この方法は、マウスの両側皮質領域全体の神経活動を、生体内で長期間にわたって記録および定量化することが可能である。この2つの光子技術は、長期間にわたって大きなニューロン集団または分散したニューロン集団において同時に活性を検出するという利点を有する。この技術の意味は、生きている脳の異なる領域で定義された神経集団の活動パターンの調査に及んだ。
処置を開始する12時間前に、70%エタノールで50°Cで光学窓を温めます。光学窓は、直径5ミリメートルの丸い上部カバーガラスと、直径3ミリメートルの丸いカバーガラスを含む底部から構成されています。温暖化インキュベーションの終わりに、麻酔をかけた20〜25グラム1 1/2〜2 1/2ヶ月齢のThy1 GCaMP6sマウスのつまみつまみに対する応答の欠如を確認し、動物の目に軟膏を塗布する。
無菌ドレープで覆われた加熱パッドの上にマウスを置き、マウス用のヘッドホールディングアダプタを使用してヘッドを安定させる。頭皮の大部分を二重端カミソリで剃り、シーケンシャルな無菌アルコール調製パッドとポビドネヨウ素溶液スクラブで露出した皮膚をきれいにします。その後、はさみのペアを使用して、頭蓋骨の右側の頭皮に3ミリメートルカット長方形の2を作ります。
綿棒を使用して、皮膚を脇に押し出して直径3ミリメートルを超える露出領域を作成し、鈍い微小外科ブレードを使用して頭蓋骨に取り付けられた結合組織を穏やかに取り除きます。歯科ドリルでは、S1エリアの周りに直径3ミリメートルの円を静かにマークします。頭蓋骨の左側に同様の円を作った後、シアノクリレートスーパーグルーの薄い層を骨の両側に塗布し、歯科用セメント塗布のベースを提供します。
解剖顕微鏡の下で、高速マイクロドリルを使用して、S1領域の周りの頭蓋骨の右側にある円形の溝を薄くして滑らかなエッジを作成し、必要に応じて真空で骨の破片を吸引します。約2/3の骨深さが達成された後、円形の骨のフラップが周囲の頭蓋骨から完全に解放されるまで、骨の残りの1/3をゆっくりと慎重に薄くする。5/45鉗子のペアを使用して、円形の骨片をゆっくりと慎重に取り除き、硬膜を露出させ、パイル容器を損傷しないように注意してください。
同じように頭蓋骨の左側から骨フラップを取り除いた後、頭蓋骨の右側の光学窓を滅菌生理食い物ですすみ、ステレオ顕微鏡で不完全性がないか確認します。脳脊髄液の存在下で、頭蓋骨の上部分と頭蓋骨開口内の底部に置いた開頭蓋骨と底部に光窓を設置します。シアノアクリル酸スーパーグルーを使用して、光学窓の端の上部を頭蓋骨に密封します。
接着剤が乾燥したら、ガラスの端に黒い歯科用セメントを塗布し、露出した頭蓋骨の右側の残りの部分、および傷のマージンを光を遮断します。その後、左光学窓をインストールし、動物が完全な債務まで監視して回復できるようにします。処置の7~10日後、麻酔動物を2光子顕微鏡下の加熱パッドのヘッドホールディングアダプタに入れ、顕微鏡の光学窓と右側の頭蓋骨の右側が顕微鏡の光軸に垂直に向くように注意する。
4倍の倍率で明視野照明を使用して、頭蓋窓の初期参照マップ画像を取得します。同じ対象領域の複数の画像を取得した後、左半球のS1領域内のカルシウムダイナミクスを画像化し、頭蓋骨の両側の関心領域ごとの蛍光の変化を計算します。これらの代表的な画像では、EGFP発現マウス内の樹状突起および血管を、光学窓の設置の翌日にS1領域の層2の異なる深さで可視化した。
Z投影画像は、光学窓移植後1日目と7日目に撮影され、実験期間中の樹状枝および脊椎の数と位置が著しく安定していることを示した。Thy1 GCaMP6sトランスジェニックマウスにおける細胞内カルシウム過渡性の測定により、ピアの下500マイクロメートル以上の深部に位置する5つの錐体ニューロンの自発的なカルシウム活性と集団の定量化と、時間の経過にとらえた自然応答の平均数の計算が可能になります。頭蓋窓調製と生体内2光子カルシウムイメージング技術の両方で訓練を受けた研究者は、頭蓋骨の両側の100〜200ニューロンの記録を1日あたり1〜2匹の動物で得ることができるべきである。
この方法は、頭蓋骨の両側に開いた光学窓を使用して、対称哺乳類の脳領域全体の神経活動を記録し、生体内での長期かつ安定したカルシウムイメージングを可能にする。この方法はまた、末梢または中枢神経系への一方的な傷害後の皮質活性および可塑性を研究するために使用することができる。このビデオを見た後、Thy1 GCaMP6sトランスジェニックマウスで2光子顕微鏡を使用してカルシウムダイナミクスを測定するための両側頭蓋窓を設置する方法をよく理解する必要があります。
