The authors would like to thank: David Wishart, Valentyna Semenchenko, Mark McDermott, Michael Woodside, and Albert Cao for their help in developing and preparing the protein conjugates as well as the DNA aptamer; T. M. Fahim Amin, Mosa Sharmin Aktar, and Trevor Olsen for their assistance in the sample preparation, Jonathan Mane for his assistance in generating images of the molecular structures; and the funding sources including the National Research Council of Canada &#8211; National Institute for Nanotechnology (NRC-NINT), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), and the University of Alberta for supporting the work.

1. Preparazione del supporto <ol><li> Utilizzare un semiconduttore dadi sega per tagliare un silice fusa (FS) wafer diventare 1 cm × 1 cm o più piccoli dadi. </li><li> Campioni puliti in una soluzione piranha (H 2 SO 4: H 2 O 2, 3: 1; ATTENZIONE: forte ossidante) Bagno 28 per 15 minuti, quindi risciacquare i dadi in acqua deionizzata e asciugare in azoto. </li><li> Porre i campioni su una piastra faccia fino a 180 ° C per 15 min. Raffreddare i campioni dopo la rimozione dalla piastra a RT. </li><li> Per Disegni 1 e 3, passare al punto 2. </li><li> Per Design 2, posizionare il campione in una camera di evaporazione a fascio elettronico e cappotto con uno strato di 10 nm di Ni. </li></ol> 2. Realizzazione di maschere in PMMA Nano-fantasia Utilizzo Electron Beam Lithography (EBL) <ol><li> Spin-coat il PMMA resistere e strati conduttivi sui substrati. <ol><li> Utilizzare un filatore di wafer con un mandrino vuoto e posto campioni individualmente al centro sul mandrino. Luogo1 goccia di polimetilmetacrilato (PMMA) resiste al centro dei campioni utilizzando una pipetta di vetro e centrifugare a 3500 rpm per 60 sec con un tempo di rampa 2 sec. </li><li> Cuocere i substrati a 180 ° C per 3-5 min. Dopo la cottura dei substrati, raffreddare i campioni a RT. </li><li> Con i substrati raffreddati e restituiti al mandrino filatore, sviluppa una goccia di polimero conduttivo sul substrato. Spin il substrato per 40 secondi a 3000 rpm con un tempo di rampa 2 sec. Campioni Cuocere in forno a 80 ° C per 1 min. </li></ol></li><li> Eseguire esposizione EBL secondo la procedura 16,17,18,29 standard. <ol><li> Utilizzando le istruzioni del produttore, preparare un progetto di esposizione utilizzando funzionalità dosi dalla tabella 1 con la dimensione più piccola possibile passaggio del fascio. </li><li> Caricare il campione nella camera di litografia a fascio elettronico. Se il sistema non ha EBL autofocus, utilizzare un piccolo graffio lontano da dove il modello deve essere esposto e lontano dal bordo tallone per fuocoing. </li><li> Utilizzando le istruzioni del produttore, eseguire la richiesta di messa a fuoco e la correzione dell&#39;astigmatismo, nonché l&#39;allineamento campo di scrittura a seconda del caso, ed esporre il campione. Per consentire il corretto profilo di esposizione e la migliore qualità del modello, utilizzare un 30 keV energia del fascio di elettroni e 7,5 micron apertura per le esposizioni. </li></ol></li><li> Rimuovere il polimero conduttivo e sviluppare campioni esposti. <ol><li> Preparare un beaker con acqua deionizzata (DI) per la rimozione del polimero conduttivo ed un secondo becher con una miscela sviluppatore (IPA: H 2 O, 7: 3), e agitare per 5 minuti a RT. Preparare isopropanolo (alta purezza) in un terzo becher come agente di risciacquo. </li><li> Usando pinzette, posizionare i campioni in acqua per 3 secondi per rimuovere la pellicola di polimero conduttivo, quindi inserire il campione nel sviluppatore e spostare le pinzette lentamente su e giù per 20 sec. Trasferire immediatamente i substrati al isopropanolo e sciacquare per altri 10 secondi, quindi asciugare il campione con azoto. </li> &lt;/ Ol&gt; </li></ol> 3. Noble metallo Nanostructures Fabrication <ol><li> Caricare i campioni capovolto nel sistema di travi evaporatore elettroni per consentire il metallo evaporato da depositare sul fronte dei campioni. Depositare uno spesso strato di Au 10 nm sui campioni per i disegni 1 e 3, e una nm strato Ag 10 for Design 2 ad una velocità di circa 0,1 nm / sec. </li><li> Riempire un sistema sonicazione all&#39;altezza raccomandata con acqua e riempire un bicchiere separato con acetone. Inserire una faccia campione fino sul fondo del bicchiere e lasciare il campione a bagno per 10 min. Tenendo il becher, inserirla nel bagnomaria e consentire l&#39;altezza della acetone per abbinare l&#39;altezza dell&#39;acqua e accendere il sistema sonicazione. Lasciare sonicazione a verificarsi fino a 60 sec. </li><li> Utilizzando la stessa procedura, come specificato al punto 3.1, preparare uniformi Au e Ag substrati pad dalla deposizione di 10 film di metallo spessi nm su FS (disegni 1 e 3) e FS Ni-rivestite (disegno 2) substrAtes saltare il passaggio 2. </li></ol> 4. Bio-funzionalizzazione di substrati <ol><li> Preparare design 1 campioni: <ol><li> Preparare una soluzione 1 mM di 11-mercaptodecanoic acido (MUA) in etanolo a RT. Con ultrasuoni per 10 min. </li><li> Immergere adeguato substrato nanostrutturato nella soluzione di MUA per 48 ore. Lavare il campione con etanolo tre volte e asciugare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare una soluzione da 75 mm di N -ethyl- N &#39;- (3- (dimetilammino) propil) carbodiimide (EDC) in acqua deionizzata. Preparare una soluzione da 15 mm di N -hydroxysuccinimide (NHS) in acqua deionizzata. </li><li> Utilizzando un deposito micropipetta 100 ml di NHS sulla Au sul substrato, e immediatamente aggiungere 100 ml di EDC sulla stessa area. Incubare per 1 min per attivare l&#39;auto-assemblati monostrato (SAM) di MUA. </li><li> Inserire una goccia 100 ml di soluzione di proteina A (47 mM) sulla stessa area del substrato e conservare il campione per 24 ore a 5 ° C in un multi-vano Petri dish con 1 ml di acqua distillata in un altro comparto, e con una busta chiusa. </li><li> Sciacquare il campione in acqua deionizzata per 3 volte mescolando continuamente i campioni in bicchieri separati per 20 secondi in ogni bicchiere. Non lasciate che i campioni asciugare dopo il risciacquo o durante il risciacquo. </li><li> Passare al punto 5. </li></ol></li><li> Preparare design 2 campioni: <ol><li> Preparare una soluzione 0,9 mM di glucosio proteina legante (GBP) in tampone fosfato di potassio (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5). Preparare una soluzione 100 mM di D-glucosio nel buffer. </li><li> Mescolare 30 ml di soluzione di 100 D-glucosio mm e 30 ml di soluzione di 0,9 GBP mM utilizzando un contenitore di plastica provetta 1 ml e una micropipetta. Incubare per 30 min. </li><li> Cauzione 20 microlitri della soluzione GBP libera-ligando e del GBP soluzione ligando-bound ciascuno su substrati preparati con una micropipetta. Conservare i campioni a 5 ° C per 24 ore in una capsula di Petri con un coperchio a tenuta. </li><li> Lavare i campioni 3 volte intampone fosfato di potassio a RT. </li><li> Passare al punto 5. </li></ol></li><li> Preparare design 3 campioni: <ol><li> Diluire la soluzione aptamer vincolante dopamina (DBA) ad una concentrazione di 1 mM utilizzando il tampone TRIS EDTA con un pH finale di 7,4. </li><li> Preparare una soluzione dopamina ad una concentrazione 5 mM misurando la polvere dopamina su bilancia analitica e mescolandolo in tampone fosfato salino (PBS) con un tallone mescolare per 5 min. </li><li> Depositare una goccia 20 ml della soluzione DBA sulla superficie di ciascun substrato e lasciare che i campioni riposare per 1 ora a RT con un coperchio sul piatto Petri. </li><li> Risciacquare i campioni 3 volte in tampone fosfato di potassio (K 2 HPO 4, 25 mM, pH 7,5). </li><li> Porre i campioni verticalmente sulla sommità di una camera bianca grade strofinata per asciugare retro mantenendo una pellicola sul lato anteriore del substrato. Impostare un campione parte come controllo. </li><li> Mettere una goccia 5 ml di soluzione di dopamina on la superficie della goccia esistente della soluzione tampone PBS sui restanti campioni con le concentrazioni di dopamina desiderati. Incubare il campione per 10 min. </li><li> Inserire una goccia della soluzione dopamina sulla superficie del tappetino Au senza aptamer. Incubare per 10 min. </li><li> Risciacquare i campioni nella soluzione tampone fosfato di potassio 3 volte. </li></ol></li></ol> 5. Spettroscopia Raman <ol><li> Collocare ogni campione in una camera stagna per evitare l&#39;evaporazione di esposizione laser. <ol><li> Riempire una siringa di plastica con grasso alto vuoto chimicamente inerte, posto campioni su vetrini e dispensare pochi millimetri di grasso che circonda i campioni senza toccare i campioni. </li><li> Inserire un coprioggetto microscopio sopra del substrato e premere delicatamente fino a formare una tenuta, creando un&#39;interfaccia liquido sottile tra i substrati ei coprioggetti senza consentire il buffer venga a contatto con il grasso per vuoto. </li></ol></li><li> Utilizzando unsistema ottico del microscopio Raman, ottenere una focalizzazione sulla superficie della regione nano-modellata metallo da campionare senza accendere il laser. </li><li> Eseguire Raman campionamento 18,19 con intensità laser tra 2,4-3,1 mW con una durata complessiva inferiore a 20 secondi per prevenire danni al campione con un obiettivo di ingrandimento di 10X. Acquisire spettri Raman per campioni dai disegni 1, 2 e 3 utilizzando lunghezze d&#39;onda di eccitazione, come indicato nella tabella 1. Acquisire anche spettri Raman di controllo per soluzioni di proteina A, GBP, e D-glucosio, e per polveri dopamina impiegando vetrini senza metallo nanostrutture come supporti per il confronto. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

SERS sta guadagnando il riconoscimento come una tecnica estremamente potente di bio-rilevamento che offre molti vantaggi unici. Il rapporto con le vibrazioni molecolari permette di individuare in modo selettivo &quot;impronte digitali&quot; di analiti specifici da spettri SERS, mentre la sensibilità estremamente elevata rende possibile rilevare piccole quantità di analita 9,10,11,35. Inoltre, SERS è una tecnica non distruttiva che è anche relativamente insensibile all&#39;acqua, e quindi è molto adatto per sondare materiali biologici nel loro ambiente acquoso naturale 9. I risultati presentati sottolineano questi vantaggi e dimostrano come ulteriore forte potenziale di SERS come tecnica senza etichetta molto flessibile di bio-rilevamento. In tre disegni che impiegano monostrati di diverse biomolecole substrato-immobilizzato, i modi Raman sono stati rilevati che potrebbero essere tranquillamente attribuito alle analiti particolari. Che il rilevamento di queste biomolecole, or rispettivi ligandi, è stato dimostrato utilizzando superfici piane di silice fusa come il supporto per substrati SERS, rende i disegni compatibili con l&#39;elettronica e le impostazioni correnti microfluidica, promettendo numerose applicazioni in relazione con architetture bio-elettronico interfacciamento materiali biologici con superfici di elettronica emergente e dispositivi elettrochimici 2,3. È importante sottolineare che, in due dei tre disegni è stata dimostrata per rilevamento SERS legame specifico di piccole molecole, quali glucosio e dopamina, impiegando monostrati della proteina superficie immobilizzato e aptamer, rispettivamente, come gli elementi di riconoscimento. Tuttavia, diversi aspetti devono essere curati per ottenere un efficiente SERS bio-rilevamento nell&#39;impostazione &quot;on-chip&quot;. Prima di tutto, una sfida ben noto che è comune per la maggior parte biomolecole è la loro tendenza a degradare, in particolare quando esposto a condizioni non naturali come queto seccabiente o intensa luce laser. Durante il protocollo, abbiamo sottolineato l&#39;importanza di mantenere sempre i campioni bio-funzionalizzati immersi in soluzioni adeguate durante l&#39;intero esperimento, dalla preparazione dei campioni per l&#39;acquisizione degli spettri Raman. Per questi ultimi, una camera impermeabile personalizzato è stato progettato (Figura 7) per evitare l&#39;evaporazione del liquido durante le esposizioni laser. La durata dell&#39;esposizione e l&#39;intensità del laser deve essere limitato, come descritto al punto 5.3 del protocollo per evitare danni dei campioni. I risultati del rilevamento SERS si trovano sensibili alla geometria del substrato impiegato, ed in particolare la separazione tra funzione delle nanostrutture metalliche. Come risulta dalle figure 8 e 9, l&#39;intensità SERS di design 1 campioni dipende fortemente dalla larghezza delle fessure tra Au nano-puntini su silice fusa. Fuori di tre matrici di Au nanodots testati in questo motivo (Figura 8), l&#39;intensità Raman massima si ottiene con Array I, che ha le lacune stretto tra le caratteristiche Au e quindi fornisce più efficiente amplificazione di campo elettromagnetico. Come mostra la Figura 9 illustra, è richiesto il controllo di inter-funzionalità separazioni a livello di 10-20 nm o meno. Impiegando EBL per la fabbricazione di substrati SERS, come dimostrato qui, offre una risoluzione efficace specifico per il controllo delle larghezze di inter-funzione lacune. Con un EBL positiva tono resistere come PMMA, la dimensione dei fori in maschere PMMA può essere variata semplicemente cambiando le dosi di esposizione. Dopo lift-off questo si traduce in diverse dimensioni di punti in metallo, e la larghezza delle fessure tra i punti può essere sintonizzato come desiderato selezionando corretta esposizione EBL dosi 18. L&#39;altra sfida è l&#39;ottimizzazione della geometria del substrato SERS per applicazioni bio-rilevamento specifico. Sebbene l&#39;effetto di miglioramento increases con una riduzione delle inter-funzione lacune, le dimensioni relativamente grandi di molecole biologiche impone limitazioni alla stretta le lacune possono essere. Questo è evidente dai risultati per Design 2, in cui il metodo di immobilizzazione è tale che la proteina si lega efficacemente solo alla superficie tra punti di metalli nobili, ma non per i punti stessi (vedere Figura 3B). Come risulta dalla figura 10, gli spettri SERS per i rilievi di Ag non strutturati non mostrano alcun band da analizzare. Anche se le pastiglie presentano una struttura nano-cristallino con molto sottili fessure tra le isole (vedi Figura 6F) queste lacune sono troppo strette per ospitare una molecola proteica. Ancora è aggiunto un&#39;altra dimensione di complessità quando hanno proteina-ligando vincolante da rilevare. In Figura 10, le bande SERS CH sono più pronunciati negli spettri dal ligando legato GBP rispetto a quello libero-ligando, che può essere ipoteticamente spiegato da un cambiamento nella conformazione GBPdopo il legame di D-glucosio 2 7,27, risultante in una struttura più rigida con maggiore attività Raman. Se si confrontano i due substrati nanostrutturati, la banda CH da proteine ​​senza ligando è più forte in SERS spettri ottenuti con il substrato nano-punti, considerando che sia le proteine ​​e di glucosio CH bande di proteina legante legato sono più marcate con le nano-esagoni substrato. Due fattori dovrebbero portare in queste differenze, la disponibilità di spazio tra Ag presenta cui il GBP potrebbe legarsi a Ni, e la suscettibilità della proteina libera ligando legato e ligando alla valorizzazione elettromagnetica del scattering Raman in &quot;punti caldi&quot; tra queste caratteristiche. Da un lato, il modello nano-puntini offre una maggiore superficie relativamente inter-caratteristica in cui il rivestimento Ni è disponibile per la proteina di legarsi, che può spiegare una banda CH più pronunciato osservati senza glucosio GBP su Ag nano-dots substrato. D&#39;altra parte, a causa loro strut non uniformeture (vedi Figura 6D), Ag nano-esagoni potrebbe essere inclini a mostrare un miglioramento elettromagnetica forte in spazi stretti tra le isole AG entro nano-esagoni conseguente forti bande vibrazioni CH di glucosio-bound GBP sul substrato nano-esagoni. Alcuni dettagli di questo gioco richiedono ulteriori verifiche, e l&#39;ottimizzazione di substrati SERS per analiti complessi che coinvolgono grandi proteine, come il GBP è ancora in cantiere. Chiaramente, SERS rilevamento di legare biomolecole immobilizzate impiegando come elemento di riconoscimento ligando è facilitato quando soltanto il ligando è Raman attiva in una regione selezionata, mentre gli altri componenti non sono. Questo è il caso di Design 3, in cui sono ottenuti SERS pronunciati bande di dopamina aptamer-bound (Figura 11). La coppia aptamer-dopamina presenta eccellente specificità e lo spettro SERS comprende bande pronunciati, senza alcun significativo segnale di fondo. <p class="jove_content"&gt; Avanzamento futuro della tecnologia SERS etichetta-tassa comporterebbe numerose prove di SERS valorizzazione segnale biomolecole &#39;con una vasta gamma di diversi disegni nanostrutture di superficie. L&#39;utilizzo di scrittura diretta litografia a fascio elettronico per fabbricare varie nanostrutture con una superba livello di controllo sulle dimensioni, la forma, e la separazione tra funzione, in combinazione con i protocolli di preparazione del campione qui presentati, faciliterebbe il confronto e la convalida incrociata dei risultati ottenuti da diversi gruppi di ricerca. Ciò affrontare la grande sfida della riproducibilità quando SERS substrati sono fabbricati impiegando alternativa &quot;bottom up&quot; metodi 11,12,13, consentendo un migliore controllo della dimensione di nanostrutture in metallo e la posizione verso una identificazione certa del design ottimale substrato per una vasta gamma di applicazioni. Scalabilità di queste tecniche può successivamente essere migliorata combinando EBL con metodi nanolitografia complementari come nanoimpressione litografica 19 verso il futuro la produzione di massa di disegni nanoscala ottimizzato impiegando le tecniche di EBL sintonizzabili.

Capacità di sviluppare e caratterizzare i sistemi nano-biologici coniugati interfacciamento nanostrutture solide e polimeri biologici stanno diventando sempre più importanti per ulteriori progressi nella prossima generazione di bio-sensing e bio-tecnologie di azionamento 1,2. Si tratta di studi multidisciplinari in una serie di campi di ricerca, come ad esempio la fabbricazione di componenti pertinenti a stato solido (elettrodi-micro o nano, rivestimenti nano-ingegneria, nanofili, o nanoparticelle) 2,3,4; immobilizzazione di biomolecole sulle superfici per creare bioconiugati desiderati 5,6,7; e monitoraggio interfacce nano-biologica 1. Nella maggior parte dei casi, la scelta di fabbricazione ottimale, bio-funzionalizzazione, e metodi di caratterizzazione fortemente correlati tra loro. Chiaramente, la scelta delle tecniche di nanofabbricazione dovrebbe essere guidato dai requisiti dei componenti allo stato solido del sistema, essendo fortemente dipendente dal metodo di rilevazione, che a turn è determinata dalla natura dei biopolimeri coinvolti e allo scopo di monitorare l&#39;interfaccia. Su una grande varietà di tecniche applicate per caratterizzare sistemi bioconiugati 1,3, spettroscopia Raman superficie maggiore (SERS) è emerso come un metodo promettente per la rivelazione di specie chimiche e biologiche su superfici 8,9,10,11. SERS impiega scattering anelastico di luce monocromatica da biomolecole-superficie immobilizzato (Figura 1) che consentono la cattura di firme uniche corrispondenti a vibrazioni molecolari. Questa capacità di distinguere tra le diverse molecole senza coinvolgere etichette, chimica complessa, o passi in termini di tempo, fa SERS un metodo potenzialmente molto efficace di bio-rilevamento. Un altro importante vantaggio della SERS è l&#39;elevata sensibilità. L&#39;eccitazione di plasmoni di superficie localizzate dalla luce interagendo con nanostrutture di metalli nobili (substrati SERS) aumenta notevolmente il intensità di scattering Raman per l&#39;analita, consentendo il rilevamento di piccole quantità di molecole, da monostrati fino al limite singola molecola 8,9,10,11. Infine, la maggior parte delle biomolecole richiedono soluzioni acquose stabili. Poiché l&#39;acqua ha spesso un&#39;attività Raman limitato, segnale di fondo da campioni acquosi è ridotto al minimo 9. Applicazioni di SERS hanno mostrato una crescita esponenziale negli ultimi dieci anni 10. Tuttavia, una sfida molto discusso di SERS è che la valorizzazione elettromagnetica dello scattering Raman dipende in modo critico dalla dimensione, la forma e la spaziatura delle nanostrutture metalliche dove le onde plasmoniche sono indotti 11,12,13. Per raggiungere SERS efficienti e riproducibili misurazioni, controllare la geometria sopra substrato è necessaria ai dimensioni nanometriche. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig1.jpg" /> Figura 1. Sceme della spettroscopia Raman superficie maggiore. Numerosi metodi utilizzati per fabbricare substrati SERS 11,12,13 possono essere suddivisi in metodi bottom-up e top-down. Metodi del primo tipo impiegano vari processi di auto-assemblaggio o sintesi chimica diretta per produrre nanostrutture. Spesso affrontati esempi includono l&#39;immobilizzazione di nanoparticelle monodisperse su supporti solidi 11,12,13, termico, polverizzazione catodica, o alla deposizione elettrochimica di film metallici ruvide 11,12, e vari metodi di sintesi chimiche 13. Sebbene tali tecniche tendono ad essere relativamente semplice e poco costoso, molti dei quali si trovano innanzi una mancanza di controllo sulla posizione delle strutture, e limitata riproducibilità del campione a campione. Al contrario, le tecniche di litografia top-down impiegano strumenti manipolabili come fasci di particelle per creare modelli desiderati sulle superfici. Uno dei più spesso utilizzatometodi di nanolitografia, litografia a fascio di elettroni (EBL), offre un controllo superbo su caratteristiche al di sotto del 10 nm e anche una flessibilità per consentire diversi disegni di substrato su supporti solidi 11,12. In EBL, un fascio di elettroni concentrata fino a un punto di pochi nanometri in diametro scansioni su una superficie di un materiale sensibile elettroni (resistere) causando un cambiamento chimico in regioni esposte. Per tono positivo resiste come polimetilmetacrilato (PMMA), elettroni risultati esposizione fascio di scissione delle catene polimeriche che compongono il resistere, portando ad un aumento della solubilità in un solvente appropriato (sviluppatore). Il processo di litografia a fascio elettronico comprende spin-coating di uno strato uniforme di resist su un substrato; esposizione del materiale resistivo mirata in una camera a vuoto con un fascio di elettroni; e sviluppo del campione per rimuovere le regioni solubili. Supporti dielettrici sotto nanostrutture metalliche, come la silice fusa, hanno been dimostrato di aumentare in modo significativo le intensità di SERS a causa di localizzazione delle onde plasmoniche rispetto ad altri materiali come il silicio 14,15. Tuttavia patterning EBL su substrati dielettrici, soprattutto su scala nanometrica, comporta sfide significative a causa di accumulo di carica durante l&#39;esposizione. In precedenza, abbiamo dimostrato 16,17 che queste difficoltà possono essere superate mettendo strati di polimeri conduttivi sopra resist. Figura 2 mostra uno schema del processo complessivo di fabbricazione mediante esposizione EBL e sviluppo seguita dalla deposizione di metallo e decollo per produrre nanostrutture metallici su fusa supporti di silice. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig2.jpg" /> Figura 2. Schema di eLectron litografia a fascio, deposizione del metallo, e il processo di decollo misure impiegate per fabbricare nanostrutture metalliche su substrati dielettrici 16-19. In questo articolo, vi presentiamo l&#39;intera sequenza delle fasi del processo che coinvolgono SERS substrati fabbricazione da EBL, bio-funzionalizzazione dei substrati, e raccolta degli spettri Raman. Tre disegni esplorati nelle nostre opere recenti 18,19 vengono affrontati (vedi figure 3 e 4, e Tabella 1). In Design 1, proteina ricombinante A è immobilizzato su bio-funzionalizzati Au nanostrutture su silice fusa (FS) di supporto 18, e il rilevamento SERS della proteina è dimostrata. In Design 2, ricombinante glucosio-binding protein 21,26,27 con e senza il ligando (D-glucosio) è immobilizzato tramite variabili istidina in spazi tra nanostrutture Ag su FS Ni-rivestiti, e il legame del glucosio alla proteina viene rilevato. In Design 3, tiolati-dopamina vincolante DNUn aptamero 19,23 è immobilizzato su Au nanostrutture su FS, e il legame di dopamina da aptamer immobilizzato è dimostrata. Comprensivo di tutte le fasi sperimentali pertinenti dalla preparazione del substrato di Raman acquisizione spettri, e rappresentante di diverse biomolecole e strategie di immobilizzazione, questi esempi sono utili per una vasta gamma di applicazioni, dalla ricerca di esplorazione interrogare interfacce nano-biologico SERS allo sviluppo della SERS biosensori di piccole molecole che impiegano proteica o vincolante come metodo di riconoscimento aptamer-ligando. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig3.jpg" /> Figura 3. Schemi di tre modelli rappresentativi utilizzando differenti biomolecole, metodi di immobilizazione, e substrato materiali: (A) la proteina A immobilizzata sulla nobile metallo nano-dots funzionalizzati da un monostrato auto-assemblato (SAM) di acido 11-mercaptodecanoic (MUA) in acqua deionizzata; (B), istidina-marcato glucosio binding protein (GBP) complessato con D-glucosio immobilizzato sulla superficie del substrato tra metallo nobile nano-punti; (C) tiolo-terminato vincolante dopamina aptamer completato con dopamina (DBA) immobilizzato sulla nobile metallo nano-punti. Vedi ulteriori dettagli nella tabella 1. In Design 2 illustrato da pannello (B), un campione senza la corrispondente ligando è stato preparato anche per il confronto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig4.jpg" /> Figura 4.Biomolecole impiegati in tre disegni: (A) la proteina A; (B) proteina legante il glucosio e D-glucosio; (C) vincolante aptamer DNA e dopamina dopamina. Le strutture terziarie di proteine ​​in (a) e (b) sono presi da Protein Data Bank, PDB ID 1BDD 20 e 2HPH 21, rispettivamente, e disegnato con VMD per LINUXAMD64, la versione 1.9.1 22. La struttura secondaria aptamer in (c) è previsto dalla sequenza 23 utilizzando il software ValFold 24 e disegnata con PseudoViewer 3.0 25. Le lettere G, A, T, C e corrispondono a guanina, adenina, timina, citosina e nucleotidi, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" fo:keep-together.within-page="always" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> Disegno 1 </td&gt; <td> Design 2 </td><td> Design 3 </td></tr><tr><td> Biopolimero </td><td> Proteina A </td><td> Glucosio binding protein (GBP) </td><td> Dopamina aptamero vincolante (DBA) </td></tr><tr><td> Legante </td><td> L&#39;acido 11-Mercaptoundecanoic (MUA) monostrato auto-assemblati (SAM) </td><td> Tags istidina </td><td> Linkers tiolo </td></tr><tr><td> Ligand </td><td> Nessuno </td><td> D-glucosio </td><td> Dopamine </td></tr><tr><td> Soluzione </td><td> Deionizzata (DI) </td><td> Tampone fosfato di potassio </td><td> Tris (idrossimetil) aminometano (TRIS) e acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) tampone; Fosfato salina tamponata (PBS) </td></tr><tr><td> Substrato </td><td> Strutture Au su FS </td><td> Strutture Ag su FS Ni rivestite </td><td> Strutture Au su FS </td></tr><tr><td> Ar PatternedEA </td><td> 4 micron x 10 micron </td><td> 4 micron x 8 micron </td><td> 4 micron x 10 micron </td></tr><tr><td rowspan="3"> Modello </td><td rowspan="3"> Au punti, 50 nm passo </td><td> Puntini Ag, 40 nm passo </td><td> Esagoni Au, passo 200 nm </td></tr><tr><td> Esagoni Ag, passo 200 nm </td><td> Au pastiglie non strutturati </td></tr><tr><td> Ag pastiglie non strutturati </td><td></td></tr><tr><td rowspan="4"> Dosi di esposizione EBL </td><td> Dots: </td><td> Dots: 105 uC / cm 2 </td><td rowspan="4"> Esagoni: 180 uC / cm 2 </td></tr><tr><td> Array I 120 uC / cm 2 </td><td> Esagoni: 170 uC / cm 2 </td></tr><tr><td> Array II 96 uC / cm 2 </td><td></td></tr><tr><td> Array III 72uC / cm 2 </td><td></td></tr><tr><td> Laser di eccitazione lunghezza d&#39;onda </td><td> 532 nm </td><td> 532 nm </td><td> 780 nm </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Tre progetti dei sistemi nano-biologici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>11-Mercaptoundecanoic acid (MUA)</td>
			<td>Sigma Aldrich 
			 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.sigmaalrich.com">(www.sigmaalrich.com)</a></td>
			<td>450561&#160; ALDRICH</td>
			<td>Used for surface functionalization in Design 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conductive polymer&#160;</td>
			<td>Mitsubishi Rayon 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.mrc.co.jp">&#160;(www.mrc.co.jp)</a></td>
			<td>aquaSAVE-57xs</td>
			<td>A 70 nm thick&#160; layer is used as anti-charging coating for EBL exposures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Collaborator Lab.</td>
			<td></td>
			<td>Ligand in Design 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine</td>
			<td>Collaborator Lab.</td>
			<td></td>
			<td>Ligand in Design 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dopamine binding aptamer (DBA)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies Inc. 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.idtdna.com">(www.idtdna.com)</a></td>
			<td>5&#39;- /Thiol Modifier C6 S-S/&#160;AAAAAAAAAA GTCTCTGTGT GCGCCAGAGA ACACTGGGGC AGATATGGGC CAGCACAGAA TGAGGCCC-3&#39;&#160;</td>
			<td>Biopolymer in Design 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica wafers</td>
			<td>Mark Optics 
			<a href="http://www.markoptics.com/">www.markoptics.com</a></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose binding protein (GBP)</td>
			<td>Collaborator Lab. 
			<a href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi%7C145579532">(www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/gi|145579532)</a></td>
			<td>PDB ID 2HPH</td>
			<td>Biopolymer in Design 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum grease</td>
			<td>Dow Corning 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.dowcorning.com">(www.dowcorning.com)</a></td>
			<td></td>
			<td>Used to seal water-proof chamber, step 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%, H2O2</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td></td>
			<td>Used for pirahna solution, step 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-ethyl-N&#39;-(3-(dimethylamino) propyl) carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Sigma Aldrich 
			<a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td>
			<td>03450 FLUKA</td>
			<td>Used for immobilization of biopolymer in Design 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Sigma Aldrich 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.sigmaaldrich.com">(www.sigmaaldrich.com)</a></td>
			<td>130672 ALDRICH</td>
			<td>Used for immobilization of biopolymer in Design 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate buffer</td>
			<td>Collaborator Lab.</td>
			<td></td>
			<td>Buffer used in Raman sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered&#160;</td>
			<td>Collaborator Lab.</td>
			<td></td>
			<td>Solvent in Design 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymethylmethacrylate (PMMA) 950 A2</td>
			<td>MicroChem&#160; 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.microchem.com">(www.microchem.com)</a></td>
			<td></td>
			<td>A 90 nm thick layer is used as EBL positive tone resist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant protein A</td>
			<td>Protein Mods Inc 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.proteinmods.com">(www.proteinmods.com)</a></td>
			<td>PDB ID 1BDD 
			<a href="http://%28www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd">(www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1bdd)</a></td>
			<td>Biopolymer in Design 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid 96%, H2SO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td></td>
			<td>Used for pirahna solution, step 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.sigmaaldrich.com">(www.sigmaaldrich.com)</a></td>
			<td>T9285 SIGMA</td>
			<td>Buffer in Design 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicing saw</td>
			<td>Diamond Touch Technology Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Used to cut FS wafer, step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>(17301 W Colfax Ave # 152, Golden, CO)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Kurt J. Lesker 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.lesker.com">(www.lesker.com)</a></td>
			<td></td>
			<td>Used for Au and Ag evaporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron beam evaporator</td>
			<td>Johnsen Ultravac (JUV) 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.ultrahivac.com">(www.ultrahivac.com)</a></td>
			<td>JuV E-gun</td>
			<td>Used for Ni evaporation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slips (25 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.fishersci.ca">(www.fishersci.ca)</a></td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>Used in water-proof chamber, step 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (3&#215;1 in.)</td>
			<td>Fisher Scientific 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.fishersci.ca">(www.fishersci.ca)</a></td>
			<td></td>
			<td>Used in water-proof chamber, step 5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raith 150TWO EBL exposure system</td>
			<td>Raith Inc. 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.raith.com">(www.raith.com)</a></td>
			<td>Raith 150TWO&#160; system</td>
			<td>Used for EBL exposures, step 2.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raman microscope</td>
			<td>Thermo Scientific 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.thermoscientific.com">(www.thermoscientific.com)</a></td>
			<td>Nicolet Almega XR</td>
			<td>Used for Raman spectroscopy, step 5.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator system</td>
			<td>Branson 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.bransonic.com">(www.bransonic.com)</a></td>
			<td></td>
			<td>Used for liftoff and solutions mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinner</td>
			<td>Brewer Spinner and Hotplate 
			<a href="file:///C:/Documents%20and%20Settings/i/Local%20Settings/Temp/www.brewerscience.com">(www.brewerscience.com)</a></td>
			<td><a name="RANGE!C18">Cee 200X and Cee 1300X</a></td>
			<td>Used to spin-coat PMMA and conductive polymer, step 2.1&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface enhanced raman spectroscopy detection of biomolecules using ebl fabricated nanostructured substrates

Si riporta Fabbricazione e caratterizzazione di sistemi nano-biologici coniugati interfacciamento nanostrutture metalliche su supporti solidi con biomolecole immobilizzate. L&#39;intera sequenza di rilevanti operazioni sperimentali è descritto, che coinvolge la fabbricazione di substrati nanostrutturati con litografia a fascio elettronico, l&#39;immobilizzazione di biomolecole su substrati, e la loro caratterizzazione utilizzando superficie maggiore spettroscopia Raman (SERS). Tre diversi disegni di sistemi nano-biologici sono impiegati, tra cui la proteina A, il glucosio proteina legante, e un aptamer legame al DNA dopamina. Negli ultimi due casi, il legame di rispettivi ligandi, D-glucosio e dopamina, è anche incluso. I tre tipi di biomolecole sono immobilizzati su substrati nanostrutturati con metodi diversi, ei risultati dell&#39;imaging SERS presentate. Le capacità di SERS per rilevare modalità vibrazionali dalle proteine ​​superficiali immobilizzato, nonché per catturare l&#39;una proteina-ligandod aptamer-ligando sono dimostrati. I risultati illustrano anche l&#39;influenza della geometria superficiale nanostruttura, biomolecole strategia di immobilizzazione, attività Raman delle molecole e la presenza o assenza di legame sulla spettri SERS acquisita ligando.

Raccolta di controllo spettri Raman dei componenti principali, comprese proteine ​​libere in soluzione e leganti liberi in soluzione o in polvere senza utilizzare substrati contenenti metalli, è importante per consentire un corretto confronto e per scopi di interpretazione. Figura 5A presenta un tipico Raman spettro per le proteine ​​gratis A in acqua deionizzata su un vetrino, senza supporti nanostrutturati. Due bande con l&#39;intensità Raman più alto, la banda a 2.931 centimetri -1 ea 1.091 centimetri -1, corrispondono alle vibrazioni che coinvolgono legami CH e CS, rispettivamente. Altre band con una minore intensità Raman come 563 centimetri -1, 1.450 centimetri -1, 1.653 centimetri -1 e 2.426 centimetri -1, può essere attribuito ad una sovrapposizione di modi di vibrazione 18,32,33,34. Controllo spettri Raman per il ligando GPB libera in soluzione tampone con tre differenti concentrazioni, 0,3, 0,9 e 1,3 mm, sono mostrati in Figura 5B. In t<html> egli figura, la banda larga circa 3.400 cm-1 corrisponde al solvente 35, mentre la banda a 2.935 centimetri -1 rappresenta vibrazioni che coinvolgono legami CH della proteina 32,33. Figura 5C mostra l&#39;elevata lunghezza d&#39;onda Raman spettro per D-glucosio in soluzione tampone per diverse concentrazioni: 1, 6, 100, 200, e 400 mM. Quando si aumenta la concentrazione di glucosio, bande legami CH vibrazioni nascono a 2.890 centimetri -1 e 2.960 centimetri -1. Controllo spettri Raman di dopamina in cristalli ottenuti con entrambe le lunghezze d&#39;onda di eccitazione 532 nm e 780 nm sono mostrati in Figura 5D. Gran parte dello spettro Raman viene dal benzenico flessione e tratti obbligazionari CH della molecola 19,36. Alcune delle bande a circa 3000 cm -1 sono osservati solo a 532 nm ma non di eccitazione 780 nm lunghezza d&#39;onda. PLOAD / 52712 / 52712fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Controllo Raman spettro di proteina A in acqua deionizzata ottenuta a 532 nm di lunghezza d&#39;onda di eccitazione 18 (A); Spettri Raman di glucosio proteina legante senza ligando in soluzione tampone ottenuta a 532 nm di lunghezza d&#39;onda di eccitazione (B); Spettri Raman di D-glucosio in soluzione tampone ottenuta a 532 nm di lunghezza d&#39;onda di eccitazione (C); e spettri di polvere ottenuta dopamina a 532 nm e 780 nm lunghezza d&#39;onda di eccitazione 19 (D). Tutti gli spettri sono regolarmente spettri Raman di soluzioni (a, b, c) e polvere (d) su vetrini senza substrati nanostrutturati. In (D), l&#39;assegnazione di Raman regimi passaggio a diverse vibrazioni molecolari è stato fatto utilizzando Generale atomica e molecolare elettronica Sistema Structure (GAMESS) 30 e software MacMolPlt 31 come descritto altrove 19. Pannello Ristampato (a) con il permesso di 18 Americuna società di vuoto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Per ottenere spettri SERS per biomolecole superficiali immobilizzato, substrati comprendenti nanostrutture metalliche su supporti silice fusa sono fabbricati come descritto ai punti 1-3. La qualità di substrati fabbricati è controllata mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). Le procedure SEM standard sono descritte altrove 16,17,18, 19 e non inclusi nel presente protocollo. La figura 6 mostra immagini rappresentative SEM di Au e Ag nano-punti e nano-esagonale come strutture (pannelli ad), così come non -structured Au e Ag pastiglie (pannelli E e F, rispettivamente). Le prossime tappe prevedono l&#39;immobilizzazione di materiale biologico sui substrati nanostrutturati impiegano tre disegni di cui alla tabella 1, e l&#39;acquisizione di loro spettri SERS. In o<html> rder per mantenere un ambiente acquoso durante l&#39;imaging Raman, ciascun campione è posto nella soluzione corrispondente (vedere Tabella 1), ricoperto con una copertura in vetro sottile, e sigillato, come illustrato nella Figura 7. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig6.jpg" /> Figura 6. Microscopio elettronico a scansione (SEM) le immagini di 10 di spessore Au e Ag nanostrutture superficiali nm impiegati come substrati SERS: (A, B) array di nanodots; (C, D) array di nano-esagoni; (E, F) pastiglie non strutturati. Substrati con strutture Au (a sinistra) impiegano supporti FS, mentre sottofondi con strutture Ag (a destra) utilizzano un rivestimento 10 nm di spessore Ni sul FS. Le immagini sono state ottenute come descritto altrove 16,17,18.pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig7.jpg" /> Figura 7. Schema della camera a prova di acqua per l&#39;imaging Raman di campioni bio-funzionalizzate in soluzione. In Design 1, la proteina ricombinante A è immobilizzato su substrati funzionalizzati da un monostrato auto-assemblato di 11-mercaptodecanoic acido (MUA) in acqua deionizzata 18. I substrati in questo disegno comprendono tre matrici di Au punti con un passo di 50 nm e distanze variabili inter-dot su silice fusa (vedi figure 6A e 8). Il processo di proteine ​​immobilizzazione inizia con la formazione di un SAM sui substrati. Per ottenere vincolante tra il SAM e la proteina covalente, i gruppi acidi carbossilici di SAM vengono trasformati in ammina reattiva NHS-estere mediante trattamento con una miscela di N </em&gt; -ethyl- N &#39;- (3- (dimetilammino) propil) carbodiimide (EDC) Soluzione N -hydroxysuccinimide (NHS) in acqua deionizzata e soluzione. Immobilizzazione di proteina A avviene mediante spostamento del gruppo NHS da residui di lisina della proteina 37. Un esempio di campioni di imaging per Design 1 con proteina A immobilizzata su Au nanostrutture è mostrato nella Figura 9. Figura 9A presenta un&#39;immagine al microscopio ottico dei campioni, che comprendono tre matrici di bio-funzionalizzati Au nanodots con differenti gap inter-dot (vedi anche le figure 3AA e 8), e la Figura 9B mostra la mappatura spettrale Raman su queste matrici. Si può notare che i più alti intensità Raman si riscontrano per Array I se le lacune tra punti sono il più stretto, mentre le intensità inferiori sono ottenuti per Array III con i più ampi divari tra punti. Questo può essere spiegato con un effetto di accoppiamento plasmon forte prodotta da maggiori fie elettricoLDS negli spazi ristretti tra i punti 18. Figura 9C mostra la forte spettri SERS ottenuto per Arrays I e II. Gli spettri presentano diverse bande (1.630 centimetri -1, 1.964 centimetri -1, 2.280 centimetri -1, 2.577 centimetri -1, e 2.916 centimetri -1) in prossimità dei modi Raman di proteine ​​libero A in soluzione visto in Figura 5A. Attribuibile a vibrazioni di varie obbligazioni presenti in proteine, queste bande o appaiono in luoghi simili in entrambi proteina immobilizzata e in soluzione, o sono leggermente spostati a numeri d&#39;onda leggermente più alte quando immobilizzato. Al contrario, SERS spettri di substrati nanostrutturati simili funzionalizzata da MUA SAM senza la proteina mostrano un modello completamente diverso 18, confermando che la figura 9 rappresenta la mappatura SERS di superficie immobilizzato proteina A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per visualizzare un</a><html> grande versione di questa figura. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52712/52712fig8.jpg" /> Figura 8. immagini SEM di tre matrici di Au nanodots su substrato FS utilizzati in Design 1 18. Gli array hanno lo stesso passo di 50 nm e leggermente diversi raggi dot causando diverse larghezze di gap inter-dot. Ciò viene ottenuto applicando differenti dosi di esposizione EBL per produrre maschere PMMA per le tre matrici (vedi Tabella 1). Dosi di esposizione più alti producono ampi fori in maschere in PMMA, consentendo di dimensioni maggiori punti Au dopo metallizzazione e decollo. Ristampato con il permesso di 18 società Vacuum americano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig8large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> les / ftp_upload / 52712 / 52712fig9.jpg &quot;/&gt; Figura 9. SERS immagini di substrato-immobilizzato proteina A in Design 1 18. (A) immagine ottico microscopio del campione, costituito da tre matrici di Au nanodots con passo 50 nm e diverse lacune tra punti su un substrato di silice fusa (vedi anche Figura 6), bio-funzionalizzati come mostrato nella Figura 3A. (B) mappatura Raman del campione. (C) SERS spettri Array dot I e II. Nel grafico (B), l&#39;asse verticale rappresenta la distanza attraverso il substrato, l&#39;asse orizzontale rappresenta lo spostamento Raman, e la legenda barra indica le intensità Raman. Vertical linee tratteggiate in pannelli (B) e (C) rappresentano bande Raman benchmark di proteine ​​libero A in soluzione e (*) a pannello (C) indica bande SERS da Array I. Il Raman spettri sono stati ottenuti 532 nm di eccitazionelunghezza d&#39;onda. Ristampato con il permesso di 18 società Vacuum americano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig9large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> In Design 2, glucosio ricombinante proteina legante (GBP) 21 complessato con D-glucosio (ligando) viene immobilizzato su substrati appropriati in soluzione tampone fosfato di potassio. I campioni con immobilizzato GBP senza leganti sono anche preparati per il confronto. In questo disegno, la proteina di legame-glucosio è collegata alla superficie mediante una variabile istidina, che si lega bene a Ni ma non ai metalli nobili 6. Dal momento che i substrati comprendono matrici di Ag nano-dots, nano-esagoni, e pastiglie Ag non strutturati su FS Ni-rivestite (figure 6B, 6D, e 6F, rispettivamente), ci si può aspettare più di molecole proteiche immobilizzati per essere collocata in spazi tra Ag nanostrutture dove rivestimento Ni è available. Gli spettri Raman ottenuto per immobilizzato senza glucosio e glucosio-bound GBP sono mostrati nelle Figure 10A e 10B, rispettivamente. Tutti questi spettri mostrano una larga banda a circa 3300 cm-1, che corrisponde alla soluzione tampone 35. Gli spettri ottenuti con un rilievo strutturato Ag contiene solo questa singola band e non mostrano modi di vibrazione delle proteine, che conferma che la proteina immobilizzata non si trova sulla superficie Ag come previsto. Al contrario, gli spettri ottenuti con array di Ag nano-punti e bande mostrano nano-esagoni intorno 1.550 centimetri -1 e 2.900 cm -1, che rappresentano il 32,33 analita. In particolare, la banda larga circa 1.550 centimetri -1, nota come banda amide II, è attribuibile al peptide obbligazioni vibrazioni nelle proteine ​​33,34. Nel caso in esame, questa banda rappresenta una sovrapposizione dei modi di vibrazione da GBP immobilizzati sulla superficie Ni tra funzionalità Ags, e è indicativo di valorizzazione SERS di queste modalità in prossimità di nanostrutture di metalli nobili quando si utilizzano i substrati contenenti nano-punti o nano-esagoni. Questa banda è molto debole per la proteina in soluzione in assenza di enhancement SERS (Figura 5B) e assente pastiglie Ag senza Ni superficie disponibile per il legame della proteina, ma è ben pronunciata per substrati nanostrutturati con qualche superficie Ni accessibili per la proteina per legare. Tuttavia, ancora più importante per il presente studio sono le altre, le bande più strette intorno a circa 2.900 centimetri -1 che possono essere attribuiti al legame CH wibrations 32,33. Lo spettro di GBP privo di glucosio mostra una banda pronunciato a 2.933 centimetri -1 con il substrato nano-puntini, e una banda debole ma percepibile alla lunghezza d&#39;onda simile con il substrato nano-esagoni (Figura 10A). Distinto dal caso di proteine ​​libera glucosio, gli spettri SERS di GBP glucosio-bound mostrato in Figu<html> ri 10B mostra due bande corrispondenti a CH obbligazioni vibrazioni regimi, a 2.850 centimetri -1 e 2.910 centimetri -1. Le bande sono ben pronunciate nello spettro di glucosio-bound GBP su substrato nano-esagoni, e possono anche essere viste nello spettro di GBP su nano-dots substrato. La banda a 2.850 centimetri -1 è ragionevolmente vicino ai 2.890 centimetri -1 uno nello spettro Raman di controllo da D-glucosio in soluzione, e quindi può essere attribuito al glucosio legato alla proteina, mentre l&#39;altro gruppo (a 2910 centimetri -1) è attribuibile a vibrazioni obbligazioni CH sia della proteina e glucosio. Si può concludere che la differenza di firme da SERS senza glucosio e glucosio-bound substrato-immobilizzato GBP è osservabile in questa regione, e le vibrazioni obbligazionari CH di glucosio legato alle proteine ​​sono rilevabili utilizzando il disegno descritto. 10.jpg &quot;/&gt; Figura 10. SERS spettri (A) senza legante e ligando-bound (B) la proteina-glucosio legante immobilizzato su tre diversi supporti in Design 2. Gli spettri sono stati ottenuti con 780 nm di eccitazione lunghezza d&#39;onda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig10large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> In Design 3, l&#39;aptamero vincolante dopamina personalizzato (DBA) con terminazione tiolo 23 è immobilizzato sul substrato in tris (idrossimetil) amminometano (TRIS) acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) soluzione tampone, e la dopamina viene quindi associata al aptamer immobilizzato 19. I substrati per questo disegno contengono array di Au nano-esagoni su FS (Figura 6c). Non strutturati Au pastiglie (Figura 6 sexies) sono utilizzati anche per fini di controllo. Dal momento che il DNA è intrinsecamente fluorescenti 38, 780 nm di eccitazione waveleng<html> th è utilizzato in Design 3 per ridurre questo fattore. In questo disegno, l&#39;elemento di rilevazione (aptameri) non è attiva Raman nella regione dei turni Raman considerati nella Figura 11, che mostra la dopamina una significativa attività Raman in questa regione. Poiché segnale da campioni esposti solo dopamina senza aptamer immobilizzato non mostra bande dopamina risultanti 19, le bande SERS osservati dovrebbero provenire da dopamina aptamer-bound. Figura 11 confronta gli spettri SERS di aptamero immobilizzato su nanostrutture oro prima e dopo l&#39;aggiunta di dopamina. Come previsto, immobilizzato aptamer senza dopamina non presenta bande Raman. Al contrario, un numero di bande Raman pronunciate si osservano per la dopamina legata aptamer immobilizzato. Le posizioni di maggior bande in Figura 11 sono vicine a quelle dopamina cristallina, sebbene con differenze di ampiezze. IGURA 11 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 52712 / 52712fig11.jpg &quot;/&gt; Figura 11. SERS spettri privi di legante (linea viola) e ligando-bound (linea blu), la dopamina vincolante aptamer immobilizzato su Au substrati nano-esagonali in Design 3 19. La linea rossa indica uno spettro di controllo SERS di polvere dopamina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52712/52712fig11large.jpg" target="_blank">Si prega clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Surface Enhanced Raman Spectroscopy Detection of Biomolecules Using EBL Fabricated Nanostructured Substrates

We describe the fabrication and characterization of nano-biological systems interfacing nanostructured substrates with immobilized proteins and aptamers. The relevant experimental steps involving lithographic fabrication of nanostructured substrates, bio-functionalization, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) characterization, are reported. SERS detection of surface-immobilized proteins, and probing of protein-ligand and aptamer-ligand binding is demonstrated.

Surface Enhanced Raman Spectroscopy Rilevamento di Biomolecole Utilizzando EBL manufatti nanostrutturati Substrati

Fabrication and characterization of conjugate nano-biological systems interfacing metallic nanostructures on solid supports with immobilized biomolecules ...

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20.1K Views.  University of Alberta. We describe the fabrication and characterization of nano-biological systems interfacing nanostructured substrates with immobilized proteins and aptamers. The relevant experimental steps involving lithographic fabrication of nanostructured substrates, bio-functionalization, and surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) characterization, are reported. SERS detection of surface-immobilized proteins, and probing of protein-ligand and aptamer-ligand binding is demonstrated. 