This project was funded by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada and the Alberta Innovates - Health Solutions CRIO Team program. MBK is a recipient of studentships from Alberta Innovates - Health Solutions and the Multiple Sclerosis Society of Canada. SKJ is funded by a graduate student support grant from the Alberta endMS Regional Research and Training Center of the Multiple Sclerosis Society of Canada. The authors wish to acknowledge Dr. Jan van Minnen and the Regeneration Unit in Neurobiology core facility for training and use of equipment.

注：この手順で使用する動物は動物管理上のカナダ人評議会（CCAC）のガイドラインに従って世話た。倫理はカルガリー大学の動物ケア委員会によって承認された。 1.注射用シリンジを準備<ol><li>少量のアリコート（75μL）で-20℃で、店舗; 1％のリン酸緩衝生理食塩水で液（pH7.4 PBS）にリゾレシチン溶かす。 RTにバイアルを解凍する。 NOTE：リゾレシチンが未溶解であれば、均一な溶液を形成し、約30分間超音波洗浄機（40 kHz）のチューブを超音波処理する。 </li><li>繊細な先端部を損傷しないように細心の注意を払って、事前に引っ張らガラスキャピラリーを処理します。 10μlの注入シリンジのナットを緩めてフェルールの嵌合端が整列し、毛細血管が円錐形のフェルール（ 図1）でジャストサイズであることを確認、2フェルールに続く毛細血管の平坦な端にそれを通します。 isopropで注射器をすすぐイルアルコール及びプランジャーを取り外します。乾燥したら、注入注射器の上にタイトな針アセンブリの手をねじ込みます。 </li><li>プライミングシリンジに金属ハブ針を取り付けます。ピアース針でゴムディスクとベースにそれを下にスライドさせます。リゾレシチンでプライミング注射器を埋める。液体は、針の先端に表示されるまで、静かにプライミング注射器を押し下げる。これは気泡が注入注射器に導入されることはありませんが保証されます。 </li><li>注入シリンジにプライミング注射器の金属ハブ針を挿入します。毛細血管が液で先端にいっぱいになるまでゴムディスクとしっかりシールを作り、ゆっくりプライミングシリンジを押し下げる。同時に気泡を導入することなく、注入シリンジのバレルを埋めるために押しながら慎重にプライミング注射器を取り外します。注入シリンジにプランジャーを挿入し、プランジャが優しく押されたようなソリューションは、キャピラリの先端から流れを確認してください。 注意：気泡がキャップに表示された場合illaryまたは注射器を注入し、注射器の準備を最初から繰り返す必要があります。注入装置内の連続流体は、正確な注入量を確保することが重要です。 </li><li>定位マイクロマニピュレータのアームに完成した注入シリンジを取り付けます。この完成した装置が再充填される必要の前に15〜20の動物を注入することができます。 </li><li>プライミングシリンジから残りのリゾレシチンを捨てる。撤回し、イソプロピルアルコールを数回押すと、金属ハブ針を取り外す。再び充填する前に蒸発させるためにプライミング注射器の残りのイソプロピルアルコールのために数時間待ちます。 </li></ol> 2.手術手順のために動物を準備注：この手順は、雌のC57BL / 6マウスについて記載した8〜10週齢ている。 <ol><li>ケタミン（200ミリグラム/ kg）およびキシラジン（10mg / kg）のまたは施設動物ケア規制あたり腹腔内注射で動物を麻酔する。計画する注射用麻酔を使用している場合で約1時間、麻酔下にある動物。 </li><li>動物が深くしっかりと足をつまんで麻酔をしていることをテストします。適切に麻酔した動物は、ピンチに応答しません。 </li><li>バリカンを使用して、耳に近い動物の背側2-3 cm 2の面積を、剃る。耳を傷つけないように注意してください。 </li><li>ガーゼパッドに適用される70％のエタノールできれいな部分を拭いてください。すべてのクリップされた髪はエリアから削除されていることを確認してください。ヨウ素とエリアを消毒する。 </li><li>作業中は乾燥を防ぐために、目にワセリンを適用します。 </li><li>手順を開始する準備ができるまで加熱された回収室で動物を保​​管してください。 </li></ol> 3.手術手順を実行します注：手順のすべてのステップのための適切な無菌操作を確認してください。これは手袋、hairnets、マスク、ドレープの適切な使用が含まれています。すべてのツールはコンタックに来る前に滅菌する必要があります動物とトン。 <ol><li>定位フレーム、背側までに動物を移動し、背骨の湾曲を誇張するために折り畳まれた紙タオルによって中間部分に上昇。外科テープで腕や尾を固定し、歯クランプで頭部を固定します。安定耳のバーは、この手順のために必要ではない。 </li><li>ちょうど耳の下に開始し、尾側方向に切断、3cmの正中切開を作るためにメスを使用してください。 </li><li> 2つの大きな脂肪構造間の格差を見つけて、これらを引き離すために、それぞれの手で細かい鉗子を使用しています。手術野を開くには、リトラクターを広げた。 </li><li>手術用顕微鏡下では、T2の椎骨の顕著な成長過程を見つけ（注：この機能は、C57BL / 6マウス系統の特徴である）。よりよいT2を可視化するためにオーバーレイ筋肉組織を通じて、閉じた春のハサミで鈍的切開を行います。鉗子を使用して、適切な解剖学的位置を確認するために、T3、T4の硬い表面のために感じる。 </li><li>春のはさみを使用して、T3とT4の間の結合組織の（2〜3ミリメートルの深さ）浅い横カットを行う。によるマウス脊柱の上部胸部椎骨間の自然の間隔に、椎弓切除術は、脊髄を明らかにする必要はない。深すぎるカットはコードを貫通し、損傷していることに留意してください。 注：出血の小さな程度は、このステップの間が一般的です。この問題が発生した場合、出血治まっ（30〜60秒）までの領域にスポンジ槍を開催しています。 </li><li>脊髄を視覚化。コー​​ドを露出させ、この髄膜層がまだカットされなかった場合、それは目に見える硬膜の厚い層で覆われます。著名な血管が脊髄のおおよその正中線を通して尾/吻側を実行します。 注：この血管系は、正中線のためのランドマークとして使用すべきではありません。代わりに、適切な照明が脊柱に隣接するグレー白質の境界を明らかにする必要があり、これらは正中線を推定するために使用されるべきである。 </li><li>硬膜の場合それがクリアされるまでそのまま残り、32のG金属針で穏やかな横方向の擦り傷を作る。目標は、厚いと見ることが困難ではない残りの根本的な髄膜をカットしないが、硬膜を除去することである。 注：脳脊髄液の放出は、くも膜の違反を示し、これは、組織への機械的な損傷を与えることなく発生する可能性がありながら、蓄積された脳脊髄液は、より良いコードの表面を可視化するためにスポンジ槍で削除する必要があります。 </li><li>所定の位置に注入する注射器を移動し、キャピラリの先端がかろうじて正中線の両側の直ぐ横の脊髄に触れるまでゆっくりとそれを下げる。所定の位置に腕をロックします。 </li><li>ベースライン位置測定を行うために、Z方向定位アームの段階的な測定値を使用してください。この読みから、1.3ミリメートルを引く。組織を貫通するの迅速かつ浅い下向きの運動を使用し、新しい測定に到達するまで、慎重にキャピラリーを下げる。オプション：必要に応じて、背側の列の病変は正中線で同じ突き刺し運動と0.3ミリメートル（詳細については、議論を参照）の深さで製造することができる。 注：これらの値は、T3とT4の間で注入するための固有のものです。脊髄内の他の場所で噴射を行うことを選択した場合、これらの値は、任意の利用可能なマウス脳アトラスから導出されなければならない。 </li><li>腹側脊髄白質にリゾレシチン押し下げマイクロマニピュレーターを使用してください。 0.5μlの最終容量で、その結果、2分間マイクロマニピュレータの1回転ごとに5秒を行います。ソリューションの逆流を防止するために、2つの追加分の場所に毛細血管のままにしてから、慎重に毛細血管を削除します。 </li><li>脊柱を重ね筋肉/脂肪組織内の単一の縫合糸を結ぶ。皮膚を閉じるには、非中断された縫合糸を使用してください。切開部位へのより多くのヨウ素を適用します。 </li><li>それが回復するまで、そのケージに戻した後、加熱された回収室で動物を置きます。鎮痛薬の適用後動作的制度的動物管理規則に従って。動物が完全に歩行可能と自己摂食とすぐ麻酔からの彼らの回復として飲むことのできるように追加の術後ケアは通常は必要ありません。 </li><li>残りの動物のための手順を繰り返します。 注：習熟すると、操作は特に縫合糸を結ぶ第二の人の助けを借りて、動物あたり10〜15分で完了することができます。先端が鈍いとなり、交換しなければならない前に、同一のガラスキャピラリーは、約15-20手術のために使用することができる。代わりに、リゾレシチンの脊髄にPBSを注射して、説明したように制御手術は同一に行うことができる。私たちは、将来の使用のために毛細血管のクリーニングはお勧めしません。 </li></ol> 4.組織の処理と解析<ol><li>所望の時点で、ケタミン（500 mg / kgを）およびキシラジン（25mg / kgの）の腹腔内過剰摂取で動物を生け贄に捧げる。病変は通常、follで進化による方法：1-3日、アクティブな脱髄。 3-7日、OPCの募集。 7-10日、オリゴデンドロサイト分化。 10-21日、アクティブな再ミエリン2,10,11。 </li><li>最初のPBS中の20 mlの氷冷4％パラホルムアルデヒド、続いて20ミリリットルRT PBSを経心灌流12を実行し、組織学のために組織を調製した。半または超薄切片用樹脂包埋組織の調製のために、ステップ4.9を参照してください。 </li><li>各脊椎、脊柱の頸部の終わりで始まり、下位胸椎レベルまで作業を切断するように湾曲した骨のはさみを使用して脊髄を削除します。 4℃でPBS中の4％パラホルムアルデヒド中で脊髄O / Nを修正。少なくとも72時間、4℃でPBS中30％のショ糖にコードを切り替えます。 </li><li>脊髄の背側表面上の異常として注射部位を同定する。 （中央の注射部位との）組織の3ミリメートルピースをカットし、最適な切削温度（OCT）Coを含むcryomoldsにピースを揃えるmpound。 10月には完全に凍結するまで2-メチルブタンとドライアイスの冷蔵混合物中のcryomoldsの下側を一時停止します。セクションの準備ができるまで-80℃で保管してください。 </li><li>顕微鏡スライド上に20μmの幅でセクションクライオスタット上で脊髄を、空気乾燥Oに許可/ N、-20℃でスライドを格納する前に。 </li><li>ミエリン13のエリオクロムシアニン組織学的染色を用いて病変の位置およびサイズを検出する。 RTですべての手順を実行します。 30分間空気乾燥スライド。 1分間ずつ段階的エタノール溶液中で再水和に続いて1分（100％、95％、90％、70％、50％、水）のためのクリアリング剤の代わりにスライドする。 <ol><li>水で1分間洗浄した15分間のエリオクロムシアニン溶液中でスライド、。水で1分間洗浄し、続いて10秒間、0.5％水酸化アンモニウム中で分化する。明視野マイルで1分間取り付けメディアそれぞれ、カバースリップ、および画像のため（上記のように順序を逆に）段階的なエタノール溶液中で脱水するcroscope。 </li></ol></li><li>軸索とミエリンを可視化するために免疫組織化学を使用してください。 30分間空気乾燥スライド。 RTで2分間ごとに、段階的なエタノール（水中、50％、70％、90％、95％、100％）で脱水し、再び水に順序を逆にする。このステップでは、個々のミエリンリング14のより高い解像度になる。 <ol><li> RTで60分間、PBS中10％ヤギ血清と0.25％のトリトンX-100を使用して、非特異的抗体相互作用をブロックする。一次抗体（：2000、ウサギ抗MBP 1：マウス抗SMI312 1千）で希釈し、PBS中にし、O / N 4℃でスライド上でインキュベートする。 </li><li>室温でPBSで5分間5回洗浄する。 PBS中、室温で60分間スライド上でインキュベートした二次抗体（500：500、アレクサ546抗マウス1のAlexa 488抗ウサギ1）で希釈する。室温でPBSで5分間5回洗浄する。マウントは、蛍光顕微鏡でgelvatolとイメージを使用して、カバーガラスと摺動する。 </li></ol></li><li>オリゴデンドロサイト系統の細胞を可視化するために免疫組織化学を使用してください。 STの手順に従ってくださいディスコグラフィ4.7、脱水/再水和工程を省略し、10％ウマ血清の代わりにヤギ血清を用いて。ヤギ抗PDGFRα1：100、マウス抗CC1 1：200、ウサギ抗OLIG2 1：200以下の一次抗体希釈液を使用してください。アレクサ488抗ヤギ1：500、アレクサ594抗マウス1：500、アレクサ647抗ウサギ1：500以下の二次抗体の希釈液を使用してください。 </li><li>半または超薄切片用組織を調製するために、第腔的潅流を行い、12mlの 20 RT PBSをPBS中の20 mlの氷冷4％パラホルムアルデヒド/ 1％グルタルアルデヒドが続く。ステップ4.3で説明したように、脊髄を除去します。 4℃でPBS中の4％パラホルムアルデヒド/ 1％グルタルアルデヒドでO / Nを修正。 </li><li>ステップ4.4で説明したように注射部位を特定します。注射部位を含む組織の1ミリメートルの部分をカット。必要に応じて病変のいずれかの側に追加の1mmのブロックは、同様に調製することができる。 </li><li>ドラフト内で、氷上で各ブロックに10倍量の1％四酸化オスミウム/ 1.5％フェロシアン化カリウムを加える60分間。 注：四酸化オスミウムは、毒性の高い物質であり、細心の注意を払って取り扱ってください。四酸化オスミウムと接触する全ての材料は、中和のためにコーン油（四酸化オスミウム溶液の倍容量）中に配置されるべきである。 </li><li>コー​​ン油に廃棄、室温で10分間、0.2Mカコジルでコードを3回洗浄する。段階的エタノール溶液（水中、50％、70％、90％、95％で2回、100％で2回、プロピレンオキシドと2回）、室温で10分間で脱水する。 </li><li>製造元の指示に従って樹脂に埋め込むコード。 </li><li>ウルトラ上のブロックをカットし、顕微鏡スライド上の水滴の上のセクションをマウントします。乾燥するまでホットプレート（約50℃）の上に置いてスライドする。 </li><li> 50℃で10〜15秒間、スライド上の1％トルイジンブルー/ 2％のホウ砂溶液を数滴添加することにより、ミエリンを可視化する。マウントメディアと水、ドライ、そしてカバースリップですすいでください。明視野顕微鏡での画像セクション。 </li></ol>

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+deficits+induced+by+experimental+spinal+cord+demyelination+are+abolished+by+spontaneous+remyelination.">Locomotor deficits induced by experimental spinal cord demyelination are abolished by spontaneous remyelination.</a> Brain. 120 (Pt 1), 27-37 (1997).</li><li>Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+remyelination+of+the+CNS+leads+to+functional+recovery.">Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (16), 6832-6836 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

多くの動物モデルは、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルは、最も認識可能、MSを研究するために開発されてきた。 EAEは、げっ歯類は、ミエリンペプチドの断片に対して免疫と麻痺を昇順で顕在炎症性病変の発達を受けている。半または極薄のために組織を処理する際に第一に、炎症​​性病変の位置が多少ランダムであり、病変を見つける：このモデルは免疫MS薬の前臨床試験のために有用であったが、それは3つの主な理由で再ミエリン化を研究するための理想的ではないのセクションでは、挑戦することができます。第二は、再ミエリン化は、特定の時間にわたって発生し、単一EAE病変の正確な年齢は継続的な非侵襲的磁気共鳴画像なしで知ることができないということである。第三は、再ミエリン化は、齧歯動物における天然に存在する現象であり、EAEにおける薬物処置後の再ミエリン化の証拠は、薬物の主要な結果であるが、でないことである炎症を低減する二次的な現象をステッド。 脱髄を製造する別の一般的な方法は、食事中の銅キレート剤のクプリゾンを導入することによって達成される。これは以下のような脳梁に、広範な脱髄をもたらす。まず、軸索の直径（したがって、ミエリン厚さ）他のCNS領域よりも小さくしているため、薄く髄鞘再形成シースは脱髄ことはありませんでしたものと区別がつかないことができます：次の理由から、再ミエリン化のサイトとして脳梁を研究する上での制限があります。マウスの脳梁が&gt; 70％の無髄軸索16が含まれているため第二に、それは再ミエリン化セグメントは17が正常に発生し、成人、中に損傷したミエリンまたはデノボミエリン合成の真の修理があるかどうかは不明であることができます。 それは、再ミエリン化を研究するための最良のモデルは、毒素の直接注入は、どちらリゾレシチン、ethidであることを私たちの信念である尾側脳花梗18または脊髄白質にイウム、または他のもの、。前者の位置は、正確な3次元定位注射によって達成され、そしてによる小脳果柄のサイズが小さいため、より大きなげっ歯類（ラット）に限定される。これは脱と再ミエリン化を研究するトランスジェニックマウスの豊富なリソースを除外します。脊髄は、しかし、簡単にアクセス外科的な多くの大きな白い質路が含まれています。吻側胸椎セグメントにおける椎骨の間のスペースは尾側胸部の外科的処置に必要なステップである椎弓切除術を必要とせずに、脊髄の露出が可能になります。特に腹側白質を標的とする利点は、軸索は再ミエリン化の定量化を行うこと、背側の白質より均一に大きいということで少ない曖昧なタスク類似した脳梁に関連する課題に。さらに、腹側白質がはるかに大きいTを構成する注入するARGETエリア。同じ偏差は腹側にまだ目立つ脱髄病変を生み出すだろうが横方向に背側領域に数百ミクロンのは、列外に毛細血管を置くだろう。いくつかのプロトコルは、同じ動物19の背側と腹側列の両方にリゾレシチン注入する。これにより、適切な毛管配置の可能性とより少ない動物において定量可能な病変の数の両方を増加させることができる。提示され、現在のデータは、動作時に8〜10週齢の動物からのものであるが、我々はまた、再ミエリン化が4著しく遅いと記載されている8~10月齢マウス、同じ手順を使用して成功を収めている。 再ミエリン化の定量化は、些細な仕事ではありません。セントラルドグマは、再ミエリン化セグメントは、それらの健全な対応物よりも平均して長さが短く、薄く、かつ断面半Oをこのようにして得比計算（軸索直径軸索+ミエリンの直径で割った）ことを断定Rの超薄切片は、標準的な手順となっている。しかし、再ミエリン化セグメントは、時間2にわたって増粘及び再ミエリンオリゴデンドロサイトのトランスジェニックレポーターを用いた最近の研究は、多くの節は、最終的に制御装置20と区別できないとなることを示唆していることが知られている。病変内の成熟したオリゴデンドロサイトの数を定量することはオリゴデンドロサイトは、節間の広い数を作ることができるように、修理を測定するための間接的な方法であり、再ミエリン-応じてモデルにかなりの割合のシュワン細胞3から発生する使用は、することができます。再ミエリン化が跳躍伝導21の復元にリンクされているようにもちろん、修理の究極の測定基準は、神経学的欠損の機能回復となる。再ミエリン化は、いくつかの種22,23における機能の回復に関連しているが、これはネズミリゾレシチン研究において標準的な手順になっていない。これは明白なobservの欠如に起因する可能性が高いそのようなEAEとさえクプリゾンなどのより強固な脱髄のモデルに比べて背側または腹側の病変のいずれかからでき赤字、。私たちは、再ミエリン化を注射し、その後の回復をリゾレシチンに起因する機能的な赤字は、唯一の細かい感覚機能するの敏感なテストを使用して観測可能であると考えています。 ぶっきらぼう方法論的アプローチとはいえ、上記の動物モデルのいずれかと一緒に「再ミエリン」のPubMedの検索は、EAE（188）とクプリゾン（197）に比べて（109）リゾレシチンためのより少ない検索ヒットを示しています。脱髄をリゾレシチン私たちの引数が再ミエリン化を研究するための優れたアプローチであれば、なぜそれが少なくとも議論されている？おそらく、この方法を使用するための不安は、手術を行う際の技術的困難の信念に由来する。実際には、この手順は、すべてのコマーある材料を必要とし、高速で費用対効果がなく、全くルーチン組織切開よりも困難でcially利用できる。それは、このプロトコルはミエリン修復の刺激的拡大分野を研究するための彼らのレパートリーにこの強力なモデルを追加したいもののために役立ちことを願っています。

多発性硬化症（MS）は、免疫細胞の浸潤及び失わミエリン、オリゴデンドロサイト、軸索およびニューロンを含むプラークを特徴とする中枢神経系（CNS）の慢性脱髄疾患である。ほとんどの患者は寛解期間に続く神経症状の広い範囲を伴う炎症の再発、からなる疾患の経過を持っている。これらの患者の半数以上が、最終的には明らかな再発はなく、継続的な神経学的な低下と二次進行段階に移行する。これは、この進行性の悪化が軸索損傷および喪失に起因すると考えられる、慢性の脱髄によって部分的に寄与した。失われたミエリンを復元するための戦略は、このように、疾患の進行を遅らせ、おそらく神経症状を逆転するための有望な治療アプローチと考えられている。 新しい髄鞘が募集さオリゴデンドロサイト前駆細胞から生成されたことにより、再ミエリンは、CNSにおける内因性修復応答であるミエリン形成オリゴデンドロサイトに分化する（OPCは）。再ミエリン化は、1-3かなり堅牢であるために、動物モデルにおいて示されているが、その効率は、年齢4に低下する。それはMS患者5の大部分で不完全であるが、実際のところ、再ミエリン化は、ヒトにおいて起こる。 MSのためのすべての現在利用​​可能な薬物は主に病気の異常な免疫成分を標的とし、再発の低減に有効であるが、著しく疾患の進行を遅らせることはありません。 MSの管理のための治療戦略次世代の再発および進行6の両方を防止するために、内因性再ミエリン化の増強を伴う免疫調節の進歩を統合する。 CNSで脱と再ミエリン化を研究する一つの方法は、脊髄の白質1,3,7に洗剤リゾホスファチジルコリン（リゾレシチン）の直接注射することを含む。この手順は、十分に特徴づけdemyelinatを生産けが主にマクロファージ/ミクログリアの浸潤および活性化8,9、反応性アストログリオーシス、軸索の恒常性/軸索損傷、およびOPCの増殖と遊走10の摂動からなるがる。病変は、予想通り、数週間の期間にわたって進化し、完全に再ミエリン化が最終的に可能である。この方法は、脱と再ミエリン化に関与するイベントの振り付けを研究する上で特に有用であった。また、脱髄傷害後の修復を促進する候補治療法の前臨床試験のためのツールと​​して採用されている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="815">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:199px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:239px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">spring scissors</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">15004-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">retractor</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">17003-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">clippers</td>
			<td style="width:199px;">Philips</td>
			<td style="width:163px;">QG3330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">heating recovery chamber</td>
			<td style="width:199px;">Peco Services</td>
			<td style="width:163px;">V1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">surgical tape</td>
			<td style="width:199px;">3M</td>
			<td>1527-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scalpel handle</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td>10003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">scalpel blade</td>
			<td style="width:199px;">Feather</td>
			<td>No. 15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sponge spear</td>
			<td style="width:199px;">Beaver Visitec</td>
			<td>581089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5-0 Vicryl sutures</td>
			<td style="width:199px;">Ethicon</td>
			<td>J511G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">curved ToughCut spring scissors</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15123-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">32 gauge metal needle</td>
			<td style="width:199px;">BD</td>
			<td style="width:163px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">needle holders</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">12002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">angled forceps</td>
			<td style="width:199px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cotton tipped applicator</td>
			<td style="width:199px;">Puritan</td>
			<td style="width:163px;">806-WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gauze pads</td>
			<td style="width:199px;">Safe Cross First Aid</td>
			<td style="width:163px;">3763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">10 &#956;L syringe</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:163px;">7635-01</td>
			<td style="width:239px;">make sure to purchase the microliter, not gastight syringe</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">compression fitting</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:163px;">55750-01</td>
			<td style="width:239px;">contains the 2 ferrules and removable nut, but the nut that comes with the 10 &#956;L syringe is a tighter fit</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">priming kit</td>
			<td style="width:199px;">Hamilton</td>
			<td style="width:163px;">PRMKIT</td>
			<td style="width:239px;">contains the priming syringe, removable hub needle and the rubber discs</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">pre-pulled glass capillaries</td>
			<td style="width:199px;">WPI</td>
			<td style="width:163px;">TIP10TW1 (pack of 10)</td>
			<td style="width:239px;">contains capillaries with 10 &#956;m inner diameter. 30 &#956;m inner diameter also work (TIP30TW1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">stereotactic frame</td>
			<td style="width:199px;">David Kopf instruments</td>
			<td style="width:163px;">Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FS-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Tissue-Tek optimal cutting temperature (OCT) compound</td>
			<td style="width:199px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;">25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Tissue-Tek intermediate cryomold</td>
			<td style="width:199px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;">25608-924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bright field microscope</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td>BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ultramicrotome</td>
			<td>Leica EM UC7</td>
			<td>EM UC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lysophosphatidylchoine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">L1381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-methylbutane</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">M32631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton x-100</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">goat serum</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:163px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-SMI312 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Covance</td>
			<td style="width:163px;">SMI-312R</td>
			<td>1:2000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-MBP antibody</td>
			<td style="width:199px;">Abcam</td>
			<td style="width:163px;">AB40390</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat anti-PDGFR&#945; antibody</td>
			<td style="width:199px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:163px;">AF1062</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-Olig2 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td style="width:163px;">AB9610</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Mouse anti-CC1 antibody</td>
			<td style="width:199px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:163px;">OP80</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:199px;">Life technologies</td>
			<td style="width:163px;">A-11008</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:199px;">Life technologies</td>
			<td style="width:163px;">A-11003</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG</td>
			<td style="width:199px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:163px;">705-546-147</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG</td>
			<td style="width:199px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:163px;">715-586-151</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td style="width:199px;">Jackson Immuno</td>
			<td style="width:163px;">711-606-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>BR0014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">isopropyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>109827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ketamine</td>
			<td>CDMV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">xylazine</td>
			<td>CDMV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iodine</td>
			<td>West Penetone</td>
			<td>2021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vaseline petroleum jelly</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA05971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eriochrome Cyanine R</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iron(III) chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>157740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ammonium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Acrytol</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3801700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Citrisolv</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-143-975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">horse serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glutaraldehyde</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>16220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">osmum tetroxide</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td>highly toxic</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyvinyl alcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cacodylic acid</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>12300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">propylene oxide</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>20401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMBED kit</td>
			<td>Electron Micrscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toluidine Blue O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Sodium tetraborate decahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Recipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eriochrome cyanine solution</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ingredient</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Amount to add</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Eriochrome Cyanine R</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">0.8 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">400 mL 0.5%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">iron(III)chloride</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">20 mL 10%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">water</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;">80 mL</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:216px;">*add eriochrome cyanine to sulfuric acid, followed by iron(III) chloride and water. Solution can be kept after use. Make fresh once per year.</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gelvatol</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ingredient</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Amount to add</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>140 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>20 g</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">glycerol</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>40 g</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:216px;">*mix well, place at&#160; 37 &#176;C overnight, centrifuge at 1960xg 30 min, aliquot into 40 tubes</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

experimental demyelination and remyelination of murine spinal cord by focal injection of lysolecithin

多発性硬化症は、失われたオリゴデンドロサイトミエリン、軸索およびニューロンを含むプラーク形成を特徴とする中枢神経系の炎症性脱髄疾患である。再ミエリン化は、新たなミエリンは、ミエリン形成乏突起膠細胞に増殖、動員、およびオリゴデンドロサイト前駆細胞の分化の後に産生される内因性修復機構であり、更なる損傷から軸索を保護する必要がある。現在、多発性硬化症の治療のためのすべての治療薬は、炎症の再発を減少させるが、不可逆的な神経学的な衰退への進行を妨げない疾患の異常な免疫成分を、ターゲットにしています。これは、疾患の進行を遅らせ、おそらく神経学的症状を逆転させる可能性が再ミエリン化を促進する戦略が開発されることが不可欠である。脱髄のいくつかの動物モデルは、実験的自己免疫性脳脊髄炎およびcurprizone含め、存在する。ただし、対応時間がある再ミエリン化を研究するためのそれらの使用でtations。より堅牢なアプローチは、げっ歯類の脊髄白質中に洗剤リゾレシチンなどの中枢神経系への毒素の局所注射、である。このプロトコルでは、マウスの腹側白質にリゾレシチン注入に関与する外科的処置は、高速で費用効果的であり、市販されているものよりも追加の材料を必要としないことを示している。この手順は、再ミエリン化プロセスに関与する正常な事象を研究するためだけでなく、候補再ミエリン化を促進する治療薬をスクリーニングするための前臨床ツールとしてだけでなく、重要である。

腹側白質へリゾレシチンの焦点注入は約3ミリメートル（ 図2）の距離にわたって検出可能である離散脱髄病変を生成します。病変ミエリンのためのコア（MBP）と軸索（SMI312）の免疫組織化学染色は7日間（ 図3）でミエリンを剥奪された軸索を示しています。 14日目までに、多くの軸索は、再ミエリン化の発生を示唆して、MBP陽性リングに囲まれている。オリゴデンドロサイト系譜（PDGFRα、OLIG2、CC1）の細胞の染色、7日、並びにするOPCと比較して、成熟稀突起神経膠細胞の分布と比較して14日後の総細胞数の両方の有意な増加があった（ 図4） 。この知見と一致して、トルイジンブルーで染色した半薄のセクションでは、これらは私が再ミエリン化されていることを示す、まれに7日間（ 図5）で検出されない14日目で、薄いミエリン鞘の存在を明らかにnternodes。 手順は、動物間で再現性が高い。重い呼吸が毛細血管-これは通常、十分な鎮静の問題ではないの静止位置を変更したときにばらつきが発生します。軸索の損傷は、モデル1の最古の使用以来、記載されている病変の中心部、を除いて、最小限であるように思われる。それはまた、PBSを注射コントロールで観察可能であるように私たちは、これはガラスキャピラリーから機械的損傷であると信じる。それにもかかわらず、ばらつきが小さくなる傾向があり、我々と同様の手順を使用して他のグループ15ごとに、わずか4の動物を用いた実験条件の違いを検出した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig1.jpg" /> 注入注射器の図1のアセンブリ。（A）注入シリンジのナットは、T上にねじ込まれている<html>彼らの交配は、インターロックを終了するような2フェルールが続くガラスキャピラリーの彼フラット終わり、。毛細管がしっかり円錐フェルールにぴったりされると、アセンブリがタイト注入注射器の端部に手がねじ込まれている。（B）プライミング注射器に取り付けた金属ハブ針をゴムディスクの中心を片とそれを滑り降りる塩基（C）プライミングシリンジに溶液をリゾレシチン撤回。（D）リゾレシチンの最初の一滴が針の先端に表示されるまで、ゆっくりプライミングシリンジを押す。（E）は、注入のバレル内にプライミング注射器を挿入ゴム製のディスクとしっかりシールを作る注射器、。それは毛細血管の最後に実行されるまでゆっくりとソリューションを押し下げる。注入シリンジに気泡を導入することなく、金属ハブ針を除去するために、プランジャーに圧力を維持しながら慎重にプライミング注射器を引き抜く。/ 52679 / 52679fig1large.jpg「ターゲット= &quot;_空白」をアップロードする&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig2.jpg" /> エリオクロムシアニンで染色病変リゾレシチン図2.代表。連続切片エリオクロムシアニンで染色し、14日に特徴リゾレシチン病変の（400μmの間隔を空け）はミエリン（青）を可視化する。その脱髄が腹側白質に制限され、病変が吻側/尾側方向に約3ミリメートルにまたがることに注意してください。スケールバー= 1ミリメートル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig3.jpg" /> 図3.軸索およびミエリンリゾレシチンモデル。 （A）偽（PBS）は、ミエリンリングによって囲まれている健康な軸索 ​​を示した。7日後の病変リゾレシチン（B）Aが裸出軸索ならびに劣化したミエリンを示す7日後に脊髄を注入した。（C）14日目であり、a軸索（白矢印で示す例）の割合は、ミエリンリングの再出現と関連している。スケールバー=10μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig4.jpg" /> 図リゾレシチンモデル4.オリゴデンドロサイト系譜細胞。 （A、C）7日目には、CC1の+オリゴデンドロサイト（マゼンタバー）に対するより大きなPDGFRα+ OPCの表現（白バー）の相対性がある。バー内の数字は割合を表す。 OLIG2はにプローブしたオリゴデンドロサイト系譜細胞の染色を確認する。（B、C）を 14日目に、そこに7日に（p &lt;0.05、両側t検定に比べてオリゴデンドロサイト系譜細胞の合計数の有意な増加は、群あたりn = 4 ）。 7日後に（p &lt;0.0001、フィッシャーの直接確率検定）と比較して14日目でのOPCの乏突起膠細胞の分布に有意な増加がある。 =10μmのスケールバー。各フィールドは、60Xの元の倍率で撮影している。値は、平均±SDである。 * P &lt;0.05を意味します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52679/52679fig5.jpg" /> リゾレシチンモデル図5.再ミエリン化。 （A）HEAに腹側白質の部分を半薄染色断面トルイジンブルーlthyマウス（B）7日目。各ミエリン厚の口径の広い範囲にわたって軸索を示し、ミエリン鞘の欠如は、（右下）を受けない領域に隣接して観察された。14日目（C）、薄く有髄シース（赤い矢印で示す例は）再ミエリン化のセグメントを示す、病変全体に表示されます。スケールバー=10μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52679/52679fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

リゾレシチンの焦点注入による実験的脱髄およびマウス脊髄の再ミエリン化

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

experimental-demyelination-remyelination-murine-spinal-cord-focal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.7K ビュー.  Hotchkiss Brain Institute at University of Calgary. Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

神経科学

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Visual Evoked Potential Recording in a Rat Model of Experimental Optic Nerve Demyelination

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to monitor the disease course in the follow-up period. Changes in the VEP parameters closely correlate with pathological damage in the optic nerve. This protocol provides a detailed description about the rodent model of optic nerve microinjection, in which a partial demyelination lesion is produced in the optic nerve. VEP recording techniques are also discussed. Using skull implanted electrodes, we are able to acquire reproducible intra-session and between-session VEP traces. VEPs can be recorded on individual animals over a period of time to assess the functional changes in the optic nerve longitudinally. The optic nerve demyelination model, in conjunction with the VEP recording protocol, provides a tool to investigate the disease processes associated with demyelination and remyelination, and can potentially be employed to evaluate the effects of new remyelinating drugs or neuroprotective therapies.

Focal demyelination is induced in the optic nerve using lysolecithin microinjection. Visual evoked potentials are recorded via skull electrodes implanted over the visual cortex to examine the signal conduction along the visual pathway in vivo. This protocol details the surgical procedures underlying electrode implantation and optic nerve microinjection.

実験視神経の脱髄のラットモデルにおける視覚誘発電位の記録

The visual evoked potential (VEP) recording is widely used in clinical practice to assess the severity of optic neuritis in its acute phase, and to ...

Experimental Strategies to Bridge Large Tissue Gaps in the Injured Spinal Cord after Acute and Chronic Lesion

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the spinal cord, tumor resections, or tissue defects resulting from traumatic accidents can aid in facilitating general tissue repair as well as regenerative growth of nerve fibers into and beyond the affected area. Two experimental treatment strategies are presented: (1) implantation of a novel microconnector device into an acutely and completely transected thoracic rat spinal cord to readapt severed spinal cord tissue stumps, and (2) polyethylene glycol filling of the SCI site in chronically lesioned rats after scar resection. The chronic spinal cord lesion in this model is a complete spinal cord transection which was inflicted 5 weeks before treatment. Both methods have recently achieved very promising outcomes and promoted axonal regrowth, beneficial cellular invasion and functional improvements in rodent models of spinal cord injury.
The mechanical microconnector system (mMS) is a multi-channel system composed of polymethylmethacrylate (PMMA) with an outlet tubing system to apply negative pressure to the mMS lumen thus pulling the spinal cord stumps into the honeycomb-structured holes. After its implantation into the 1 mm tissue gap the tissue is sucked into the device. Furthermore, the inner walls of the mMS are microstructured for better tissue adhesion.
In the case of the chronic spinal cord injury approach, spinal cord tissue - including the scar-filled lesion area - is resected over an area of 4 mm in length. After the microsurgical scar resection the resulting cavity is filled with polyethylene glycol (PEG 600) which was found to provide an excellent substratum for cellular invasion, revascularization, axonal regeneration and even compact remyelination in vivo.

Severe spinal cord injuries often result in tissue defects. Two possibilities are described to successfully bridge such gaps to promote tissue adaptation, regenerative responses and functional improvement in rats via implantation of a mechanical microconnector system after acute injury and five weeks after complete spinal cord transection.

急性および慢性病変後に損傷した脊髄に大きな組織ギャップを埋めるための実験的戦略

After a spinal cord injury (SCI) a scar forms in the lesion core which hinders axonal regeneration. Bridging the site of injury after an insult to the ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

炎症性サイトカインの脳内注射による広範囲にわたる大脳皮質脱髄のラットモデル

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

シアログリカンの代謝標識による原発神経幹および前駆細胞の細胞表面マーカーの同定

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Direct Injection of a Lentiviral Vector Highlights Multiple Motor Pathways in the Rat Spinal Cord

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. Injection directly into spinal cord tissue bypasses these barriers, providing access to cell bodies or synapses where molecules can be incorporated. Combining viral vector technology with this method allows for introduction of target genes into nervous tissue for the purpose of gene therapy or tract tracing. Here a virus engineered for highly efficient retrograde transport (HiRet) is introduced at the synapses of propriospinal interneurons (PNs) to encourage specific transport to neurons in the spinal cord and brainstem nuclei. Targeting PNs takes advantage of the numerous connections they receive from motor pathways such as the rubrospinal and reticulospinal tracts, as well as their interconnection with each other throughout spinal cord segments. Representative tracing using the HiRet vector with constitutively active green fluorescent protein (GFP) shows high fidelity details of cell bodies, axons and dendritic arbors in thoracic PNs and in reticulospinal neurons in the pontine reticular formation. HiRet incorporates well into brainstem pathways and PNs but shows age dependent integration into corticospinal tract neurons. In summary, spinal cord injection using viral vectors is a suitable method for introduction of proteins of interest into neurons of targeted tracts.

This protocol demonstrates injection of a retrogradely transportable viral vector into rat spinal cord tissue. The vector is taken up at the synapse and transported to the cell body of target neurons. This model is suitable for retrograde tracing of important spinal pathways or targeting cells for gene therapy applications.

レンチ ウイルスのベクトルの直噴ハイライト ラット脊髄における複数の運動経路

Introducing proteins of interest into cells in the nervous system is challenging due to innate biological barriers that limit access to most molecules. ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

ウイルスベクターの脳内注射によるインビボグリア細胞のインターニューロンへの直接リプログラミング

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...