神経幹と前駆細胞は、自己更新し、異なる神経細胞タイプに分化し、神経系の発達をサポートし、再生医療のためのリソースを提供することができます。これらの細胞は異種であり、精製された細胞集団を得てその機能を理解するためには、その細胞表面マーカーを知る必要があります。当社のプロトコルは、一次神経幹および前駆細胞の膜タンパク質を分析するためのシンプルで敏感で効率的な技術を提供し、これらの細胞の新しい表面マーカーを同定するのに役立ちます。
私たちのプロトコルの主な利点は、一次神経幹および前駆細胞の表面プロテオームを、感度と特異性を向上させたものに直接分析できることです。これは、内皮細胞内の共培養を通じてそれらを拡大することによって達成され、高トラクタインインチズン内の細胞内のセルリンの表面ポリンを標識するMAPK-ERK経路。インビトロで幹細胞を拡張する際の毛穴の改良により、当社のプロトコルを簡単に適用して、他の幹細胞タイプの表面マーカーを同定することができます。
内皮細胞を調製するために、10センチメートルのペトリ皿から9ミリリットルのBEN3細胞培地で90%の合流でBEN3細胞ペレットを再懸濁する。1つの透過性サポートインサートにセル懸濁液を1ミリリットル加えます。マトリックスの底の部屋で井戸ごとにBEN3培地の別の2ミリリットルを追加します。
5%の二酸化炭素で摂氏37度で1日培養を続けます。インサート内の細胞をめっきした翌日、培地を軽く吸引し、まず下のチャンバーから、次にインサートから吸引する。あらかじめ温めたDMEMで、インサートの顔を3回洗います。
あらかじめ温めたDMEMですすいで、インサートの外面を洗います。次に、1つのインサートに、温め込んだAMの1ミリリットルを加えます。一次皮質細胞とウェルに挿入物を転送します。
5%の二酸化炭素で37°Cで共培養を12時間インキュベートします。200 ミリモルのストック濃度を達成するために DMSO で Ac4ManAz を溶解します。.インキュベーターから神経内皮共培養プレートを取り出す。
Ac4ManAzストックの1マイクロリットルを各底のチャンバに1マイクロリットル、挿入ごとに0.5マイクロリットルを共同培養に加えます。5%の二酸化炭素で37°Cで細胞を5日間培養します。細胞が培養している間、挿入ごとに100マイクロリットルのRMと1番下のチャンバーあたり200マイクロリットルのRMを加えて、1日おきに内皮細胞と神経細胞を再供給します。
まず、共同培養プレートからインサートを取り出し、培養液をウェルの底から吸引する。次に、あらかじめ温めたPBSで神経細胞を一度洗います。井戸からPBSを吸引し、PBSで冷やした4%パラホルムアルデヒドを1ミリリットルずつ各ウェルに加えます。
室温で10分間細胞を固定します。その後、予冷したPBSで細胞を3回洗浄します。PBSを吸引し、調製したてのビオチン共役バッファー1を各ウェルに1ミリリットル添加する。
室温で10分間インキュベートします。この後、ウェルから反応バッファーを吸引し、PBSで細胞を3回洗浄する。細胞の各ウェルに1ミリリットルの染色バッファーを加え、室温で30分間インキュベートします。
次に、ウェルから染色バッファーを吸引し、予め冷やしたPBSで細胞を3回洗浄する。細胞の各ウェルにブロッキングバッファーの1ミリリットルを追加し、室温で10分間インキュベート.ウェルからブロッキングバッファーを取り出し、各ウェルに1ミリリットルの一次抗体溶液を加えます。
摂氏4度で一晩細胞をインキュベートします。翌日、一次抗体溶液をウェルから取り出す。細胞を冷やしてPBSを3回洗います。
井戸からPBSを吸引し、各ウェルに二次抗体を1ミリリットル加えます。室温で細胞を2時間インキュベートする。この後、ウェルから溶液を吸引し、予め冷やしたPBSで細胞を3回洗浄する。
まず、BTTAAクプリコンブリック硫酸錯体2、フルタンパク質再懸濁バッファー、タンパク質洗浄バッファー1、タンパク質洗浄バッファー2およびタンパク質洗浄バッファー3をテキストプロトコルに概説して調製する。次に、共同培養プレートからインサートを取り除きます。培養液を底ウェルから吸引し、前冷やしたPBSで神経細胞を一度洗浄する。
PBSを吸引し、各ウェルに200マイクロリットルのプリチルドRIPAバッファーを追加します。氷の上のプレートを5分間インキュベートし、タンパク質のライシスを1.5ミリリットルのチューブに集めます。遠心分離機はGの12000倍、摂氏4度で10分間、細胞デブリをペレットする。
新しい1.5ミリリットルチューブに上澄み物を移し、メーカーの指示に従ってBCAキットでタンパク質濃度を決定します。その後、タンパク質濃度を1ミリリットル当たり1ミリグラムに調整する。100ミクロモルアルキドビオチン、2.5ミリモルナトリウムアスコルビン酸ナトリウム、1XBTTAAクプリ酸硫酸錯体2を1ミリリットルのタンパク質リシスに加えます。
溶液をよく混ぜ、室温で1時間インキュベートします。この後、反応液を50ミリリットルの円錐チューブで20ミリリットルのプレチルドメタノールに移します。よく混ぜて、マイナス30度で一晩インキュベートしてタンパク質を沈殿させます。
遠心分離機はGの4500倍、摂氏4度で15分間沈殿する。1回の洗浄で20ミリリットルの前冷やしたメタノールを使用してペレットを2回洗浄します。次に、上清を吸引し、再懸濁液バッファーの4ミリリットルにタンパク質ペレットを再懸濁させる。
新しい15ミリリットルの円錐管に再懸濁タンパク質を移します。50マイクロリットルのストレプトアビジンビーズをPBSで3回洗浄します。洗浄したビーズをタンパク質再懸濁液に加え、回転速度20rpmで垂直回転翼で摂氏4度で3時間インキュベートします。
この後、ここに示す各洗浄バッファーでビーズを順次洗う。洗浄したビーズを20マイクロリットルのPBSで再び中断し、新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。2倍のタンパク質ローディングバッファーを20マイクロリットル加え、摂氏95度で10分間治療します。
その後、SDS-PAGEでタンパク質サンプルを処理し、テキストプロトコルで概説されているようにクマシーブリリアントブルーでそれらを染色します。本研究では、一次胚性NSPCが拡大され、インビトロで代謝的に標識される。成功した内皮共培養は、NCCsを大きなシート状クローンを形成する。
抗体による免疫染色は、クローンにおいて、ほとんどの細胞がNestin陽性のNCCsであり、βチューブリン3陽性神経細胞であるのはごくわずかであることを明らかにしている。対照的に、非共培養系で形成されたクローンにおけるNestin陽性細胞およびβチューブリン3陽性ニューロン細胞の割合はほぼ同じである。化学レポーターAc4ManAzは代謝アナログであり、本質的なタンパク質のシアリル化経路に組み込むことができます。
一次NCに対して100マイクロモルの最適化された標識濃度が使用され、細胞および核形態によって示される細胞死の組み合わせ評価は、この標識濃度が明らかな細胞傷害効果を引き起こさないことを示唆し、NSPCsを効率的に標識することができる。クローン形態は、内皮共培養系および非共培養系の両方におけるNCCの自己複製および分化の可能性に影響を及ぼさない。ビオチン結合およびストレプトアビジンビーズ精製によってAc4ManAz標識培養から調製されたタンパク質サンプルは、SDS-PAGEゲルにおける強力なクマシーブリリアントブルー染色シグナルを示す。
一方、DMSO対照群からのタンパク質サンプルを搭載したレーンには、染色背景および非特異的結合信号しかなかった。これはまた、Ac4ManAzによるNCCsの効率的なラベリングを示しています。このプロトコルを試みるとき、バイオセルラー反応に必要なすべての溶液を新たに調製し、反応時間を厳しく制御して不十分な反応を防ぐべきである。
我々のプロトコルに従って神経幹細胞の富化表面グリカンの構造を分析することができる。神経幹および前駆細胞の富化された表面タンパク質のプロトコルは上昇マーカーだけでなく、上昇パターン精製戦略およびこの細胞集団の剛性シグナル回路の図に重要な機能を果たす。
