Name: retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice
Uploaded: 2018-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice at JoVE.com

テクニカル サポートのためロバート Graffin とポーリーン Duhant に感謝しております。

実験的プロトコル実験動物 (2010/63/EU、86/609/EEC および 87-848/EEC) の欧州社会理事会指令に準拠して実施され、動物倫理委員会のナミュール大学 (倫理プロジェクト n ° 17-284 によって承認されました。).図 1は、2 つのそれぞれのアプローチを示しています: 横隔膜や経皮的注射。男性の c57bl/6 j マウスを使用 (n = 18) における 4 ヶ月 3 から歳。
1. CTB 溶液の調製
<ol><li>横隔膜注射: のため<ol>
<li>0.2% (w/v) 濃度を滅菌水で CTB 電源を溶解します。</li>
		<li>各マウス添付の 33 g 針 (鈍いまたは短いベベル) 滅菌 10 μ L 変らずに CTB 溶液 (0.2 %w/v) 7.5 μ L をロードします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>: 経皮的注射用<ol>
<li>0.1% (w/v) 濃度を滅菌水で CTB 電源を溶解します。</li>
		<li>それぞれのマウス用ベベル 27 g 針付き CTB 溶液 (0.1 %w/v) 500 μ l インスリン注射の 20 μ L をロードします。 蒸留水や滅菌水を使用する注: を確認し、正しく CTB 粉を溶解します。ソリューションは、4 ° C で 1 ヶ月保つことができる (凍結しないでください)。数日後、沈殿物を形作るかもしれない。部屋の温度にソリューションを持参し、使用前にピペットでよく混ぜ。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 左胸腔内注射する前の準備
<ol><li>オートクレーブまたはガラスビーズ滅菌器を使用して、手術前に手術器具を滅菌します。手術を行うこと、手術器具を処分するクリーン ベンチ コートを準備します。 注: 外科プロシージャの間に使用される物質は、無菌でなければなりません。消毒剤 (クロルヘキシジン) で拭く必要がある必要があります、変らずのように滅菌できない器具シングル-使用のみ。外科医は、手術の開始前に消毒剤 (クロルヘキシジン ・ スクラブ) で彼女の手を洗う必要があります。外科医は、クリーン ガウン、マスク、滅菌手袋を着用ください。</li>
	<li>動物の重量を量るし、麻酔の適切な投与量の管理: 麻酔薬カクテルの腹腔内注射 (例えばケタミン 100 mg/kg とキシラジン 5 mg/kg)。</li>
	<li>つま先をピンチやマウスはきちんと麻酔どう眼瞼反射の消失を確認します。角膜を保護するために獣医軟膏を塗る。</li>
	<li>(横隔膜のプロシージャ) の腹側の皮膚や右サイド胸部皮膚 (胸壁手順) の電動バリカンを使用して慎重にひげをそる。十分な広い手術フィールドに入る髪を防ぐためにひげをそる。</li>
	<li>剃毛エリアに 10% ヨウ素溶液の塗布により無菌状態を確保します。外周方向へサイトの中心からスクラブに注意しながらヨードと手術部位をスクラブします。</li>
	<li>動物の体の温度を維持するために、手術中恒温パッドを使用します。</li>
</ol>3. 胸腔注射横隔膜アプローチを使用して
<ol><li>加熱パッドで仰臥位で麻酔下のマウスを置きます。動物の首の下の圧延のガーゼのパッドを配置します。アダルト マウス、厚さ 0.5 インチの巻きガーゼのパッドを使用します。この場合の動きを避けるために手術ボード パッドをテープします。</li>
	<li>正中線に沿って腹側の皮膚を切開メス刃を使用して: 臍領域に横方向に皮膚をピンと張ったようにもう一方の手で肌を伸ばしながら、剣状突起から切開を行います。基になる臓器を損傷を避けるためブレードにあまりプレッシャーは適用されません。</li>
	<li>腹部の筋肉の切開の周りから肌をデタッチ慎重に小さなはさみを使用して。筋肉や、手術の終わりに離れて皮膚をステッチでこの手順が役立ちます。</li>
	<li>小さいはさみを使って手術を行います。臍のレベルでボタンホール切開を行い、腹腔内を開きます。白い線に沿って腹部の筋肉を切開 (「リネア アルバ」)、剣状突起まで。</li>
	<li>横隔膜の腹部の表面を視覚化するために商業的または自家製のリトラクターを使用して腹部の筋肉を撤回します。 注: これらのリトラクターは、midi サイズ ペーパー クリップ L フック19に形から作成できます。</li>
	<li>開腹とベンチ コートにリトラクターをテープの両方の側面を伸ばします。ビューのフィールドの照明を最適化すると、横隔膜の腹部の表面は周縁部のこれ以上ないです。この目的のための最も強力な照明装置が方向付けできる光線の LED ランプです。</li>
	<li>柔らかいピンセットを使用すると、1 つの手で、xyphoid の付録を持ち上げて、側葉の肝臓 (図 2 a) をプルダウンします。胆嚢またはダイヤフラム (図 2 b) を損なうことがなく、靱帯をカット小さなはさみを使用すると、他の一方で、慎重に。</li>
	<li>柔らかいピンセットを使用すると、1 つの手で、xyphoid の付録を持ち上げます。一方でハミルトン シリンジを把握します。内側や下腿の地域 (図 3 a、図 3Bの挿入)、胸骨をそれぞれカバーする右片側横隔膜の注入の 3 つのサイトをターゲットします。</li>
	<li>ダイヤフラム厚は約 0.37 mm マウス7で、呼吸時に肺損傷を防ぐためにダイヤフラム シートを超えて針より 1 または 2 mm を挿入します。各サイト (図 4 b) で右の横隔膜を CTB 溶液 (0.2 %w/v) の 2.5 μ L を提供します。横隔膜の安定化が必要ではありません。</li>
	<li>PhMN プールの二国間分類、髓注入 (図 1 a) の 3 つの同サイトでは、この手順を繰り返します。</li>
	<li>開腹サイトを閉じる、吸収性と腹筋 4-0 縫合糸を縫合します。使用中断ステッチ間隔によって 3 mm. の定番肌は傷 9.0 mm クリップで閉じている.ステープルを引っ張ってから動物を防ぐためにステープルを締めます。スペース約 5 mm 間隔のステープルします。障害の治癒につながるよう、傷クリップを過剰締めください。</li>
	<li>きれいなマイクロシリンジの目詰まりを防ぐために蒸留水。ゆっくりを描画し、追放する 2-3 回。注射器に空気を描画しません。</li>
</ol>4. 左胸腔内注入胸壁アプローチを使用して
注: このメソッドはラット4で説明されている手順からインスピレーションを得たが、マウスに合わせられました。
<ol><li>麻酔下マウス左側臥位置、加熱パッド (図 4 a) の上に置きます。</li>
	<li>手動触診 (図 4 b)、肘地域の下 6 番目と 7 番目の肋骨を識別します。</li>
	<li>アシスタントは、右手前- と -後肢 (図 5 a) を拡張しながら、注射器の頭側方向と接線方向 [第 6 または第 7 肋骨、3 mm ダウン (図 1 bと図 5 b) ベベルの皮膚から深いを挿入します。</li>
	<li>肋骨を持ち上げて、胸腔内 (図 5、図 1 bのくぼみ) にも配置されていることを確認してそっと針を昇格させます。</li>
	<li>胸壁に 2 本の指のわずかな圧力を適用することによって、胸の動きを呼吸を安定させます。</li>
	<li>もう一方の手で注射器を押した CTB 溶液 (0.1 %w/v) 単一の注入の 20 μ L を提供します。</li>
</ol>5. 手術後のケア
<ol><li>手順の後すぐに右側臥位の回復のための恒温パッドの上でマウスを置きます。これにより、トレーサーが胸腔内の右側の上に広げ、動物の呼吸を監視するため。</li>
	<li>皮下 1 mL 滅菌生理食塩 i. p. を管理します。脱水や物憂げな動物が表示されている場合は、フォロー アップの注射を提供します。</li>
	<li>ブプレノルフィン、0.1 mg/kg を皮下管理任意の潜在的な痛みを最小限に抑えるため最初 2 日後手術中に 1 日 2 回。 注: 多くの機関は、ここで描かれている開腹術などの侵襲的処置のためのマルチ モーダル鎮痛を推薦します。これは、非ステロイド性抗炎症 (NSAID) 薬や切開部位に局所麻酔薬の使用を含めることができます。これらの薬は、通常ねじまきの痛みを最小限に抑えるための最初の切開前に配信されます。</li>
	<li>毎日安楽死まで動物を監視します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cat+phrenic+nucleus+architecture+as+revealed+by+horseradish+peroxidase+mapping.">Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping.</a> Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).</li><li>Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+nucleus+of+the+albino+rat:+a+correlative+HRP+and+Golgi+study.">The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study.</a> J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).</li><li>Gordon, D. C., Richmond, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+in+the+phrenic+motoneuron+nucleus+demonstrated+by+retrograde+multiple-labelling+techniques.">Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques.</a> J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).</li><li>Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+phrenic+motoneurons+by+intrapleural+injection.">Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection.</a> J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion.">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury.">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).</li><li>Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phrenic+motor+nucleus+in+the+adult+mouse.">The phrenic motor nucleus in the adult mouse.</a> Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).</li><li>Laskowski, M. B., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+mapping+of+motor+pools+onto+skeletal+muscles.">Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles.</a> J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).</li><li>Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+the+ventral+respiratory+group+to+phrenic+and+intercostal+motoneurons+in+cat:+an+autoradiographic+study.">Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).</li><li>Gottschall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diaphragm+of+the+rat+and+its+innervation.+Muscle+fiber+composition;+perikarya+and+axons+of+efferent+and+afferent+neurons.">The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons.</a> Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).</li><li>Lai, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+Toxin+B+Subunit+Shows+Transneuronal+Tracing+after+Injection+in+an+Injured+Sciatic+Nerve.">Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve.</a> PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).</li><li>Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+cholera+toxin+by+different+endocytic+mechanisms.">Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms.</a> J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).</li><li>Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafting+with+cholera+toxin:+endocytosis+and+trafficking+from+plasma+membrane+to+ER.">Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER.</a> FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).</li><li>Fujinaga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+that+associate+with+lipid+rafts+mediate+transport+of+cholera+and+related+toxins+from+the+plasma+membrane+to+endoplasmic+reticulm.">Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm.</a> Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).</li><li>Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+cholera+toxin-ganglioside+GM1+complex+into+Golgi+and+induction+of+toxicity+depend+on+actin+cytoskeleton.">Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).</li><li>Abbott, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+axonal+transport+in+the+rat+visual+pathway.">Imaging axonal transport in the rat visual pathway.</a> Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration,+diaphragm+compromise,+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury.">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).</li><li>Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraspinal+cell+transplantation+for+targeting+cervical+ventral+horn+in+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+traumatic+spinal+cord+injury.">Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Llado, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+respiratory+motor+neurons+in+the+SOD1+G93A+transgenic+rat+model+of+ALS.">Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS.</a> Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).</li><li>Sieck, G. C., Fournier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diaphragm+motor+unit+recruitment+during+ventilatory+and+nonventilatory+behaviors.">Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors.</a> J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).</li><li>Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+cholera+toxin+with+isolated+hepatocytes.+Effects+of+low+pH,+chloroquine+and+monensin+on+toxin+internalization,+processing+and+action.">Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action.</a> Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

記載プロトコルは、成体マウスの任意のひずみまたはダイヤフラム PhMN 回路の整合性を評価する必要がある任意の実験パラダイムを適用できます。例えば、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、脊髄損傷 (cSCI) は、横隔神経軸索と後続の呼吸の妥協の前向性変性 PhMN 損失に関連付けられている条件です。ALS または cSCI の動物モデルは人間の病気にみられる病理組織学的および機能の呼吸欠損を模倣します。これらのモデルでは、組織学的技術頻繁 PhMN 生存次 PhMN 神経保護18,20,21を目指して様々 な治療介入を評価に適用されます。ダイヤフラム NMJ 吸収または軸索輸送のトラブル、神経細胞の細胞体に蓄積された CTB の量を妥協して間違いなく。横隔神経軸索または PhMN 変性の損失は明らかに脊髄に CTB retrotransported の量を減少します。
胸腔内投与の各アプローチには独自の長所と個の連続する横隔膜注射、かなり侵略的、開腹と裂と器官の突出を防ぐためにすべてのスキン層の注意ステッチを施行しました。開腹手術は通常呼吸22と干渉して 1 つは、PhMN 活動やレトロな輸送効率に影響を与える可能性が排除できません。ただし、注入中の横隔膜の直接可視化は、胸膜腔の成功したターゲットにすべての時間を保証します。経皮的注射は横隔膜注射と比較して低侵襲であり、したがってで考えられる手順として絞り込み、"Rs"の 3 つのコンセプトの静脈。1 つの欠点はされているの可能性が高まってオフのターゲット (例: 皮下組織や胸壁) 経験の浅いユーザーのため。
胸腔蛍光 CTB 投与、胸腔の内側を覆う筋肉に投影、運動ニューロンがラベル付けされること、PhMN、肋間神経の運動ニューロンまたは脳幹の運動ニューロンの異なった人口を含む可能性が高いです。成体ラット マンティラらは肋間神経の運動ニューロンもいくつかの後根神経節ニューロンの4と同様、胸部脊髄腹角でラベル付けされたことを示した。我々 は決してマウスで頸髄よりも他のサイトで CTB 標識細胞の存在をチェックしています。
実験の設定/モデルに応じて結果の措置 PhMNs が各 PhMN の位置に関する幾何学的データの詳細な分析は、脊髄に沿ってカラム状に配列を含めることができますまたは、として説明ここでは、PhMN の定量化数です。PhMN 総数の正確な評価は技術的な考慮事項と評価者間信頼性に依存します。ために CTB 蛍光強度、相馬サイズや背景の染色の変動。CTB fluorophore の横隔膜注射を使用経験が、他のグループ8からデータよりより少しの数 120 180 セル間の範囲のマウス hemicord あたりの PhMN 数と推定します。確かに、研究の 2 つの制限があります。最初に、動物の限られた数は、胸壁のアプローチを使用して注入され、PhMN プールの完全なラベル第二に不確実性があります。横隔神経のディップ (後に神経断裂) または蛍光の神経解剖学的トレーサーによる神経注射がより正確にすべての PhMNs をラベルに使用することができます補完技術。将来の研究は、PhMNs をカウントする、立体など公平な方法でことをお勧めします。
我々 の経験で私たち観測がない任意の明白な呼吸器赤字や合併症 (呼吸困難) 出血や気胸この手順など。ただし、横隔膜注射時にダイヤフラムが破損して場合、シャープな面取り、小さい直径の針を使用することを検討します。
避けるために動物の死を中または手術後にカクテルの麻酔の各コンポーネントの濃度を入念にチェックします。肝臓、腸、胆嚢またはダイヤフラムの表面に傷害を避けます。
ないいくつかの問題が原因である可能性があります PhMN の低ラベルまたは。場合は経皮的注入は、胸腔内をミス、再実行し肋骨の下針が挿入されている手動触診による確認かどうかが皮膚を通してポップアウト。CTB 溶液注入時に気泡を形作らないべきであります。覚えてもその神経細胞の CTB の内面化が pH 依存性23: 酸性および中性の pH は最適な基本的な pH は、毒素の吸収を損ないます。CTB 粉水、生理食塩水または PBS バッファーを再停止しなさいすることをお勧めします。神経細胞の細胞体でラベル付けされた毒素の永続化の時間を検討してください。私たちの経験では 4 日間と左胸腔内配信後 2 週間の間の時間帯にテレ標識細胞を検出でした。輸送を逆行する割り当てられた時間を短縮または組織蛍光 CTB の最適な検出を危険にさらす可能性があります胸腔配信と犠牲の間の時間を増加します。
避けるためには、蛍光退色は、適切な固定方法を使用します。バッファーに格納された 4% パラホルムアルデヒドで動物の体内を灌お勧めします。脊髄を収穫すると、同じ固定液で一晩インキュベートします。Cryoprotect、沈没までの 72 時間の 30% ショ糖のコードは頸部の拡大 (約 8 mm) を O.C.T. 中に埋め込みます。脱水またはパラフィン サンプルを埋め込むしないでください。全体の後処理中光から脊髄のサンプルまたはティッシュ セクションを保護します。固定全体脊髄保つことができる 4 ° C で数ヶ月のチメロサールが各種凍害保護ソリューションに追加されます (蛍光退色を引き起こすでしょう、アジ化ナトリウムを追加しないでください)。切片は、光から離れて数ヶ月の-20 ° C で保存できます。最後に、抗退色試薬とスライドをマウントをお勧めします。蛍光性が薄れている、免疫組織染色による CTB を検出することも可能です。

研究の目的は、横隔膜運動ニューロン (PhMN) マウスの脊髄のセクションを識別するために信頼性の高い方法を提示することです。胸腔内に蛍光の神経解剖学的トレーサーの注入は、横隔膜に横隔神経筋の予測をアクセスし、横隔細胞体のラベルに横隔神経軸索に沿って逆行性輸送を使用する配信方法として選ばれました。左胸腔内配信の 2 つのテクニックを説明: 経胸壁と横隔膜。
横隔膜の運動ニューロンは、脊髄の中継細胞の軸索が最終的に横隔膜を支配する横隔神経へ収束です。これらは、下位運動ニューロン延髄呼吸センターから吸気ドライブを受け取ると横隔膜神経-筋接合部 (NMJ) を中継します。PhMN は、半ば頸部の背骨に沿って実行している、各 hemicord の 1 つのモーター列に構成されています。人間を含む哺乳類の種のほとんどは、横隔膜運動列レベル C3 から C61,2,3に します。私たちと他の人は、PhMN がラットおよびマウス脊髄4,5,6,7、8に C3 ~ C5 レベルで集中してを確認しています。横隔細胞の地形の分布はランダム。横隔膜胸骨部を支配する運動ニューロンは、下腿の一部を支配する運動ニューロンがより尾側 (C5)9に対し横隔モーター プール (C3) の頭蓋の部分でより密分散されます。さらに、PhMN は脊髄前角の灰白質にいろいろクラスター化します。C3 レベルで横隔細胞のクラスターが横方向に, うそをつくし、腹の方向にシフトして、最も尾側レベル10、11ventromedially があります。
吸気時に重要な役割を与え、健康的な脊髄の PhMN を正確に識別するが、また変性疾患や脊髄の外傷などの病理学の条件の中に、彼らの運命に従う最も重要であるのです。以来、PhMN は他の頚椎の運動ニューロンから形態学的違いは、PhMN の同定は、神経解剖学的トレーサー レベル主に人工呼吸器センター8、またはダイヤフラム NMJ7またはのいずれかのターゲットを絞った配信横隔神経の4。トレーサーは、神経線維によってとられ、頸椎、横隔細胞体まで運ば直接的または間接的な検出システムを使用して視覚化することができますここ。逆行性または前向性トレーサー抱合体の広い範囲で市販されています。注目すべき、各トレーサーは無しで、恵まれているトランス シナプス トレースの低または高能力。
現在の研究では、我々 修飾と Alexa Fluor 555 (CTB fluorophore として今後呼ばれる) コレラ毒素 (CTB) の β サブユニットとして選んだ蛍光ラベル冷凍脊髄のセクションで PhMN の直接視覚化を許可します。CTB は、実験データは、シナプス通過12を表示する傾向があるが通常シナプスのトレーサーとして記述されます。CTB で神経終末の細胞膜ガングリオシド GM1 をバインドする機能があります。CTB がクラスリン依存または独立したメカニズムとトランスゴルジ ネットワークを介してトラフィックを介して逆行性ファッション13,14の小胞体に内部的なもの。インターナライゼーションと逆行輸送アクチン細胞骨格15,16だけでなく微小管ネットワーク17依存するようです。
CTB fluorophore は CTB のダイヤフラム PhMN 回路をラベリング逆行性神経解剖学的トレーサーとしての有用性を示すためには、intrapleurally を配信されました。CTB は、2 つの手法が投与された: 最初の 1 つに開腹し, と複数の横隔膜の注入; が含まれています。2 番目の 1 つ、低侵襲を使用独自の経胸壁射出。4 日後、蛍光標識した PhMNs は健康とする傷つけられた (C4) 動物からの両方から頚髄損傷の定量化されました。

<table><tbody><tr><td>Glass-bead sterilizer Steri 250</td><td>Keller</td><td>31-101</td><td></td></tr><tr><td>Small scissors</td><td>F.S.T.</td><td>14058-00</td><td></td></tr><tr><td>Soft tweezers</td><td>F.S.T.</td><td>11042-08</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blades</td><td>Swann Morton</td><td>No.11 or 15</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>C22843</td><td>Bring at room temperature before use&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10ul Hamilton syringue, removable needle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>701RN</td><td></td></tr><tr><td>33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4</td><td>Filter Service</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge</td><td>Terumo</td><td>BS05M2713</td><td></td></tr><tr><td>Orientable LED lamp</td><td>V.W.R.</td><td>631-0995</td><td></td></tr><tr><td>Resorbable 4/0 sutures</td><td>S.M.I. AG</td><td>15151519</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>F.S.T.</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>9mm autoclips</td><td>Bioseb</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip 9mm applier</td><td>Bioseb</td><td>MikRon 9mm</td><td></td></tr></tbody></table>

retrograde neuroanatomical tracing of phrenic motor neurons in mice

横隔膜の運動ニューロンは、頚椎の運動ニューロンが C3 から C6 レベルほとんどの哺乳類の種への発信です。軸索投射は、呼吸の横隔膜を刺激する横隔神経に収束します。脊髄スライスでは、形態学的または生化学的基準に他の運動ニューロンから横隔膜の運動ニューロンを識別できません。マウス、コレラ毒素サブユニット β (CTB)、fluorophore に活用されるの次の左胸腔内注入で横隔膜の運動ニューロン細胞体を可視化するための手順の説明を提供します。この蛍光の神経解剖学的トレーサーは、横隔膜神経筋接合部に巻き込まれる、横隔神経軸索に沿って逆行性にされ、横隔膜の細胞体に到達する能力を持っています。胸腔テレ配信の 2 つの方法論的アプローチの比較: 経皮的注射と横隔膜。両方のアプローチは成功している、CTB ラベル横隔膜運動ニューロンの数がほぼ同じ結果します。結論としては、これらの技術は、可視化やダイヤフラム隔回路に焦点を当てたものなど様々 な実験的研究で横隔膜の運動ニューロンを定量化に適用できます。

男性の c57bl/6 j マウス (n = 18)、3 から 4 ヶ月に高齢者が研究に含まれていた。実験の日 0、8 マウスは公開プロトコル7,18によると一方的な C4 挫傷、右サイドを受けた。偽の手順としては、10 匹のマウスは、挫傷なし C4 の上に椎弓切除術を施行した.3 日目でマウスは上記で説明した 2 つの異なる手順によると CTB fluorophore の左胸腔内注入のために準備されました。麻酔後 7 日ですべてのマウスを安楽死させ (ケタミン 100 mg/kg とキシラジン 5 mg/kg) とデスメタル。
パラホルムアルデヒドと標準的な実習の手順によると 30% ショ糖で cryoprotected を固定全体脊髄が収穫されました。頸部の拡大が分離された縦方向または横方向でも、30 μ m の厚さで O.C.T. と cryosectioned に埋め込まれます。
脊髄縦断蛍光分析用フィルター キューブ装備 epifluorescent 顕微鏡による観察 (励起: 560/20 nm;放出: 635/30 nm)。蛍光脊髄前角運動ニューロンは、セル C3 から C5 レベル (図 6A、上部のパネル) の線形列として識別されました。ラベルのすべてのセルは、同側の灰白質に位置していたし、運動ニューロン (図 6 b) と一貫性のある形態を展示します。負傷した動物は、脊髄組織の混乱 (図 6 aと6 Cのアスタリスク) と共に、C4 レベルでラベル付き PhMN の顕著な損失が観察されました。CTB+ PhMNs は、無傷と C4 負傷脊髄 (図 6) での第 5 回すべて横セクション (150 μ m 間隔) を手動で数えられました。ラベル付き PhMNs の合計数の推定は 5 カウントの CTB+のセルの数を乗じて算出しました。無傷の健康なマウスに 178 ± 9 胸壁 (TTho) アプローチ (図 6) を使用する場合に比べて、横隔膜 (TDia) アプローチを使用する場合、ラベル付き PhMNs hemicord あたりの合計数は 151 ± 9 で推定されました。C4 外傷後にこれらの数字は、それぞれ 59 ± 14 と 70 ± 10 に減少しました。この研究では、統計的な差異が立証胸腔配信の 2 つの方法の間 (p > 0.05、マン-ホイットニーの U 検定;TTho 対 TDia)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig1.jpg"> 図 1。横隔膜や経皮的注射を用いた胸腔注射。横隔膜アプローチには、胸骨、下腿内側の地域Aで開腹した、(ピンク色) ダイヤフラムの腹部の表面の露出および 3 つの注射が含まれます。胸壁アプローチのマウスは、左側臥位に置かれています。6 番目と 7 番目の肋骨は、手動触診Bによって肘領域下で識別されます。針は、皮膚、皮下組織、胸郭の筋、肋間筋、胸腔 (アスタリスク) に到達する壁側胸膜が挿入されます。S、胸骨;m、内側。c、下腿;S/SC、皮膚及び皮下組織;TM、胸部筋肉;IC、肋間筋pp;壁側胸膜L、肺。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56758/56758fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig2.jpg"> 図 2。肝臓、胆嚢、横隔膜の腹部の顔を望む手術フィールド。A.胆嚢と横隔膜の間靱帯に注意してください。B.靭帯が慎重に切り取られます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56758/56758fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig3.jpg"> 図 3。横隔膜のビュー 。胸骨 (s)、内側 (m)、下腿 (c) エリアは、右の横隔膜の片側で識別されます。A.下腿地域肝葉の後方であることに注意してください。B.胸膜腔に CTB を注入するには、ヘミ横隔膜を深さ 1 mm の針を挿入します。内側の領域に注入は図解.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56758/56758fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig4.jpg"> 図 4。胸壁アプローチ。マウスは、左側臥Aに配置されます。横隔膜と肘地域の肋骨縁を識別します。B。 6 番目と 7 番目の肋間スペース、深い肘地域に識別されます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56758/56758fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig5.jpg"> 図 5。6 番目と 7 番目の肋間スペース、肘地域に深い識別されます。A. 前面と後肢が拡張されます。B。 注射器の頭側方向と接線方向第 6 または第 7 肋骨、ベベル逆さまで、肋間筋を深さ 3 mm の下に挿入します。C. 針がゆっくり上昇し、針はよく胸腔内に配置を確認するため肋骨が持ち上げられます。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56758/56758fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56758/56758fig6.jpg"> 図 6。Intrapleurally を注入したマウスの脊髄前角の灰白質の CTB+セル。A.する無傷のマウスで CTB+横隔膜運動ニューロンは脊髄頸部レベル C3 から C5 に配布します。打撲のマウスの組織破壊は C4 レベル (アスタリスク) で CTB+横隔膜運動ニューロンの損失と一方的観察されます。B.ラベル CTB+細胞は同側の灰白質に位置していたし、の運動ニューロンと一貫性のある形態を展示します。C.脊髄の横断面は無傷 (左) や怪我 (右) マウスの脊髄に沿って特定の距離で CTB+セルの数を定量化するために使用されました。D.定量化の CTB+セル横隔膜 (TDia) または胸腔テレ配信の胸壁 (TTho) のアプローチによると、無傷、または負傷したマウスにおける同側の hemicord が見つかりました。バーを表す 250 μ m. データ (SEM) の平均の平均 ± 標準誤差として表現されました。n = 各 TDia グループ内 5-7 マウスn = 各 TTho グループ 3 のマウス。非パラメトリック マン-ホイットニーの U 検定を行ったし、結果は p のために大幅に異なる考慮された < 0.05。p < 0.001 の C4 損傷対無傷します。<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56758/56758fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice at JoVE.com

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

ここでは、蛍光体の左胸腔内配信共役コレラ毒素サブユニット β 後マウスにおける横隔膜の運動ニューロンを識別するためのプロトコルについて述べる.胸腔内を注入する 2 つの手法を比較: 横隔膜胸壁アプローチ対。

マウスにおける横隔膜の運動ニューロンの逆行性神経解剖学的トレーシング

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

retrograde-neuroanatomical-tracing-of-phrenic-motor-neurons-in-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K ビュー.  Université de Namur. ここでは、蛍光体の左胸腔内配信共役コレラ毒素サブユニット β 後マウスにおける横隔膜の運動ニューロンを識別するためのプロトコルについて述べる.胸腔内を注入する 2 つの手法を比較: 横隔膜胸壁アプローチ対。

ビデオ: Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

神経科学

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

発生生物学

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

横隔運動ニューロンによってダイヤフラム神経支配の機能的および形態学的評価

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the development of several animal models of these neuromuscular disorders has provided the scientific community with different therapeutic scenarios aimed at delaying or reversing the progression of these conditions. By taking advantage of the retrograde machinery of neurons, one of these approaches has been to target skeletal muscles in order to shuttle therapeutic genes into corresponding spinal cord motor neurons. Although once promising, the success of such gene delivery approach has been hampered by the sub-optimal number of transduced motor neurons it has so far shown to yield. Motor end plates (MEPs) are highly specialized regions on the skeletal musculature that are in direct synaptic contact to the spinal cord &#945; motor neurons. In this regard, it is important to note that, so far, the efforts to retrogradely transfer genes into motor neurons were made without reference to the location of the MEP region in the targeted muscles. Here, we describe a simple protocol 1) to reveal the exact location of the MEPs on the surface of skeletal muscles and 2) to use this information to guide the intramuscular delivery and subsequent optimal retrograde transport of retrograde tracers into motor neurons. We hope to utilize the results from these tracing experiments in further studies into investigating retrograde transport of therapeutic genes to spinal cord motor neurons through the targeting of MEPs.

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

モーターエンドプレートに沿って筋肉内注射：直接運動ニューロンへのシャトルトレーサーへの低侵襲アプローチ

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

Ex Vivoセル固有カルシウム マウス ダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

A Mouse Model of Direct Anastomosis via the Prespinal Route for Crossing Nerve Transfer Surgery

Crossing nerve transfer surgery has been a powerful approach for repairing injured upper extremities in patients with brachial plexus avulsion injuries. Recently, this surgery was creatively applied in the clinical treatment of brain injury and achieved substantial rehabilitation of the paralyzed arm. This functional recovery after the surgery suggests that peripheral sensorimotor intervention induces profound neuroplasticity to compensate for the loss of function after brain damage; however, the underlying neural mechanism is poorly understood. Therefore, an emergent clinical animal model is required. Here, we simulated clinical surgery to establish a protocol of direct anastomosis of bilateral brachial plexus nerves via the prespinal route in mice. Neuroanatomical, electrophysiological, and behavioral experiments helped identify that the transferred nerves of these mice successfully reinnervated the impaired forelimb and contributed to accelerating motor recovery after brain injury. Therefore, the mouse model revealed the neural mechanisms underlying rehabilitation upon crossing nerve transfer after central and peripheral nervous system injuries.

We simulated clinical surgery to establish a protocol of direct anastomosis of bilateral brachial plexus nerves via the prespinal route in mice, contributing to the study of the neural mechanisms underlying rehabilitation upon crossing nerve transfer after central and peripheral nervous system injuries.

交差神経移植手術のための脊髄前ルートを介した直接吻合のマウスモデル

Crossing nerve transfer surgery has been a powerful approach for repairing injured upper extremities in patients with brachial plexus avulsion injuries. ...

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. This standard approach can be challenging for targets in the caudal brainstem and upper cervical cord due to specific anatomical challenges as these sites are remote from skull landmarks, leading to imprecision. Here we outline an alternative stereotaxic approach via the cisterna magna that has been used to target discrete regions of interest in the caudal brainstem and upper cervical cord. The cisterna magna extends from the occipital bone to the atlas (i.e., the second vertebral bone), is filled with cerebrospinal fluid, and is covered by dura mater. This approach provides a reproducible route of access to select central nervous system (CNS) structures that are otherwise hard to reach due to anatomical barriers. Furthermore, it allows for direct visualization of brainstem landmarks in close proximity to the target sites, increasing accuracy when delivering small injection volumes to restricted regions of interest in the caudal brainstem and upper cervical cord. Finally, this approach provides an opportunity to avoid the cerebellum, which can be important for motor and sensorimotor studies.

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice commonly involves access through the skull bones and is guided by skull landmarks. Here we outline an alternative stereotaxic approach to target the caudal brainstem and upper cervical spinal cord via the cisterna magna that relies on direct visualization of brainstem landmarks.

マウスのCisterna Magna を介して 尾側脳幹および上部頸椎脊髄をマイクロインジェクションする定位的外科的アプローチ

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. ...

マウス交感神経ニューロンの標的化:腰椎交感神経切除術アプローチ

Surgical Lumbar Sympathectomy in Mice

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays many critical roles in maintaining bodily homeostasis, but it has rarely been studied in the context of peripheral nerve injury. The extent of postganglionic sympathetic neuronal functions in distal targets in the periphery is currently unclear. To better explore the role of sympathetic innervation of peripheral targets, a surgical &#34;knock-out&#34; model provides an alternative approach. Although this can be achieved chemically, chemical destruction of postganglionic sympathetic neurons can be nonspecific and dose-dependent. The use of a surgical lumbar sympathectomy in mice, once thought to be &#34;virtually not practicable&#34; in small animals, allows for specific targeting of postganglionic sympathetic neurons that innervate the hind limbs. This manuscript describes how to surgically remove the L2-L5 lumbar sympathetic ganglia from a mouse as a survival surgery, which reliably decreases the hind paw sweat response and the number of sympathetic axons in the sciatic nerve.

著者スポットライト:交感神経ニューロンの可塑性の探索

This manuscript presents a protocol for surgically removing the postganglionic lumbar sympathetic neurons from a mouse. This procedure will facilitate a multitude of studies aimed at investigating the role of sympathetic innervation in distal tissue targets.

マウスの外科的腰椎交感神経切除術

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays ...

マウスにおける横隔膜の運動ニューロンの逆行性神経解剖学的トレーシング

要約

さらに動画を探す

この動画の章

ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

横隔運動ニューロンによってダイヤフラム神経支配の機能的および形態学的評価

モーターエンドプレートに沿って筋肉内注射：直接運動ニューロンへのシャトルトレーサーへの低侵襲アプローチ

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

Ex Vivoセル固有カルシウムマウスダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

交差神経移植手術のための脊髄前ルートを介した直接吻合のマウスモデル

マウスのCisterna Magna を介して尾側脳幹および上部頸椎脊髄をマイクロインジェクションする定位的外科的アプローチ

マウスの外科的腰椎交感神経切除術

マウスの外科的腰椎交感神経切除術

マウスにおける横隔膜の運動ニューロンの逆行性神経解剖学的トレーシング

要約

さらに動画を探す

この動画の章

ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

横隔運動ニューロンによってダイヤフラム神経支配の機能的および形態学的評価

モーターエンドプレートに沿って筋肉内注射：直接運動ニューロンへのシャトルトレーサーへの低侵襲アプローチ

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

Ex Vivoセル固有カルシウム マウス ダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

交差神経移植手術のための脊髄前ルートを介した直接吻合のマウスモデル

マウスのCisterna Magna を介して 尾側脳幹および上部頸椎脊髄をマイクロインジェクションする定位的外科的アプローチ

マウスの外科的腰椎交感神経切除術

マウスの外科的腰椎交感神経切除術

Ex Vivoセル固有カルシウムマウスダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

マウスのCisterna Magna を介して尾側脳幹および上部頸椎脊髄をマイクロインジェクションする定位的外科的アプローチ