The authors would like to thank: David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside, and Albert Cao for their help in developing and preparing the protein conjugates as well as the DNA aptamer; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar, and Trevor Olsen for their assistance in the sample preparation, Jonathan Mane for his assistance in generating images of the molecular structures; and the funding sources including the National Research Council of Canada &#8211; National Institute for Nanotechnology (NRC-NINT), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), and the University of Alberta for supporting the work.

1。基板の準備<ol><li> 1センチメートル×1cmに以下サイコロを溶融シリカ（FS）ウエハーを切断するために、半導体ダイシングソーを使用してください。 </li><li>ピラニア溶液で清浄な試料（H 2 SO 4：H 2 O 2、3：1;注意：強力な酸化剤）で15分間バス28は 、脱イオン水でサイコロをすすぎ、窒素で乾燥した。 </li><li>ホットプレート上のサンプルは15分間180℃で表向きに置きます。 RTにホットプレートから取り外した後のサンプルを冷却する。 </li><li>デザイン1と3の場合は、手順2に進みます。 </li><li>設計2は、Niを10nmの層を電子ビーム蒸着チャンバコートサンプルを置く。 </li></ol>電子ビームリソグラフィを用いてナノパターン化されたPMMAマスクの2の作製（EBL） <ol><li>スピンコートPMMAレジストと基板上の導電層。 <ol><li>チャック上の中央に個別に真空チャックと場所サンプルを用いたウエハスピナーを使用してください。場所ポリメチルメタクリレート（PMMA）の1滴は、2秒のランプ時間60秒間3,500rpmでガラスピペットおよびスピンを用いた試料の中心上のレジスト。 </li><li> 3-5分間、180℃で基板を焼く。基板を焼成した後、RTにサンプルを冷却する。 </li><li>基板を冷却し、スピナーチャックに戻って、基板上の導電性ポリマーの滴を広げた。 2秒のランプ時間と3000 rpmで40秒間基板をスピン。 1分間、80℃でベークサンプル。 </li></ol></li><li>標準的な手順の16,17,18,29に従ってEBL露光を行う。 <ol><li>製造業者の取扱説明書を使用して、最小の可能なビームのステップサイズで、表1から特徴用量を用いた露光デザインを準備。 </li><li>電子ビームリソグラフィーチャンバ内にサンプルをロードする。 EBLシステムがオートフォーカスを持っていない場合は、フォーカスのためのビーズの縁から離れたパターンが露出される場所から離れ小キズを使用ING。 </li><li>製造業者の取扱説明書を使用し、必要に応じて必要なフォーカス及び非点収差補正、並びに、ライトフィールドの位置合わせを行い、サンプルを露出する。適正露出プロファイルと最高のパターンの品質を可能にするために、露光のために30 keVの電子ビームエネルギーと7.5μmの開口部を使用しています。 </li></ol></li><li>導電性ポリマーを除去し、露光した試料を開発しています。 <ol><li>現像剤混合物と、導電性ポリマーと第二のビーカーを除去するための脱イオン（DI）水を用いてビーカーを準備し（IPA：H 2 O、7：3）を、室温で5分間撹拌した。リンス剤として第3のビーカーにイソプロパノール（高純度）を準備します。 </li><li>ピンセットを使用し、その後、導電性高分子膜を除去する現像液に試料を置き、ゆっくり上下に20秒間ピンセットを移動させるために3秒間水にサンプルを置く。直ちにイソプロパノールに基板を搬送し、さらに10秒間すすぎ、次いで、窒素でサンプルを乾燥させる。 </li> &lt;/ OL&gt; </li></ol> 3.貴金属ナノ構造体の作製<ol><li>試料の表面上に堆積される金属蒸着を可能にするために、逆さまに、電子ビーム蒸着システムにサンプルをロードする。約0.1nm /秒の速度で設計1および図3に示すように、デザイン2は、厚さ10nmのAg層のための試料の上に厚さ10nmのAu層を堆積させる。 </li><li>水で推奨される高さに超音波処理システムを記入し、アセトンで別のビーカーを埋める。ビーカーの底にサンプル顔を置き、試料を10分間浸漬することを可能にする。ビーカーを保持し、水浴に置き、アセトンの高さは、水の高さに一致し、超音波処理システムをオンにすることを可能にする。超音波処理は、最大60秒間に発生することを許可する。 </li><li>工程3.1で詳述したのと同じ手順を用いて、FS上に膜厚10nmの金属膜を堆積することによって均一にAuとAgパッド基板を準備する（デザイン1及び3）及びNiコーティングされたFS（デザイン2）のsubstrステップ2をスキップしてのATE。 </li></ol>基板の4。バイオ機能化<ol><li>デザイン1のサンプルを準備します。 <ol><li> RTでエタノール中11 - メルカプトデカン酸（MUA）の1 mM溶液を準備します。 10分間の超音波処理。 </li><li> 48時間MUAの溶液に適切なナノ構造の基板を浸す。エタノールで3回サンプルをすすぎ、室温で5分間乾燥した。 </li><li> DI水中の（3-（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド（EDC） - N -エチル- Nの75 mM溶液」を調製する。 DI水中のNヒドロキシスクシンイミド（NHS）の15 mM溶液を準備します。 </li><li>基板上のAu上NHSのマイクロピペット預金100μLを使用して、すぐに同じ領域にEDCの100μlを添加する。 MUAの自己組織化単分子膜（SAM）を活性化するために1分間インキュベートする。 </li><li>基板の同じ領域上のタンパク質を100μlのドロップ溶液（47μM）を配置し、多区画ペトリ（d）に5℃で24時間のサンプルを保存する別の区画で、密閉カバーをDI水1 mlのっぽい。 </li><li>連続して各ビーカーに20秒間別個のビーカー内のサンプルを攪拌することにより脱イオン水で3回サンプルをすすぐ。サンプルは、すすぎ後、またはすすぎの際に乾燥させないでください。 </li><li>ステップ5に進みます。 </li></ol></li><li>デザイン2サンプルを準備します。 <ol><li>リン酸カリウム緩衝液中のグルコース結合タンパク質（GBP）の0.9 mM溶液（K 2 HPO 4、25mMの、pH7.5）に調製する。バッファ内のD-グルコースの100 mM溶液を準備します。 </li><li> 100mMのD-グルコース溶液および1ミリリットルプラスチック製マイクロチューブ容器及びマイクロピペットを用いて0.9 mMのGBP液30μlを30μlのを混ぜる。 30分間インキュベートする。 </li><li>デポジットマイクロピペットを用いて調製された基材上のリガンドフリーGBP溶液とリガンド結合GBP溶液20μlそれぞれ。密封されたカバー付きペトリ皿中で24時間、5℃でサンプルを保管してください。 </li><li>内のサンプルを3回すすぎRTでのリン酸カリウム緩衝液。 </li><li>ステップ5に進みます。 </li></ol></li><li>デザイン3つのサンプルを準備します。 <ol><li> 7.4の最終pHとTRIS EDTA緩衝液を用いて、1μMの濃度にドーパミンアプタマーを結合（DBA）溶液を希釈。 </li><li>化学天秤でドーパミン粉末を測定し、5分間攪拌ビーズをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で混合することにより、5μM濃度のドーパミン溶液を調製する。 </li><li>各基板の表面上に、DBA溶液20μl降下を堆積し、サンプルがペトリ皿の上カバーを室温で1時間放置します。 </li><li>リン酸カリウム緩衝液（K 2 HPO 4、25mMの、pH7.5）中で試料を3回すすぐ。 </li><li>直立クリーンルーム等級の上にサンプルを配置し、基板の表面側に膜を維持しつつ、裏面を乾燥させるために拭く。コントロールとして脇にサンプルを設定します。 </li><li>ドーパミン溶液oの5μlのドロップを置きますnは、所望のドーパミン濃度が残りの試料にPBS緩衝溶液の既存の液滴の表面。 10分間サンプルをインキュベートする。 </li><li>アプタマーなしでのAuパッド表面上のドーパミン溶液の液滴を配置します。 10分間インキュベートする。 </li><li>リン酸カリウム緩衝液中で3回の試料をすすぐ。 </li></ol></li></ol> 5.ラマン分光<ol><li>レーザー露光により蒸発を避けるために、防水チャンバ内の各サンプルを置きます。 <ol><li>ガラススライド上の化学的に不活性な高真空グリース、場所サンプルとプラスチックシリンジに充填し、試料に触れることなく、サンプルを周囲グリースの数ミリメートルを分配する。 </li><li>基板の上に、顕微鏡カバースリップを置き、静かにバッファが真空グリースに接触することなく基板とカバーガラスの間に薄い液体界面を作成する、シールを形成するように押し下げる。 </li></ol></li><li>使い方光学ラマン顕微鏡システムは、レーザーをオンにすることなくサンプリングされる金属ナノパターン化された領域の表面上に焦点を得る。 </li><li>倍率10倍を目的とした試料の損傷を防ぐために、20未満の秒の合計時間で2.4から3.1 mWの間のレーザ強度でラマンサンプリング18,19を実行します。 表1に示すように、励起波長を用いて設計1,2、および3からのサンプルについてのラマンスペクトルを取得また、プロテインA、GBP、D-グルコース、およびドーパミン粉末用の金属ずにガラススライドを用いたソリューションの制御ラマンスペクトルを取得するとしてのナノ構造は、比較のためにサポートしています。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

SERSは、多くのユニークな利点を提供バイオ検出の非常に強力な手法として認知を得ている。極めて高感度の分析物9,10,11,35の非常に少量を検出することが可能となり、一方、分子振動との関係は、選択的にSERSスペクトルから特定 ​​の検体の「フィンガープリント」を同定することが可能である。さらに、SERSは、水に比較的鈍感で非破壊的技術であり、それによって、それらの天然の水性環境9に生物学的物質を探索するために非常に適している。提示された結果は、これらの利点を強調ならびにさら​​なるバイオ検出の非常に柔軟なラベルフリー技術としてSERSの強力な可能性を示す。異なる基板固定生体分子の単層を用いた3の設計では、ラマンモードは、自信を持って、特定の分析物に起因する可能性があることが検出されている。 O、これらの生体分子の検出ことRそれぞれのリガンドは、SERS基板の支持体として溶融シリカの平坦な表面を採用することが実証されている、電子の表面に生物学的材料をインタフェース新興バイオ電子アーキテクチャとの関係で多数のアプリケーションを約束し、現在のエレクトロニクス、マイクロフルイディクスの設定を使用したデザインの互換性が高まりますそして電気化学デバイス2,3。重要なことには、2〜3の設計においてSERS検出を認識要素として、それぞれ、表面固定タンパク質およびアプタマーの単層を用いた、グルコースおよびドーパミンなどの小分子の特異的結合のために実証されている。 しかし、いくつかの側面は、「オンチップ」設定における効率的なSERSバイオ検出を達成するために、世話をする必要がある。まず、ほとんどの生体分子に共通でよく知られている課題は、ドライENVIのような非自然条件にさらされる場合は特に、分解するそれらの傾向である境や強烈なレーザー光。プロトコルを通じて、我々は常にラマンスペクトルの取得試料の調製から、全体の実験中に適切なソリューションに浸漬し、生体機能を有するサンプルを維持することの重要性を強調してきた。後者については、カスタム防水チャンバは、レーザー露光中の液体の蒸発を避けるために（ 図7）が設計されている。プロトコールのステップ5.3に記載のように露光及びレーザ強度​​の持続時間はまた、サンプルの損傷を避けるために制限されるべきである。 SERS検出の結果は、使用基板、及び金属ナノ構造、特に、フィーチャー間の分離の形状に敏感で見出される。それは図8および図9から次のように、設計1の試料のSERS強度は、溶融シリカ上のAuナノドット間の隙間の幅に強く依存する。私はテストされたAuナノドットの3つの配列のうち、nは、この設計（ 図8）は 、最も高いラマン強度は金フィーチャ間の狭い隙間を有し、したがって、より効率的な電磁場増強を提供する配列Iによって達成される。 図9に示すように、10〜20ナノメートル以下のレベルで、フィーチャー間の分離の制御が必要である。 SERS基板を製造するためのEBLを採用し、ここで示されたように、フィーチャー間のギャップの幅を制御するために特別に効率的な解像度を提供しています。ポジ型EBLとPMMAなどのレジストPMMAマスクの孔のサイズは、単に、露光量を変化させることによって変えることができる。リフトオフ後に、これは金属加工ドットの異なるサイズになり、適切なEBL露出18用量を選択することによって所望のようにドット間の隙間の幅を調整することができる。 他の課題は、特定の生物の検出アプリケーションのためのSERS基板の幾何学的形状の最適化である。増強効果のIもののフィーチャー間のギャップの減少にncreasesは、生体分子の比較的大きなサイズは、ギャップがいかに狭い上の制限を課す。これは、固定化方法は、タンパク質を効率的に（ 図3B参照 ）は、貴金属点の間の表面にではなく、ドット自体に結合するようなものである場合に、デザイン2の結果から明らかである。それは、図10から次のように、構造化されていない銀パッド用のSERSスペクトルは、分析物からのバンドを示していない。パッドは非常に薄いアイランド間のギャップと、ナノ結晶構造を示すが、これらのギャップは、タンパク質分子を収容するのには狭すぎる（ 図6F参照 ）。まだ複雑さの別の次元は、タンパク質 - リガンド結合を検出する必要があるときに添加される。 図10に、SERS CH帯域が仮にGBPのコンホメーションの変化によって説明することができるリガンドを含まないか1つに比べてリガンド結合GBPからのスペクトルにおいてより顕著である増加したラマン活性を有する、より剛性構造が得られる、D-グルコース2 7,27の結合に依存する。一つは2ナノ構造の基板を比較した場合、リガンド結合タンパク質からのタンパク質およびグルコースCHバンドの両方がナノ六角形でより顕著であるのに対し、リガンドを含まないタンパク質からのCHバンドは、ナノドットの基質を用いて得られたSERSスペクトルにおいて強いこと基板。二つの要因がこれらの違いをもたらすことが期待されて、Agの間のスペースの可用性は、GBPは、Niと結合することができる場合があります、そして「ホットスポット」のラマン散乱電磁増強へのリガンド結合およびリガンド遊離タンパク質の感受性これらの機能の間。一方では、ナノドットパターンは、Niコーティングは、Agナノドット基板上のグルコースを含まGBPについて観測より顕著CHバンドを説明する可能性がある、と結合するタンパク質のために利用可能である比較的大きな特徴間のエリアを提供しています。一方、それらの不均一なSTRUCによるトゥーレ（ 図6Dを参照）、銀ナノ六角形は、ナノ六角形基板上のグルコース結合GBPから強いCH振動帯で生じたナノ六角形の中のAgの島の間の狭い隙間に強い電磁強化を表示するために生じる可能性があります。この相互作用のいくつかの項目は、さらなる検証が必要であり、そのようなポンドなどの大きなタンパク質が関与する複雑な分析物のためのSERS基板の最適化は、パイプラインのままです。 他の構成要素ではないのに対し、唯一のリガンドは、選択された領域内のラマン活性がある場合、明らかに、認識要素として固定化された生体分子を用いたリガンド結合のSERS検出が容易になる。これは、アプタマーに結合したドーパミンの顕著なSERSバンドが得られ、設計3（ 図11）の場合である。アプタマードーパミンペアは、優れた特異性を示すとSERSスペクトルは、有意なバックグラウンドシグナルなしで顕著なバンドを含む。 <p class="jove_content"&gt;ラベル·手数料SERS技術の将来の進歩は、異なる表面ナノ構造の設計の広い範囲を持つ生体分子」のSERS信号増強の広範なテストを伴うだろう。サイズ、形状、およびここに提示試料調製プロトコルと組み合わせフィーチャー間の分離、制御の素晴らしいレベルの様々なナノ構造を製造する直接描画電子ビームリソグラフィの使用は、比較した結果の相互検証を容易にする異なる研究グループによる。 SERS基板は、メソッド11,12,13「ボトムアップ」の代替を採用して作製されたとき、これは広範な種類のに最適な基板設計の信頼性の高い識別に向かって金属ナノ構造のサイズと位置のよりよい制御を可能にする、再現性の主要な課題に対処するアプリケーション。これらの技術の拡張性は、続いて、ナノ相補ナノリソグラフィー法とEBLとを組み合わせることによって改善することができる調整可能なEBL技術を採用する最適化されたナノスケールのデザインの将来の量産に向けたインプリントリソグラフィ19。

固体ナノ構造と生体高分子をインタフェース共役ナノ生物学的システムを開発し、特性化する能力は、次世代のバイオセンシング、バイオ作動技術の1,2のさらなる進歩にますます重要になってきている。これは、適切な固体素子（マイクロまたはナノ電極、ナノエンジニアリングコーティング、ナノワイヤー、またはナノ粒子）2,3,4の製作などの研究分野、数にわたる学際的研究を伴う。希望するバイオコンジュゲート5,6,7を作成するには、表面上の生体分子の固定化。ナノ生物学のインターフェイス1を監視する。ほとんどの場合、最適な製造、生体機能化、および特徴付け方法の選択は、強く相互に関連している。明らかに、ナノファブリケーション技術の選択は、システムの固相構成要素の要件によって駆動される検出方法に大きく依存しているtuの中rnは関連するバイオポリマーの性質およびインターフェースを監視する目的で決定される。 バイオコンジュゲートシステム1,3、表面増強ラマン分光法（SERS）特徴付けるために適用される技術は、幅広い種類の外表面8,9,10,11上に化学的及び生物学的種を検出するための非常に有望な方法として出現した。 SERSは、分子振動に対応する固有の署名の捕捉を可能にする表面固定化生体分子（ 図1）による単色光の非弾性散乱を利用する。ラベル、錯体化学、または時間のかかるステップを伴うことなく、異なる分子を区別するために、この機能は、SERSバイオ検出の可能性が非常に効率的な方法になります。 SERSの別の重要な利点は、その高い感度である。貴金属ナノ構造体（SERS基板）と相互作用する光による局在表面プラズモンの励起が劇的整数を増加ラマン単層からの単一分子制限8,9,10,11まで、分子が非常に少量の検出を可能にする、検体によって散乱ensity。最後に、ほとんどの生体分子は、水溶液は安定であることが必要です。水は、多くの場合、制限されたラマン活性を有するので、水性サンプルからのバックグラウンド信号9を最小限に抑えられる。 SERSのアプリケーションは、最後の十年間10以上の指数関数的な増加を示している。しかしながら、SERSの多くの議論の課題は、ラマン散乱の電磁増強は、プラズモン波が11,12,13に誘導される金属ナノ構造のサイズ、形状、及び間隔に決定的に依存することである。効率的かつ再現可能なSERS測定を達成するために、基板形状の制御は、ナノスケール寸法で必要とされる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig1.jpg" /> 図1. Scは表面増強ラマン分光法のヘム。 SERS基板11,12,13を製造するために用いられる多くの方法は、大きくボトムアップおよびトップダウン方法に分類することができる。第一のタイプの方法は、自己組織化又はナノ構造を生成する指向性化学合成の様々なプロセスを採用する。多くの場合、例としては、固体支持体11,12,13、熱、スパッタ、または粗い金属膜11,12の電気化学堆積、および種々の化学合成法13に単分散ナノ粒子の固定化を含む宛て。このような技術は、比較的単純かつ安価である傾向があるが、それらのほとんどは、構造物の位置、および限定されたサンプル間の再現性の制御の欠如によってチャレンジする。 対照的に、トップダウン·リソグラフィ技術は、表面上に所望のパターンを作成するなどの粒子ビームとして操作可能な器具を使用する。最も頻繁に使用されるのひとつ固体支持体11,12上の異なる基板の設計を可能にするためにも、10 nmおよび以下柔軟性まで備えにわたってナノリソグラフィ法は、電子ビームリソグラフィ（EBL）は、優れた制御を提供する。 EBLは、電子のビームは、露光された領域において化学変化を引き起こす電子感応性材料（レジスト）の表面を横切って直径スキャン数ナノメートルのスポットまで焦点を当てた。ポジティブトーンポリメチルメタクリレート（PMMA）、適切な溶媒（現像液）に対する溶解性が増大につながる、レジストを構成するポリマー鎖の切断で電子ビーム露光の結果として抵抗する。電子ビームリソグラフィのプロセスは、基板上のレジストの均一な層のスピンコーティングを含む。電子ビームを真空チャンバ内のターゲットとレジスト材料の露光。可溶性領域を除去するためにサンプルの開発。 溶融シリカなどの金属ナノ構造の下に誘電体支持体は、bとがあるのeenは著しく、シリコン14,15のような他の材料に比べて、プラズモン波の局在によるSERSにおける強度を増加させることが示さ。しかしEBLパターニングは、誘電体基板上に、特にナノスケールで、露光中のビルドアップを充電するのに起因する重大な課題を伴う。以前、我々はこれらの困難は、レジスト上に導電性高分子層を配置することによって克服できること16,17を示している。 図2融合上の金属ナノ構造を生成するために金属蒸着及びリフトオフ続いEBL露光および現像を使用して、全体的な製造プロセスの概略図を示すシリカ担体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig2.jpg" /> Eの図2.スキームlectronビームリソグラフィ、金属堆積、及び誘電体基板16〜19上に金属ナノ構造を作製するために用いるリフトオフ工程段階。この論文では、EBL、基質のバイオ機能化によるSERS基板の製造を含むプロセスステップのシーケンス全体を提示し、そしてラマンスペクトルのコレクション。我々の最近の研究18,19で検討つの設計は、（参照図3および図4、および表1）アドレス指定される。デザイン1において、組換えタンパク質Aは、溶融シリカ（FS）支持体18上の生体機能を有する金ナノ構造体上に固定化され、タンパク質のSERS検出を実証する。デザイン2では、リガンド（D-グルコース）の有無による組換えグルコース結合タンパク質21,26,27を Niで被覆されたFS上にAgナノ構造間の空間にヒスチジンタグにより、固定化され、タンパク質への糖の結合検出された。デザイン3では、ドーパミン結合DNをチオール化アプタマー19,23は、FS上のAuナノ構造体上に固定され、固定化されたアプタマーによってドーパミンの結合が実証される。 SERSの発展にSERSにより、ナノ生物学のインターフェイスを問い合わせる探査研究から、基板のラマンスペクトルの取得に準備し、固定化の異なる生体分子と戦略の代表から、関連するすべての実験工程を含めて、これらの例はさまざまなアプリケーションのために有用である認識方法として、結合タンパク質-またはアプタマーリガンドを利用する小分子のバイオセンサー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig3.jpg" /> 異なる生体分子を用いた3つの代表的なデザインの図3のスキーム、immobiliza方法ン、および基板材料：DI水中の11-メルカプトデカン酸（MUA）の自己組織化単分子膜（SAM）で官能化貴金属ナノドット上に固定化された（A）タンパク質A;貴金属ナノドット間の基板表面に固定化されたD-グルコースと複合体を形成し（B）、ヒスチジンタググルコース結合タンパク質（GBP）。貴金属ナノドットに固定化されたドーパミンで完了（C）チオール末端ドーパミン結合アプタマー（DBA）。 表1のさらに詳しい情報を見る。パネル（B）で示した設計2では、対応するリガンドを含まないサンプルも比較のために用意した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig4.jpg" /> 図4。3の設計に用いられる生体分子：（A）タンパク質A; （B）グルコース結合タンパク質およびD-グルコース。 （C）DNAアプタマーとドーパミンを結合ドーパミン。タンパク質立体構造（a）および（b）はそれぞれ、及びLINUXAMD64ためのVMDで描かプロテインデータバンク、PDB ID 1BDD 20と2HPH 21、バージョン1.9.1 22から取られる。 （c）において、アプタマーの二次構造はValFold 24ソフトウェアを用いて配列23から予測及びPseudoViewer 3.0 25で描かれている。それぞれの文字G、A、T、およびCグアニン、アデニン、チミン、およびシトシンヌクレオチドに対応し、。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" fo:keep-together.within-page="always" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> デザイン1 </TD&gt; <td> デザイン2 </td><td> デザイン3 </td></tr><tr><td> バイオポリマー </td><td>プロテインA </td><td>グルコース結合タンパク質（GBP） </td><td>ドーパミン結合アプタマー（DBA） </td></tr><tr><td> バインダー </td><td> 11-メルカプトウンデカン酸（MUA）自己組織化単分子膜（SAM） </td><td>ヒスチジンタグ</td><td>チオールリンカー</td></tr><tr><td> リガンド </td><td>なし</td><td> D-グルコース</td><td>ドーパミン</td></tr><tr><td> ソリューション </td><td>脱イオン（DI）水</td><td>リン酸カリウム緩衝液</td><td>トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）及びエチレンジアミン四酢酸（EDTA）緩衝液;リン酸緩衝生理食塩水（PBS） </td></tr><tr><td> 基板 </td><td> FS上のAu構造</td><td>ニッケルコーティングされたFS上のAgの構造</td><td> FS上のAu構造</td></tr><tr><td> パターン化されたAREA </td><td> 4ミクロン×10ミクロン</td><td> 4ミクロン×8ミクロン</td><td> 4ミクロン×10ミクロン</td></tr><tr><td rowspan="3"> パターン </td><td rowspan="3">金ドット、50nmのピッチ</td><td>銀ドット、40 nmのピッチ</td><td>金六角形、200nmのピッチ</td></tr><tr><td>銀六角形、200nmのピッチ</td><td> Auの構造化されていないパッド</td></tr><tr><td> Agの構造化されていないパッド</td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"> EBL被ばく線量 </td><td>ドット： </td><td>ドット：105μC/ cm 2程度</td><td rowspan="4">六角形：180μC/ cm 2程度</td></tr><tr><td>アレイのI 120μC/ cm 2程度</td><td>六角形：170μC/ cm 2程度</td></tr><tr><td>配列II 96μC/ cm 2程度</td><td></td></tr><tr><td>配列III 72μC/ cm 2程度</td><td></td></tr><tr><td> レーザー励起波長 </td><td> 532 nmの</td><td> 532 nmの</td><td> 780 nmの</td></tr></tbody></table> 表1.ナノ生物系の三つのデザインを。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>11-Mercaptoundecanoic acid (MUA)</td>
			<td>Sigma Aldrich 
			 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.sigmaalrich.com">(www.sigmaalrich.com)</a></td>
			<td>450561&#160; ALDRICH</td>
			<td>Used for surface functionalization in Design 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive polymer&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Rayon 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.mrc.co.jp">&#160;(www.mrc.co.jp)</a></td>
			<td>aquaSAVE-57xs</td>
			<td>A 70 nm thick&#160; layer is used as anti-charging coating for EBL exposures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Collaborator Lab.</td>
			<td></td>
			<td>Ligand in Design 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine</td>
			<td>Collaborator Lab.</td>
			<td></td>
			<td>Ligand in Design 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine binding aptamer (DBA)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies Inc. 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.idtdna.com">(www.idtdna.com)</a></td>
			<td>5&#39;- /Thiol Modifier C6 S-S/&#160;AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3&#39;&#160;</td>
			<td>Biopolymer in Design 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica wafers</td>
			<td>Mark Optics 
			<a href="http://www.markoptics.com/">www.markoptics.com</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose binding protein (GBP)</td>
			<td>Collaborator Lab. 
			<a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi%7C145579532">(www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi|145579532)</a></td>
			<td>PDB ID 2HPH</td>
			<td>Biopolymer in Design 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.dowcorning.com">(www.dowcorning.com)</a></td>
			<td></td>
			<td>Used to seal water-proof chamber, step 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%, H2O2</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td></td>
			<td>Used for pirahna solution, step 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethyl-N&#39;-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Sigma Aldrich 
			<a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td>
			<td>03450 FLUKA</td>
			<td>Used for immobilization of biopolymer in Design 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma Aldrich 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.sigmaaldrich.com">(www.sigmaaldrich.com)</a></td>
			<td>130672 ALDRICH</td>
			<td>Used for immobilization of biopolymer in Design 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate buffer</td>
			<td>Collaborator Lab.</td>
			<td></td>
			<td>Buffer used in Raman sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered&#160;</td>
			<td>Collaborator Lab.</td>
			<td></td>
			<td>Solvent in Design 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2</td>
			<td>MicroChem&#160; 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.microchem.com">(www.microchem.com)</a></td>
			<td></td>
			<td>A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein A</td>
			<td>Protein Mods Inc 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.proteinmods.com">(www.proteinmods.com)</a></td>
			<td>PDB ID 1BDD 
			<a href="http://%28www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd">(www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd)</a></td>
			<td>Biopolymer in Design 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 96%, H2SO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td></td>
			<td>Used for pirahna solution, step 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.sigmaaldrich.com">(www.sigmaaldrich.com)</a></td>
			<td>T9285 SIGMA</td>
			<td>Buffer in Design 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicing saw</td>
			<td>Diamond Touch Technology Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to cut FS wafer, step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Kurt J. Lesker 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.lesker.com">(www.lesker.com)</a></td>
			<td></td>
			<td>Used for Au and Ag evaporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Johnsen Ultravac (JUV) 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.ultrahivac.com">(www.ultrahivac.com)</a></td>
			<td>JuV E-gun</td>
			<td>Used for Ni evaporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slips (25 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.fishersci.ca">(www.fishersci.ca)</a></td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>Used in water-proof chamber, step 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (3&#215;1 in.)</td>
			<td>Fisher Scientific 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.fishersci.ca">(www.fishersci.ca)</a></td>
			<td></td>
			<td>Used in water-proof chamber, step 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raith 150TWO EBL exposure system</td>
			<td>Raith Inc. 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.raith.com">(www.raith.com)</a></td>
			<td>Raith 150TWO&#160; system</td>
			<td>Used for EBL exposures, step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raman microscope</td>
			<td>Thermo Scientific 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.thermoscientific.com">(www.thermoscientific.com)</a></td>
			<td>Nicolet Almega XR</td>
			<td>Used for Raman spectroscopy, step 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator system</td>
			<td>Branson 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.bransonic.com">(www.bransonic.com)</a></td>
			<td></td>
			<td>Used for liftoff and solutions mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner</td>
			<td>Brewer Spinner and Hotplate 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.brewerscience.com">(www.brewerscience.com)</a></td>
			<td><a name="RANGE!C18">Cee 200X and Cee 1300X</a></td>
			<td>Used to spin-coat PMMA and conductive polymer, step 2.1&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface enhanced raman spectroscopy detection of biomolecules using ebl fabricated nanostructured substrates

固定化生体分子と固体支持体上の金属ナノ構造をインターフェース共役ナノ生物学的システムの作製と特性評価が報告されている。関連する実験手順の全配列は、電子ビームリソグラフィー、基板上の生体分子の固定化、およびそれらの特徴付けを利用表面増強ラマン分光法（SERS）を使用して、ナノ構造の基材の製造を含む、記載されている。ナノ生物学的システムの三つの異なる設計は、プロテインA、グルコース結合タンパク質、およびドーパミン結合DNAアプタマーを含む、使用されている。後者の2つのケースでは、それぞれのリガンドの結合を、D-グルコースおよびドーパミンは、も含まれる。生体分子の3種類の異なる方法によってナノ構造の基板上に固定され、SERSイメージングの結果を報告する。 SERSの能力は、表面固定化されたタンパク質からの振動モードを検出するため、ならびにタンパク質 - リガンドのANをキャプチャするDアプタマー - リガンド結合が実証されている。結果はまた、表面ナノ構造の形状、生体分子固定化戦略、分子のラマン活性及び取得SERSスペクトルに結合するリガンドの存在または非存在の影響を示している。

溶液中の遊離タンパク質と金属含有基材を使用せずに、溶液中または粉末形態のフリーのリガンドを含む、主要な構成要素のための制御ラマンスペクトルを収集し、解釈のために、ならびに適切な比較を可能にすることが重要である。 図5Aは、典型的なラマン提示ナノ構造の基材なしのガラススライド上にDI水の中の遊離プロテインAのスペクトル。最高ラマン強度を持つ2つのバンドが、2931センチメートルのバンドは-1と1091センチメートル-1、それぞれ、CHとCS結合を含む振動に対応しています。 563センチメートル-1 1450 -1、1653センチメートル-1及び2426センチメートル-1のような低いラマン強度を有する他のバンドは、振動モード18,32,33,34の重畳に起因し得る。三つの異なる濃度、0.3、0.9及び1.3mMの有する緩衝溶液中のリガンドフリーGPBの制御ラマンスペクトルは、 図5Bに示されている。 T IN<html>彼は3400センチメートルまわり、広い帯域を把握-1 2935センチメートルのバンドのに対し、溶剤35に対応して-1タンパク質32,33のCH結合を含む振動を表す。 図5Cは、中にD-グルコースのための高い波長のラマンスペクトルを示す異なる濃度のために緩衝液：1、6、100、200、及び400 mMの。グルコースの濃度が増加すると、C-H結合の振動帯は2890センチメートル-1及び2960センチメートル-1で生じる。 532 nmおよび780 nmの励起波長の両方で得られた結晶形でのドーパミンの制御ラマンスペクトルを図5Dに示されている。ラマンスペクトルの多くは、ベンゼン環曲げ及び分子19,36のCH結合のストレッチから来ている。約3,000 -1におけるバンドのいくつかは、-1だけ532nmではなく、780 nmの励起波長で観察される。 PLOAD / 52712 / 52712fig5.jpg &quot;/&gt; DI水中のプロテインAの図5の制御ラマンスペクトルは532nmの励起波長18（A）で得られた。緩衝溶液中のリガンド遊離グルコース結合タンパク質のラマンスペクトルは、532 nmの励起波長（B）で得られた。緩衝溶液中のD-グルコースのラマンスペクトルは、532 nmの励起波長（C）で得られた。ドーパミン粉末のスペクトルは、532 nmおよび780 nmの励起波長19（D）で得られた。全てのスペクトルは、ナノ構造の基材なしでガラススライド上に溶液のラマンスペクトル（a、b、c）を、粉体（d）は規則的である。 （D）においては、様々な分子振動のラマンシフトレジームの割り当ては、他の場所19に詳述するように一般的な原子分子の電子構造システム（GAMESS）30とMacMolPlt 31ソフトウェアを用いて行った。 18 AMERICから許可を得て転載パネル（A）真空協会。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ステップ1-3で説明したように、表面固定化生体分子のためのSERSスペクトルを得るためには、溶融シリカ担体上に金属ナノ構造を含む基板が製造される。作製した基板の品質は、走査型電子顕微鏡（SEM）を使用して監視される。標準的なSEM手順は他の場所16,17,18、19ず、本プロトコールに含ま記載されている。 図6に示す代表的なSEM構造（パネル広告）等のAuおよびAgナノドット、ナノ六角形の画像、ならびに非図 -structured AuとAgのパッド（それぞれ、パネルeおよびf）。次のステップは、 表1に記載されている3つのデザインを採用したナノ構造化基板上の生体物質の固定化、およびそれらのSERSスペクトルの収集を伴う。 O中<html>ラマンイメージング中に水性環境を維持するRDER、各サンプルは、対応する溶液中に配置され、図7に示すように、薄いガラスカバーで蓋をし ​​、密封し、（ 表1参照）。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig6.jpg" /> 図6の走査型電子顕微鏡（SEM）SERS基板として用い、厚さ10nmのAuとAg表面のナノ構造の画像（A、B）ナノドットのアレイ。 （C、D）ナノ六角形のアレイ。 （E、F）構造化されていないパッド。 Agの構造（右）との基板はFS上の厚さ10nmのNiコーティングを使用するのに対し、Auの構造（左）と基材は、FSのサポー​​トを採用。他の箇所16,17,18に記載されるような画像が得られた。PG &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig7.jpg" /> 溶液中の生体機能を有するサンプルのラマンイメージング用防水室の図7.スキーム。 デザイン1において、組換えタンパク質Aは、脱イオン水18で11-メルカプトデカン酸（MUA）の自己組織化単分子層で官能基材上に固定される。この設計では基板は（ 図6Aおよび図8参照）が50nmピッチでのAuドットの3つの配列を含み、溶融シリカ上のドット間の距離を変化させる。タンパク質の固定化のプロセスは、基板上のSAMの形成で始まる。 SAMとタンパク質との間の共有結合を得るために、SAMのカルボン酸基は、Nの混合物で処理することにより、アミン反応性NHSエステルに変換される</em&gt;の-エチル- N &#39; - （3-（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド（EDC）溶液およびDI水中のNヒドロキシスクシンイミド（NHS）溶液。プロテインAの固定化は、タンパク質37のリジン残基によりNHS基の置換により起こる。 Auのナノ構造体上に固定化プロテインAを使用したデザイン1用撮像サンプルの例を図9に示されている。（ 図9（a）は、別のドット間の隙間と、生体機能を有する金ナノドットの3つの配列を含むサンプルの光学顕微鏡像を示すまた、 部3Aaと8）を図 、および図9Bは 、これらのアレイ上のラマンスペクトルマッピングを示しています。それは、最高のラマン強度の低い強度が最も広いドット間のギャップを有する配列IIIについて得られるのに対して、Iは、ドット間の隙間が狭くている配列のために発見されたことが分かる。これは、より高い電気情けないによって生成強いプラズモンカップリング効果によって説明することができるドット18の間の狭いスペースでのLDS。 図9Cは、配列IおよびIIに対して得られた最強のSERSスペクトルを示す。スペクトルは、 図5Aに見られる溶液中の遊離プロテインAのラマンモードの近くにいくつかのバンド（1630センチメートル-1、1964センチメートル-1、2280センチメートル-1、2577センチメートル-1、および2916センチメートル-1）を示す。タンパク質中に見られる様々な債券の振動に起因する、これらのバンドは、両方の固定されたタンパク質で、その溶液中で同様の場所に表示され、または固定化された時、わずかにやや高い波数にシフトしているのどちらか。これとは対照的に、タンパク質なしにMUA SAMによって官能類似のナノ構造基板のSERSスペクトルは、 図9は、表面固定化プロテインAのSERSマッピングを表していることを確認した、全く異なるパターン18を示 ​​して<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig7large.jpg" target="_blank">見るにはこちらをクリックしてください</a><html>この図の拡大版。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig8.jpg" /> 図デザイン1 18で使用されるFS基板上のAuナノドットの3つの配列の8 SEM像。配列は、ドット間のギャップの幅が異なる結果として、同じ50nmのピッチと若干異なるドット半径を持っている。これは、3つのアレイのためのPMMAマスクを生成するために異なるEBL露光量を適用することによって達成される（ 表1参照）。より高い被ばく線量はメタライゼーションとリフトオフ後に、より大きな金のドットサイズを可能に、PMMAマスクより広い穴になる。 18米国真空学会から許可を得て転載。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> レ/ ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg &quot;/&gt; デザイン1 18における基板固定プロテインAの図9 SERSイメージング。溶融石英基板上に50nmのピッチと異なるドット間の隙間のAuナノドットの3つの配列を含む（A）試料の光学顕微鏡像、（参照図6）は 、生体機能を有する、図3Aに示すように（B）サンプルのラマンマッピング。ドットアレイIおよびIIから（C）SERSスペクトル。パネル（B）において、縦軸は、基板を横断する距離を表し、横軸はラマンシフトを示し、凡例バーはラマン強度を示している。垂直パネル内のパネルのライン（B）及び（C）溶液中で遊離プロテインAのベンチマークラマンバンドを表す（*）は、破線（C）は 、アレイI.ラマンスペクトルからのSERSバンドを示し、532nmの励起を得た。波長。 18米国真空学会から許可を得て転載。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> デザイン2で、D-グルコース（リガンド）と複合体を組換え糖結合タンパク質（GBP）21は、リン酸カリウム緩衝液中で、適切な基質上に固定化される。固定化リガンドを含まないGBPを有する試料も比較のために用意されている。この設計では、グルコース結合タンパク質は、貴金属6にはNiによく結合ではなくヒスチジンタグを用いて表面に取り付けられている。基板は、Agナノドット、ナノ六角形、及びNiコーティングされたFSに構造化されていない銀のパッド（それぞれ、 図6B、6D、および6F）のアレイを含むので、一方が固定化されたタンパク質分子の大部分の間の隙間に配置されることを期待することができニッケルコーティングがavがあるAgのナノ構造ailable。ラマンスペクトルは、固定化された無グルコース及びグルコース結合GBPについて得られた、それぞれ、 図10Aおよび10Bに示されている。すべてのこれらのスペクトルは、約緩衝液35に対応する3300センチメートル-1、広い帯域を示す。構造化されていない銀パッドで得られたスペクトルは、この単一のバンドを含み、そして予想通り、固定化タンパク質は、Ag表面上に見出されていないことを確認し、任意のタンパク質の振動モードを示していない。これとは対照的に、スペクトルは、Agナノドットと1550センチメートル-1と2900センチメートル周りにナノ六角形の展示バンド-1、分析対象物32,33を表すの配列を用いて得られる。具体的には、広帯域の周り1550センチメートル-1、アミドIIバンドとして知られている、タンパク質33,34で結合が振動ペプチドすることによるものである。と考えた場合に、このバンドは、Agの特徴との間のNi表面上に固定化されたGBPの振動モードの重畳を表すナノドット又はナノ六角形を含有する基質を使用した場合の、とは、貴金属ナノ構造体の近傍のこれらのモードのSERS増強を示す。このバンドは、結合タンパク質のために利用可能なNi表面なし銀パッド上SERS増強（ 図5B）及び不在の不在下で溶液中のタンパク質のための非常に弱いが、それは、タンパク質のためのアクセス可能ないくつかのNi表面を有するナノ構造の基材のために顕著であるバインドします。しかし、さらに重要な本研究のためには、他の、狭いバンドの周りに約2900センチメートル-1 CH結合wibrations 32,33に起因することができます。グルコースを含まないGBPのスペクトルは2933センチメートル-1ナノ六角形基板（ 図10A）と類似した波長のナノドット基板、および、弱いが識別可能なバンドでの顕著なバンドを示す。グルコース自由なタンパク質の場合とは異なる、グルコース結合GBPのSERSスペクトルは、 ふぃぎゅに示す<html> 2850センチメートル-1と2910センチメートル-1に、債券の振動体制をCHに対応する図10（b）の展示再二つのバンド。バンドはよくナノ六角形基板上のグルコース結合GBPのスペクトルに顕著である、と彼らはまた、ナノドット基板上のGBPのスペクトルで見ることができる。 2850センチメートルのバンドは他のバンド-1に対し（2910センチメートルで、2890センチメートルに適度に近い-1つのソリューションのD-グルコースからの制御ラマンスペクトルであるため、それがタンパク質に結合したグルコースに起因することができる-1）タンパク質及びグルコースの両方のCH結合の振動に起因している。一つは、グルコースを含まないとグルコース結合基質固定化GBPからSERSシグネチャの違いを結論付けることができ、この領域で観測可能で、タンパク質結合グルコースのCH結合の振動が説明した設計を採用した検出可能である。 10.JPG &quot;/&gt; リガンドフリー（A）の図10. SERSスペクトルとデザイン2で3異なる基板上に固定化されたリガンド結合（B）グルコース結合タンパク質 。スペクトル。780 nmの励起波長を用いて得られた<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig10large.jpg" target="_blank">拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。</a> 設計3は、チオール終端23と、カスタマイズのドーパミン結合アプタマー（DBA）は、トリス、基板（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）緩衝液で固定し、ドーパミンは、その後、固定化アプタマー19に結合されている。この設計のための基質は、FS（ 図6C）上のAuナノ六角形の配列を含む。構造化されていない金パッド（ 図6E）は 、制御目的のために使用される。 DNAは本質的に蛍光性であることから38、780 nmの励起waveleng<html> thは、この要因を減少させるために設計3で使用されている。この設計では、認識要素（アプタマー）は、ドーパミン、この領域における重要なラマン活性を示し、一方、 図11において考慮ラマンシフトの領域の活性ラマンない。固定化されたアプタマーなしドーパミンのみに曝露した試料からのシグナルが19ない結果ドーパミンバンドを示さないので、観測されたSERSバンドがアプタマーに結合したドーパミン由来すると予想される。 図11は、添加前と後の金ナノ構造体上の固定化されたアプタマーのSERSスペクトルを比較するドーパミン。予想されたように、固定化されたドーパミンのないアプタマーは、ラマンバンドを示さない。対照的に、顕著なラマンバンドの数は、ドーパミン結合固定化アプタマーについて観察される。 図11の中で最もバンドの位置は、振幅の違いはあるものの、結晶質のドーパミンのものに近い。 igure 11 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg &quot;/&gt; リガンドフリー（パープルライン）の図11. SERSスペクトルとデザイン3 19中のAuナノ六角基板上に固定化されたリガンド結合（青線）ドーパミン結合アプタマー。赤い線は、ドーパミン粉末の制御SERSスペクトルを示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig11large.jpg" target="_blank">してくださいこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

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Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates

We describe the fabrication and characterization of nano-biological systems interfacing nanostructured substrates with immobilized proteins and aptamers. The relevant experimental steps involving lithographic fabrication of nanostructured substrates, bio-functionalization, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) characterization, are reported. SERS detection of surface-immobilized proteins, and probing of protein-ligand and aptamer-ligand binding is demonstrated.

表面EBL作製したナノ構造基板を用いた生体分子のラマン分光検出の強化

Fabrication and characterization of conjugate nano-biological systems interfacing metallic nanostructures on solid supports with immobilized biomolecules ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

20.1K ビュー.  University of Alberta. We describe the fabrication and characterization of nano-biological systems interfacing nanostructured substrates with immobilized proteins and aptamers. The relevant experimental steps involving lithographic fabrication of nanostructured substrates, bio-functionalization, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) characterization, are reported. SERS detection of surface-immobilized proteins, and probing of protein-ligand and aptamer-ligand binding is demonstrated. 

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Preparation and Reactivity of Gasless Nanostructured Energetic Materials

High-Energy Ball Milling (HEBM) is a ball milling process where a powder mixture placed in the ball mill is subjected to high-energy collisions from the balls. Among other applications, it is a versatile technique that allows for effective preparation of gasless reactive nanostructured materials with high energy density per volume (Ni+Al, Ta+C, Ti+C). The structural transformations of reactive media, which take place during HEBM, define the reaction mechanism in the produced energetic&#160;composites. Varying the processing conditions permits fine tuning of the milling-induced microstructures of the fabricated composite particles. In turn, the reactivity, i.e., self-ignition temperature, ignition delay time, as well as reaction kinetics, of high energy density materials depends on its microstructure. Analysis of the milling-induced microstructures suggests that the formation of fresh oxygen-free intimate high surface area contacts between the reagents is responsible for the enhancement of their reactivity. This manifests itself in a reduction of ignition temperature and delay time, an increased rate of chemical reaction, and an overall decrease of the effective activation energy of the reaction. The protocol provides a detailed description for the preparation of reactive nanocomposites with tailored microstructure using short-term HEBM method. It also describes a high-speed thermal imaging technique to determine the ignition/combustion characteristics of the energetic materials. The protocol can be adapted to preparation and characterization of a variety of nanostructured energetic composites.

This protocol describes the preparation of gasless nanostructured energetic materials (Ni+Al, Ta+C, Ti+C) using the short-term high-energy ball milling (HEBM) technique. It also describes a high-speed thermal imaging method to study the reactivity of mechanically fabricated nanocomposites. These protocols can be extended to other reactive nanostructured energetic materials.

Gaslessナノエネルギー物質の調製と反応性

High-Energy Ball Milling (HEBM) is a ball milling process where a powder mixture placed in the ball mill is subjected to high-energy collisions from the ...

工学

Characterization of Nanocrystal Size Distribution using Raman Spectroscopy with a Multi-particle Phonon Confinement Model

Analysis of the size distribution of nanocrystals is a critical requirement for the processing and optimization of their size-dependent properties. The common techniques used for the size analysis are transmission electron microscopy (TEM), X-ray diffraction (XRD) and photoluminescence spectroscopy (PL). These techniques, however, are not suitable for analyzing the nanocrystal size distribution in a fast, non-destructive and a reliable manner at the same time. Our aim in this work is to demonstrate that size distribution of semiconductor nanocrystals that are subject to size-dependent phonon confinement effects, can be quantitatively estimated in a non-destructive, fast and reliable manner using Raman spectroscopy. Moreover, mixed size distributions can be separately probed, and their respective volumetric ratios can be estimated using this technique. In order to analyze the size distribution, we have formulized an analytical expression of one-particle PCM and projected it onto a generic distribution function that will represent the size distribution of analyzed nanocrystal. As a model experiment, we have analyzed the size distribution of free-standing silicon nanocrystals (Si-NCs) with multi-modal size distributions. The estimated size distributions are in excellent agreement with TEM and PL results, revealing the reliability of our model.

We demonstrate how to determine the size distribution of semiconductor nanocrystals in a quantitative manner using Raman spectroscopy employing an analytically defined multi-particle phonon confinement model. Results obtained are in excellent agreement with the other size analysis techniques like transmission electron microscopy and photoluminescence spectroscopy.

多粒子フォノン閉じ込めモデルとラマン分光法を用いて、ナノ結晶のサイズ分布の特性

Analysis of the size distribution of nanocrystals is a critical requirement for the processing and optimization of their size-dependent properties. The ...

Resonance Raman Spectroscopy of Extreme Nanowires and Other 1D Systems

This paper briefly describes how nanowires with diameters corresponding to 1 to 5 atoms can be produced by melting a range of inorganic solids in the presence of carbon nanotubes. These nanowires are extreme in the sense that they are the limit of miniaturization of nanowires and their behavior is not always a simple extrapolation of the behavior of larger nanowires as their diameter decreases. The paper then describes the methods required to obtain Raman spectra from extreme nanowires and the fact that due to the van Hove singularities that 1D systems exhibit in their optical density of states, that determining the correct choice of photon excitation energy is critical. It describes the techniques required to determine the photon energy dependence of the resonances observed in Raman spectroscopy of 1D systems and in particular how to obtain measurements of Raman cross-sections with better than 8% noise and measure the variation in the resonance as a function of sample temperature. The paper describes the importance of ensuring that the Raman scattering is linearly proportional to the intensity of the laser excitation intensity. It also describes how to use the polarization dependence of the Raman scattering to separate Raman scattering of the encapsulated 1D systems from those of other extraneous components in any sample.

The paper describes a method for producing extreme nanowires by melt infiltration into carbon nanotubes and how 1D systems may be characterized and investigated using Resonance Raman Spectroscopy to determine vibrational and optical excitation energies.

エクストリームナノワイヤおよびその他の1D系の共鳴ラマン分光

This paper briefly describes how nanowires with diameters corresponding to 1 to 5 atoms can be produced by melting a range of inorganic solids in the ...

The Measurement of Unsteady Surface Pressure Using a Remote Microphone Probe

Microphones are widely applied to measure pressure fluctuations at the walls of solid bodies immersed in turbulent flows. Turbulent motions with various characteristic length scales can result in pressure fluctuations over a wide frequency range. This property of turbulence requires sensing devices to have sufficient sensitivity over a wide range of frequencies. Furthermore, the small characteristic length scales of turbulent structures require small sensing areas and the ability to place the sensors in very close proximity to each other. The complex geometries of the solid bodies, often including large surface curvatures or discontinuities, require the probe to have the ability to be set up in very limited spaces. The development of a remote microphone probe, which is inexpensive, consistent, and repeatable, is described in the present communication. It allows for the measurement of pressure fluctuations with high spatial resolution and dynamic response over a wide range of frequencies. The probe is small enough to be placed within the interior of typical wind tunnel models. The remote microphone probe includes a small, rigid, and hollow tube that penetrates the model surface to form the sensing area. This tube is connected to a standard microphone, at some distance away from the surface, using a "T" junction. An experimental method is introduced to determine the dynamic response of the remote microphone probe. In addition, an analytical method for determining the dynamic response is described. The analytical method can be applied in the design stage to determine the dimensions and properties of the RMP components.

Here, we present a protocol to measure, with high spatial resolution, the unsteady surface pressure in turbulent flows. This method demonstrates the construction of a remote microphone probe (RMP) and the determination of its frequency-dependent, complex transfer function. An analytical determination of the dynamic response is presented and validated.

リモートマイクプローブを用いた非定常面圧の測定

Microphones are widely applied to measure pressure fluctuations at the walls of solid bodies immersed in turbulent flows. Turbulent motions with various ...

Emission Spectroscopic Boundary Layer Investigation during Ablative Material Testing in Plasmatron

Ablative Thermal Protection Systems (TPS) allowed the first humans to safely return to Earth from the moon and are still considered as the only solution for future high-speed reentry missions. But despite the advancements made since Apollo, heat flux prediction remains an imperfect science and engineers resort to safety factors to determine the TPS thickness. This goes at the expense of embarked payload, hampering, for example, sample return missions. 
Ground testing in plasma wind-tunnels is currently the only affordable possibility for both material qualification and validation of material response codes. The subsonic 1.2MW Inductively Coupled Plasmatron facility at the von Karman Institute for Fluid Dynamics is able to reproduce a wide range of reentry environments. This protocol describes a procedure for the study of the gas/surface interaction on ablative materials in high enthalpy flows and presents sample results of a non-pyrolyzing, ablating carbon fiber precursor. With this publication, the authors envisage the definition of a standard procedure, facilitating comparison with other laboratories and contributing to ongoing efforts to improve heat shield reliability and reduce design uncertainties.
The described core techniques are non-intrusive methods to track the material recession with a high-speed camera along with the chemistry in the reactive boundary layer, probed by emission spectroscopy. Although optical emission spectroscopy is limited to line-of-sight measurements and is further constrained to electronically excited atoms and molecules, its simplicity and broad applicability still make it the technique of choice for analysis of the reactive boundary layer. Recession of the ablating sample further requires that the distance of the measurement location with respect to the surface is known at all times during the experiment. Calibration of the optical system of the applied three spectrometers allowed quantitative comparison. At the fiber scale, results from a post-test microscopy analysis are presented.

Development of new ablative materials and their numerical modeling requires extensive experimental investigation. This protocol describes procedures for material response characterization in plasma flows with the core techniques being non-intrusive methods to track the material recession along with the chemistry in the reactive boundary layer by emission spectroscopy.

プラズマトロン内のアブレーション材料試験中の放射分光境界層調査

Ablative Thermal Protection Systems (TPS) allowed the first humans to safely return to Earth from the moon and are still considered as the only solution ...

Use of Sacrificial Nanoparticles to Remove the Effects of Shot-noise in Contact Holes Fabricated by E-beam Lithography

Nano-patterns fabricated with extreme ultraviolet (EUV) or electron-beam (E-beam) lithography exhibit unexpected variations in size. This variation has been attributed to statistical fluctuations in the number of photons/electrons arriving at a given nano-region arising from shot-noise (SN). The SN varies inversely to the square root of a number of photons/electrons. For a fixed dosage, the SN is larger in EUV and E-beam lithographies than for traditional (193 nm) optical lithography. Bottom-up and top-down patterning approaches are combined to minimize the effects of shot noise in nano-hole patterning. Specifically, an amino-silane surfactant self-assembles on a silicon wafer that is subsequently spin-coated with a 100 nm film of a PMMA-based E-beam photoresist. Exposure to the E-beam and the subsequent development uncover the underlying surfactant film at the bottoms of the holes. Dipping the wafer in a suspension of negatively charged, citrate-capped, 20 nm gold nanoparticles (GNP) deposits one particle per hole. The exposed positively charged surfactant film in the hole electrostatically funnels the negatively charged nanoparticle to the center of an exposed hole, which permanently fixes the positional registry. Next, by heating near the glass transition temperature of the photoresist polymer, the photoresist film reflows and engulfs the nanoparticles. This process erases the holes affected by SN but leaves the deposited GNPs locked in place by strong electrostatic binding. Treatment with oxygen plasma exposes the GNPs by etching a thin layer of the photoresist. Wet-etching the exposed GNPs with a solution of I2/KI yields uniform holes located at the center of indentations patterned by E-beam lithography. The experiments presented show that the approach reduces the variation in the size of the holes caused by SN from 35% to below 10%. The method extends the patterning limits of transistor contact holes to below 20 nm.

Uniformly sized nanoparticles can remove fluctuations in contact hole dimensions patterned in poly(methyl methacrylate) (PMMA) photoresist films by electron beam (E-beam) lithography. The process involves electrostatic funneling to center and deposit nanoparticles in contact holes, followed by photoresist reflow and plasma- and wet-etching steps.

犠牲ナノ粒子の使用は、電子ビームリソグラフィにより作製したコンタクトホール内にショットノイズの影響を除去します

Nano-patterns fabricated with extreme ultraviolet (EUV) or electron-beam (E-beam) lithography exhibit unexpected variations in size. This variation has ...

Nanostructured Ag-zeolite Composites as Luminescence-based Humidity Sensors

Small silver clusters confined inside zeolite matrices have recently emerged as a novel type of highly luminescent materials. Their emission has high external quantum efficiencies (EQE) and spans the whole visible spectrum. It has been recently reported that the UV excited luminescence of partially Li-exchanged sodium Linde type A zeolites [LTA(Na)] containing luminescent silver clusters can be controlled by adjusting the water content of the zeolite. These samples showed a dynamic change in their emission color from blue to green and yellow upon an increase of the hydration level of the zeolite, showing the great potential that these materials can have as luminescence-based humidity sensors at the macro and micro scale. Here, we describe the detailed procedure to fabricate a humidity sensor prototype using silver-exchanged zeolite composites. The sensor is produced by suspending the luminescent Ag-zeolites in an aqueous solution of polyethylenimine (PEI) to subsequently deposit a film of the material onto a quartz plate. The coated plate is subjected to several hydration/dehydration cycles to show the functionality of the sensing film.

A protocol for the synthesis of moisture-responsive luminescent Ag-zeolite composites is described in this report.

発光ベースの湿度センサなどのナノ構造のAg-ゼオライト複合

Small silver clusters confined inside zeolite matrices have recently emerged as a novel type of highly luminescent materials. Their emission has high ...

High Temperature Fabrication of Nanostructured Yttria-Stabilized-Zirconia (YSZ) Scaffolds by In Situ Carbon Templating Xerogels

We demonstrate a method for the high temperature fabrication of porous, nanostructured yttria-stabilized-zirconia (YSZ, 8 mol% yttria - 92 mol% zirconia) scaffolds with tunable specific surface areas up to 80 m2&#183;g-1. An aqueous solution of a zirconium salt, yttrium salt, and glucose is mixed with propylene oxide (PO) to form a gel. The gel is dried under ambient conditions to form a xerogel. The xerogel is pressed into pellets and then sintered in an argon atmosphere. During sintering, a YSZ ceramic phase forms and the organic components decompose, leaving behind amorphous carbon. The carbon formed in situ serves as a hard template, preserving a high surface area YSZ nanomorphology at sintering temperature. The carbon is subsequently removed by oxidation in air at low temperature, resulting in a porous, nanostructured YSZ scaffold. The concentration of the carbon template and the final scaffold surface area can be systematically tuned by varying the glucose concentration in the gel synthesis. The carbon template concentration was quantified using thermogravimetric analysis (TGA), the surface area and pore size distribution was determined by physical adsorption measurements, and the morphology was characterized using scanning electron microscopy (SEM). Phase purity and crystallite size was determined using X-ray diffraction (XRD). This fabrication approach provides a novel, flexible platform for realizing unprecedented scaffold surface areas and nanomorphologies for ceramic-based electrochemical energy conversion applications, e.g. solid oxide fuel cell (SOFC) electrodes.

High Temperature Fabrication of Nanostructured Yttria-Stabilized-Zirconia YSZ Scaffolds by In Situ Carbon Templating Xerogels

A protocol for fabricating porous, nanostructured yttria-stabilized-zirconia (YSZ) scaffolds at temperatures between 1,000 &#176;C and 1,400 &#176;C is presented.

によってナノ構造イットリア安定化ジルコニア（YSZ）足場の高温製作<em&gt;その場での</em&gt;カーボンテンプレート化キセロゲル

We demonstrate a method for the high temperature fabrication of porous, nanostructured yttria-stabilized-zirconia (YSZ, 8 mol% yttria - 92 mol% zirconia) ...

Preparation of Janus Particles and Alternating Current Electrokinetic Measurements with a Rapidly Fabricated Indium Tin Oxide Electrode Array

This article provides a simple method to prepare partially or fully coated metallic particles and to perform the rapid fabrication of electrode arrays, which can facilitate electrical experiments in microfluidic devices. Janus particles are asymmetric particles that contain two different surface properties on their two sides. To prepare Janus particles, a monolayer of silica particles is prepared by a drying process. Gold (Au) is deposited on one side of each particle using a sputtering device. The fully coated metallic particles are completed after the second coating process. To analyze the electrical surface properties of Janus particles, alternating current (AC) electrokinetic measurements, such as dielectrophoresis (DEP) and electrorotation (EROT)- which require specifically designed electrode arrays in the experimental device- are performed. However, traditional methods to fabricate electrode arrays, such as the photolithographic technique, require a series of complicated procedures. Here, we introduce a flexible method to fabricate a designed electrode array. An indium tin oxide (ITO) glass is patterned by a fiber laser marking machine (1,064 nm, 20 W, 90 to 120 ns pulse-width, and 20 to 80 kHz pulse repetition frequency) to create a four-phase electrode array. To generate the four-phase electric field, the electrodes are connected to a 2-channel function generator and to two invertors. The phase shift between the adjacent electrodes is set at either 90&#176; (for EROT) or 180&#176; (for DEP). Representative results of AC electrokinetic measurements with a four-phase ITO electrode array are presented.

In this article, a simple method to prepare partially or fully coated metallic particles and to perform AC electrokinetic property measurements with a rapidly fabricated indium tin oxide (ITO) electrode array is demonstrated.

急速に製造された酸化インジウムスズ電極アレイによるヤヌス粒子の調製と交流電気力学的測定

This article provides a simple method to prepare partially or fully coated metallic particles and to perform the rapid fabrication of electrode arrays, ...

Experimental Methods for Trapping Ions Using Microfabricated Surface Ion Traps

Ions trapped in a quadrupole Paul trap have been considered one of the strong physical candidates to implement quantum information processing. This is due to their long coherence time and their capability to manipulate and detect individual quantum bits (qubits). In more recent years, microfabricated surface ion traps have received more attention for large-scale integrated qubit platforms. This paper presents a microfabrication methodology for ion traps using micro-electro-mechanical system (MEMS) technology, including the fabrication method for a 14 &#181;m-thick dielectric layer and metal overhang structures atop the dielectric layer. In addition, an experimental procedure for trapping ytterbium (Yb) ions of isotope 174 (174Yb+) using 369.5 nm, 399 nm, and 935 nm diode lasers is described. These methodologies and procedures involve many scientific and engineering disciplines, and this paper first presents the detailed experimental procedures. The methods discussed in this paper can easily be extended to the trapping of Yb ions of isotope 171 (171Yb+) and to the manipulation of qubits.

This paper presents a microfabrication methodology for surface ion traps, as well as a detailed experimental procedure for trapping ytterbium ions in a room-temperature environment.

微細加工を用いたイオンを捕集する実験方法表面イオン トラップ

Ions trapped in a quadrupole Paul trap have been considered one of the strong physical candidates to implement quantum information processing. This is due ...