medium</td>
			<td style="width:273px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:131px;">H-1000</td>
			<td>This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Small Spring Scissors</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">15002-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dissection forceps</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Software for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">Scope 3.5.6; ADI</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Disk surface electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-409000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Subdermal needle electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-453100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Conductive gel</td>
			<td style="width:273px;">Aquasonic&#160;</td>
			<td style="width:131px;">122-73720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:332px;">Stimulator/recording system for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">ADI Powerlab 8SP stimulator&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amplifier for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">BioAMP</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

大人のSprague-Dawleyラットは、C4脊髄レベル10〜12のいずれかで椎弓切除のみ（非損傷対照）または一方的なヘミ挫傷SCIを受けました。 5週間後の手術では、椎弓切除術/損傷部位に半絞り同側から記録ピークCMAP振幅が大きく、椎弓切除のみの制御（ 図2B）と比較して、SCIラット（ 図2C）に減少しました。半ダイアフラムのすべてのNMJは対照非罹患野生型ラット（ ...

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Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

横隔運動ニューロンによってダイヤフラム神経支配の機能的および形態学的評価

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

functional-morphological-assessment-diaphragm-innervation-phrenic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.4K ビュー.  Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University. Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease. 

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Assessment of Motor Balance and Coordination in Mice using the Balance Beam

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice. Fine motor coordination and balance can be assessed by the beam walking assay. The goal of this test is for the mouse to stay upright and walk across an elevated narrow beam to a safe platform. This test takes place over 3 consecutive days: 2 days of training and 1 day of testing. Performance on the beam is quantified by measuring the time it takes for the mouse to traverse the beam and the number of paw slips that occur in the process. Here we report the protocol used in our laboratory, and representative results from a cohort of C57BL/6 mice. This task is particularly useful for detecting subtle deficits in motor skills and balance that may not be detected by other motor tests, such as the Rotarod.

Deficits in fine motor coordination can be assessed with the balance beam test. Performance on the beam is quantified by the speed at which the beam is traversed and the number of times the mouse slips on the beam.

バランスビームを用いてマウスにおける運動バランスとコーディネーションの評価

Brain injury, genetic manipulations, and pharmacological treatments can result in alterations of motor skills in mice.  Fine motor coordination and ...

神経科学

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

運動によって変調された神経細胞の生理的、形態学的および神経化学的キャラクタリゼーション

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

体外における筋モータープールのために運動ニューロンの識別<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

マウスにおける横隔膜の運動ニューロンの逆行性神経解剖学的トレーシング

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

マウスコクレアの特定周波数領域におけるリボンシナプスの形態学的および機能的評価

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

坐骨神経クラッシュ損傷のラットモデルにおける機能的評価のための3D運動学的解析

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

ショウジョウバエメラノガスターにおける軸索死における軸索とそのシナプスの形態学的および機能的評価

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study axonal growth, axonal trafficking, synaptogenesis, dendritic growth, dendritic plasticity and nerve-target interactions in co-culture systems. This protocol describes the isolation and dissociation of neurons from the superior cervical ganglia of E21 rat embryos, followed by the preparation and maintenance of pure neuronal cultures in serum-free medium. Since neurons do not adhere to uncoated plastic, neurons will be cultured on either 12 mm glass coverslips or 6-well plates coated with poly-D-lysine. Following treatment with an antimitotic agent (Ara-C, cytosine &#946;-D-arabinofuranoside), this protocol generates healthy neuronal cultures with less than 5% non-neuronal cells, which can be maintained for over a month in vitro. Although embryonic rat SCG neurons are multipolar with 5-8 dendrites in vivo; under serum-free conditions, these neurons extend only a single axon in culture and continue to be unipolar for the duration of the culture. However, these neurons can be induced to extend dendrites in the presence of basement membrane extract, bone morphogenetic proteins (BMPs), or 10% fetal calf serum. These homogenous neuronal cultures can be used for immunocytochemical staining and for biochemical studies. This paper also describes optimized protocol for immunocytochemical staining for microtubule associated protein-2 (MAP-2) in these neurons and for the preparation of neuronal extracts for mass spectrometry.

This paper describes the isolation and culturing of embryonic rat sympathetic neurons from the superior cervical ganglia. It also provides detailed protocols for immunocytochemical staining and for preparing neuronal extracts for mass spectrometric analysis.

形態学およびプロテオーム解析のための胚性子宮頸部神経節からのラット交感神経の培養

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...