The authors acknowledge funding from the National Institutes of Health R21CA182333.

高分子水性二相系の調製（ATPS） <ol><li>ポリエチレングリコール（PEG）（MW：35000）を0.5g秤量し、水性PEG相（w / v）の5％を10ml調製するための無菌の15mlの円錐形に完全増殖培地9.5 mlに追加します。 注：最初のポリマーを添加した後、培地の残量が円錐形の壁へのポリマーの付着を最小限にし、ポリマーがより速く溶解するのに役立ち、続いて円錐形に培地の半分を加える。 </li><li>デキストラン（DEX）の0.128グラム（MW：500,000）計量し、12.8％（w / v）の水DEX相から1ミリリットルを準備し、滅菌1.5ミリリットルのマイクロチューブに完全増殖培地の0.872ミリリットルに追加します。 </li><li>約1分間ボルテックス両方のソリューションは、媒体中にポリマーを溶解した。 </li><li>溶解および均質の混合物を確保するために、1時間37℃の水浴中で両溶液を保つ。浴からの溶液の汚染の可能性を回避するために、水位上記キャップを保つ水。 </li><li>無菌のプラスチック製シリンジにPEG相溶液を充填し、不純物を除去するために0.2μmの孔径のシリンジフィルターを介して通過する。 注：、PEG溶液を注射器を埋める円錐管の上にフィルタの挿入に入れて力を利用して、ゆっくりとフィルターを通してソリューションを押してください。これは、シリンジプランジャの移動​​に対する抵抗を経験することは正常です。解決策のいくつかは、フィルタに残るようにポリマー溶液のマイナー損失が発生しますが、ポリマー濃度は変化しません。 </li><li>ピペット10 DEX相溶液μlの別のチューブに培地10μl中に希釈は、6.4％（w / v）のDEX相溶液を生じた。 PEG相溶液を吸引し、100μlのペトリ皿にそれを分配する。 <ol><li> PEG相溶液中にDEX相溶液（w / v）の6.4％の0.5μLを分注する。顕微鏡下で視覚的にDEXの低下を観察することによって成功したATPSの形成を確認。ドロップ境界二つの安定、独立した水相の存在を示す、表示されたままにする必要があります。 </li></ol></li><li>使用するまで4℃で株式水性PEGとDEX相溶液を保管してください。 注：これは、ポリマー溶液が各実験の前に新たに調製し、貯蔵の24時間以内に使用されていることをお勧めします。 </li></ol>印刷癌の細胞スフェロイド2.準備<ol><li> 90％-100％のコンフルエントな単層への関心（ 例えば、MDA-MB-157乳癌細胞）の癌細胞を成長させる。 MDA-MB-157細胞では、10％FBS、1％グルタミン、および1％抗生物質を含むDMEMから構成される培地を使用する。 <ol><li> （製造業者のプロトコルに従って）細胞解離緩衝液を用いて細胞を回収し、15mlのコニカルに懸濁液を読み込む。 、173.3×gで5分間、それを遠心上清を除去し、細胞を再懸濁する完全増殖培地の1ミリリットル中。 </li></ol></li><li>ロードセル血球計数器上に、それらをカウントは、必要な数を計算する所望のスフェロイドの細胞密度の細胞。 T75フラスコで成長させたMDA-MB-157細胞のコンフルエントな単層は、通常は〜7×10 6個の細胞を提供します。 注：単一のスフェロイドを生成する液滴体積に必要な細胞密度は、細胞型に依存する。例えば22、MDA-MB-157細胞について×10 4以上1.5の密度は、0.3μlのDEX相滴あたりの推奨されるシングル回転楕円体の形成を確実に。 </li><li> 173.3×gで5分間再度遠心し、細胞および所望の細胞密度に懸濁液を濃縮するために、増殖培地の適切な容量で再懸濁します。 注：7×10 6個の癌細胞を回収した場合は、0.3μlのDEX相ドロップ1.5×10 4個の細胞密度のスフェロイドを形成するのに必要な細胞懸濁液の全体積は140μlであろう。しかし起因する次のステップでDEX相溶液で希釈し、細胞のみを再懸濁し、細胞培養培地70μlのを使用しています。 </li><li&gt; 12.8％の等量（w / v）の水性DEX相溶液を1.2に調製し、得られた細胞懸濁液に加える。 1.5×10 4細胞密度スフェロイドの例については、DEX相溶液の70μlの細胞懸濁液70μlに添加される。 </li><li>完全に細胞およびDEX溶液の混合の均一な分布を確実にするために、細胞懸濁液を混合する。ピペット上下に気泡形成を防ぐために静かに行うべきである。 </li></ol>共培養スフェロイドの印刷用3.準備<ol><li> 90％-100％コンフルエント単層に癌細胞（ 例えば、MDA-MB-157ヒト乳癌細胞）および支持細胞（ 例えば、ヒト線維芽細胞）を成長させる。 （製造業者のプロトコルに従って）細胞解離緩衝液を使用して、各細胞型を回収する。 <ol><li>各円錐から173.3×gで、かつ吸引上清で5分間、それらを遠心分離、円錐形の15ミリリットルに各サスペンションをロードします。完全なGの1ミリリットル中の各円錐形の細胞を再懸濁rowth媒体。 注：そのようなカルセインAM（生細胞染色）および核染料（ヘキスト社）のような蛍光染料は、2つの細胞型を区別するために使用することができる。 </li></ol></li><li>血球計数器上に別々に各細胞型をロードし、共培養スフェロイドにおける支持細胞に対する癌細胞の所望の比率は、各細胞型の必要数を計算するためにそれらを数える。 T75フラスコ中で増殖させたMDA-MB-157細胞および線維芽細胞のコンフルエントな単層は、通常はそれぞれ、〜7×10 6と〜6×10 6個の細胞を与える。 </li><li> 2つの細胞型の数の所望の比を与えるために、癌細胞懸濁液に支持細胞の懸濁液から正確なボリュームを追加する。例えば、1線維芽細胞に50癌細胞の比率を使用。 </li><li>遠心増殖培地の等量を含む最終濃度をもたらすのに適切な容量及び12.8％（w / v）の水性DEXで173.3×gで再懸濁した細胞で5分間混合し、細胞懸濁液を含有するコ​​ニカル（1.2で調製）相溶液。 </li><li>穏やかに懸濁液の均一性を確実にするために上下に得られた細胞懸濁液をピペット。 </li></ol> 96ウェルプレート中に腫瘍スフェロイドの4.印刷<ol><li>前の24時間、37℃で1％の実験コート非処理、丸底96ウェルプレート（w / v）のプルロニックに一日。このコーティングは、培養期間中、細胞付着を防止する。 </li><li> 96ウェルプレート（宛先プレート）の各ウェル中に濾過し、5％を50μl（w / v）の水性PEG相を分注する。 </li><li>ピペットを用いて、細胞懸濁液（それぞれ、モノ - 及び共培養のためにステップ2またはステップ3で調製）を混合し、384ウェルプレートの1列（ソースプレート）からの他のすべてのサスペンションの20μlを添加する。 </li><li>液体ハンドラと &quot;ホーム&quot;の座標を登録するペッティングヘッドをオンにします。その後、実験器具を確実にするために（4.6未満）以前に定義されたプロトコルをコンパイルし、パラメータが正しい定義されていますLY。この「ホーミング」のステップは、異なる液体ハンドラの異なる場合があります。 注：4.6のステップ·バイ·ステップを以下に示したプロトコルの流れは、関係なく、使用されるロボット液体ハンドラの同様であろう。しかし、プログラミングインターフェースは、異なるソフトウェアの使用に異なって見える場合があります。 </li><li> 図1に示すように液体ハンドラーのワークステーション上で定義された位置に、ソースプレート、目的プレート、ピペットチップボックスを配置する。 </li><li>以下のステップを含むプロトコルを実行します。 <ol><li>ロードワークステーション（ 図1）からピペットチップ（8チップ）を混合液体ハンドラのピペット操作ヘッドから樽の1列。 </li><li>ソースプレートのウェル中の細胞懸濁液（ 図1）を混ぜる。気泡形成を回避するために、ウェル中の細胞懸濁液の体積よりも小さい混合容積を選択する。 </li><li>空の廃棄物のヒントボックス（ 図1）にヒントを取り出します。 </li&gt; <li>負荷10μL分注ピペットチップとピペット操作ヘッドから樽の1列（ 図1）。 </li><li>吸引し、各ピペットチップにソースプレートからの細胞懸濁液0.3μlの（ 図1）。 </li><li>目的プレート（ 図1）の1列のウェルに細胞懸濁液を分注する。 0.5mmのディスペンス高さより小さい1μlの/秒の分注流量を使用する。 </li><li>全体目的プレートに列ごとの印刷が完了するまで繰り返します4.6.6を通じて4.6.1を繰り返します。 </li></ol></li><li>注意深くステーション表面から目的プレートを除去し、CO 2を 37℃の湿潤インキュベーターに入れ、5％。細胞を含むDEX相滴の破砕を避けるために、培養器にそれを運ぶ際にプレートを水平に維持する。 </li><li> DEX相ドロップ内の回転楕円体への細胞の凝集を可能にするために24時間静置します。 </li></ol> &lt;Pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 5。癌細胞スフェロイドの薬物治療以下のプロトコルは、4日間の薬物治療のためであり、これは、他の治療期間のために修飾することができる2日後に新鮮な薬物との更新を含むことに留意されたい。 <ol><li>視覚的に24時間後に、96ウェルプレート中のスフェロイド形成を確認する。各スフェロイドの最小および最大径を平均することによりスフェロイドの大きさを測定するための、画像井戸を必要に応じて。 </li><li>所定の溶解度の濃度で製造業者によって推奨される溶媒に溶解して、所望の薬物のストック溶液を調製する。例えば、2mg / mlの水中でのシスプラチンを溶解する。 注意：薬剤が光に敏感である場合には光からの薬剤の原液を保護します。 </li><li>連続希釈法を使用して、前の工程で調製したストック溶液から細胞培養培地で希釈した薬物濃度を準備。各希釈は二回、所望の濃度なされるべきである。 DILution比は、出発ストック濃度および所望の使用濃度に依存して変化する。 </li><li>各ウェルに前工程で調製薬剤溶液50μlを追加します。これはロボットまたは手動ピペット操作によって行うことができます。 注：各薬物濃度を、各ウェルに既に50μlの水性PEG相によって所望の濃度に半分に希釈される。 <ol><li>各濃度について、96ウェルプレート（N = 16）の2つの列からのスフェロイドを使用してください。 </li><li>対照ウェルでは、水性のPEG相の既存の50μlに新鮮な培養培地のわずか50μlを添加する。 </li></ol></li><li>光から保護し、37℃で48時間、5％CO 2、薬物とスフェロイド培養する。 </li><li>インキュベーションの48時間後に、所望の濃度の薬剤の新鮮な希釈物を調製し、各ウェルに、新鮮な薬物溶液50μlを添加することにより薬物を更新する。 注意：ウェルは既に第一の薬剤tから所望の薬物濃度を含むreatment。希釈化は生じないので、したがって、この更新段階では、各濃度が所望の濃度で調製する​​。 </li><li>光から保護し、37℃でさらに48時間、薬物および5％CO 2でスフェロイド培養する。 </li></ol> 6.スフェロイドにおける細胞生存率の分析<ol><li>新たな薬剤とのインキュベーションの48時間後（ すなわち 、薬物とスフェロイドの治療の合計時間は4日間）、手動ピペッティングによりつのウェル中の培地の総体積を測定する。 注：1ウ​​ェルの典型的なボリュームが（小さな減少は蒸発により発生した）〜140μLである。 </li><li>合計ウェル体積の10％の濃度で細胞生存性試薬（ 例えば、PrestoBlue）の体積を計算する。各ウェルに細胞生存性試薬のこのボリュームを追加する。 注：ウェルの140μLの既存のメディアのボリュームでは、15.6μlのはよく全体の10％の濃度になるようにする必要があります。これは次式で計算される9（140μL/ 9 = 15.6μl）をすることで、既存のメディアボリュームを分割する。 </li><li>光から保護し、37℃で6時間、各ウェルに添加し、細胞生存性試薬でプレートをインキュベートする。 </li><li>それぞれ、マイクロプレートリーダーでプレートを置き、560 nmおよび590 nmの励起および発光波長で蛍光シグナルを読み取る。 </li><li>同一の処理条件からの値を平均化した後、対照ウェルと処理したウェルからの蛍光シグナルを正規化することによりスフェロイド中の細胞の生存率パーセントを計算する。 </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts.">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444 (2010).</li><li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li><li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids.">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li><li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+drug+screen:+considerations+and+practical+approach.">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li><li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer.">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li><li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+tumours+in+context.">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

スフェロイドは、より良い腫瘍生理学および薬効を理解し、抗癌薬の発見のための有用なツールを提供するための現実的なモデルを提示する。そのようなアプリケーションは、非常に、標準実験器具、液体ハンドリングツールおよびスクリーニング装置を必要とする単純な回転楕円体の生成および保守技術の恩恵を受ける。水性二相系ドロップ相内に自然に凝集体の癌細胞の使用は、効率的?...

細胞ベースのアッセイを開発し、新たな抗癌薬の発見のための重要なツールを提供する。1,2は、歴史的に、癌細胞の単層培養物は、癌細胞の特定の型に対する候補化合物の有効性を調査するために使用されてきた。標準培養プレートで単層培養のメンテナンスの容易さ、試薬の添加のための商業のロボットのツールを標準プレートの互換性、および化学物質に対する細胞応答の下流分析のためのスクリーニング装置では、2Dの文化に魅力的なツールをレンダリングする主要な利点があります薬物試験のために3残念ながら、単層細胞アッセイは、多くの場合、薬剤の開発及び発見非常にコストのかかる処理を行う、生体内での化合物の有効性を予測することができない。4,5製薬企業および学術単位で多大な投資と努力にもかかわらず、唯一〜1％臨床試験中の抗がん剤は、承認されたのしたがって、7。 インビボでの 2D培養癌細胞の複雑な3D環境との間の6視差が単層培養システムの主要な欠点である。過去20年間のFDAによって、より密接に似ている設定において腫瘍細胞に対する候補化合物のスクリーニング3次元腫瘍環境は、新規な化学療法薬の開発を促進することができる。8 癌細胞スフェロイドは、 インビトロで 、関連する3D腫瘍モデルを提示する。9,10スフェロイドは、スピナーフラスコのような技術を使用して非接着性表面上または懸濁液中の癌細胞の自発的または誘導されたアセンブリを介して形成するコンパクトなクラスタ、液体オーバーレイ、微細加工されたマイクロある良くアレイ、マイクロフルイディクス、および懸滴11-16スフェロイドは、中心ゾーンにキージオメトリおよび酸素の制限された輸送を含む、固形腫瘍の特徴、栄養素、薬物化合物を模倣する。それ故に、彼らはより密接に薬物responを再生成それ固形腫瘍の単層培養物と比較して17〜19本の著しい利点にもかかわらず、スフェロイドは、日常的に、癌細胞に対する化合物のスクリーニングのために使用されていない。市販のロボット工学およびスクリーニング/イメージングツールと互換性があり、標準的なハイスループット設定で均一なサイズのスフェロイドを製造する難しさは、医薬品開発パイプラインに回転楕円体の文化の取り込みを妨げる。カスタム材料とプレートが最近、このニーズに対応するために市販されるようになってきたが、コストの考慮事項は、その普及を阻止する。 新しいハンギングドロッププラットフォームと微細加工されたマイクロウェルを使用し、高スループットで一貫性のあるサイズのスフェロイドを生産する能力を持つ二つの主要な技術。13,16,20しかし、両方のアプローチは、特別なプレートと製作するのに費用およびエンドユーザーのための不便なデバイスを必要とする中核研究センターおよび製薬産業、ほとんどの主要EFで新しい抗癌薬の発見のための砦がなされる。ドロッププレートをぶら下げの最近のデザインの細胞含有液滴の安定性のいくつかの改善にもかかわらず、プレートの唯一の他のすべての穴はまだ滴の拡散/マージを回避するために、培養中に使用されます。16。これはかなり実験的なスループットが低下します。薬物添加と更新は手動またはロボットピペッティングでは困難であり、このプレート構成は、プレートリーダーのような従来のスクリーニング装置と容易に互換性がないため、スフェロイドは生化学分析のための標準的なプレートに転送する必要がある。21マイクロウェルはまた、ソフトリソグラフィーを使用して製作制御されたサイズのスフェロイド生産を可能にする。13,20しかし、標準ペッティングツールと、このプラットフォームの非互換性は、単一の処理条件にすべてのスフェロイドを暴露、異なる薬剤化合物/濃度の個々のスフェロイドの治療を防ぎます。したがって、この方法は、高に適していない複数の化合物/濃度の同時試験を必要とスループット化合物スクリーニング。 これらの障害を克服するために、標準的な96ウェルプレート中で一貫してサイズの癌細胞スフェロイドの高スループット生産のための新しい技術が開発されている。22,23アプローチは（ポリエチレングリコールポリマー水性二相系（ATPS）に基づいている相形成ポリマーとしてPEG）およびデキストラン（DEX）。24 ATPSs最近、新規な細胞の様々な高度に水性媒体中の細胞に細胞微細及び生物学的試薬の局所的な送達を可能にするために生物学的用途に利用されている。25-32を形成する回転楕円体、癌細胞は、水性DEX相と混合し、得られた懸濁液のサブマイクロリットルの滴を十分に浸漬水PEG相溶液を含む中にピペットされる。低下はスフェロイドの形成を容易にするために、浸漬相境界細胞から​​の非混和性のままである。インプortantly、高度に水性の浸漬段階は、回転楕円体の細胞に栄養を提供し、メディアオスモル濃度及び薬物濃度の変動の変化を引き起こすいくつかの他のアッセイに共通のメディア蒸発の周知の問題を最小限に抑える。この技術は、回転楕円体の生産と、標準96ウェルプレート中で、市販の試薬ピペッティング·ツールを使用して薬物治療を可能にする。重要なことには、スフェロイドの細胞応答の分析は、標準的な生化学アッセイおよびプレートリーダーを使用して、同じプレートで行われる。ロボット液体ハンドリングへのアプローチのATPSと適応での作業のしやすさは、モノカルチャーと共培養の両方のハイスループットの生成が簡単な実験技術をスフェロイドなります。この新しいアプローチは、改良された試験のスループットと試験化合物とのReduの費用対効果（数が増加して薬剤の開発と発見のプロセスに癌細胞スフェロイドの統合に向けた大きな前進となりますCED試薬消費量）と効率（）ハンズオン時間を短縮する。 ATPSアプローチを用いて、96ウェルプレート中の癌細胞スフェロイドのロボットの生産のための詳細なプロトコルを以下に記載する。また、得られたスフェロイドおよび商業生化学的アッセイを用いて細胞応答の下流の分析の薬物治療の詳細が提示される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol, Mw: 35,000</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>94646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Mw: 500,000</td>
			<td>Pharmacosmos</td>
			<td>5510 0500 9007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12306C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clacein AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C3100MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>33342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Spectrum Chemicals</td>
			<td>15663-27-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrestoBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-13261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-108</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>542342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tips (10 &#181;l)</td>
			<td>Fluotics</td>
			<td>C-P10V11.ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Tips (70 &#181;l)</td>
			<td>Fluotics</td>
			<td>C-P70V11.ST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom 96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Handler</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>SRT Bravo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Reader</td>
			<td>Biotek Instruments</td>
			<td>Synergy H1M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robotic production of cancer cell spheroids with an aqueous two-phase system for drug testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

ロボット液体ハンドラのワークステーションは。 図1に示すペッティングヘッドとセクション4.6でスフェロイドのロボットの印刷に使用されるすべてのステーションは、ラベル付けされている。画像は、先端の箱のための2つの異なるステーション（1混合するためのヒントのセットと、細胞懸濁液水性DEX相混合の/調剤を吸引するための第二のセット）の使用を示している。全体の...

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Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

薬物検査のための水性二相系と癌細胞スフェロイドのロボット生産

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

robotic-production-cancer-cell-spheroids-with-an-aqueous-two-phase

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.9K ビュー.  The University of Akron. A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

ビデオ: Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

水性二相系を用いた細胞の共培養パターニング

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

生物工学

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is conducted by eliciting an illusion through use of a mirror as if the hemiplegic arm is moving in real-time while moving the healthy arm. It can facilitate brain neuroplasticity through activation of the sensorimotor cortex. However, conventional mirror therapy has a critical limitation in that the hemiplegic arm is not actually moving. Thus, we developed a real-time 2-axis mirror robot system as a simple add-on module for conventional mirror therapy using a closed feedback mechanism, which enables real-time movement of the hemiplegic arm. We used 3 Attitude and Heading Reference System sensors, 2 brushless DC motors for elbow and wrist joints, and exoskeletal frames. In a feasibility study on 6 healthy subjects, robotic mirror therapy was safe and feasible. We further selected tasks useful for activities of daily living training through feedback from rehabilitation doctors. A chronic stroke patient showed improvement in the Fugl-Meyer assessment scale and elbow flexor spasticity after a 2-week application of the mirror robot system. Robotic mirror therapy may enhance proprioceptive input to the sensory cortex, which is considered to be important in neuroplasticity and functional recovery of hemiplegic arms. The mirror robot system presented herein can be easily developed and utilized effectively to advance occupational therapy.

We developed a real-time mirror robot system for functional recovery of hemiplegic arms using automatic control technology, conducted a clinical study on healthy subjects, and determined tasks through feedback from rehabilitation doctors. This simple mirror robot can be applied effectively to occupational therapy in stroke patients with a hemiplegic arm.

片麻痺腕の機能回復のためのロボットミラーセラピーシステム

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

作製と内皮下電気抵抗を直接定量化する統合型電極を用いたオンチップ器官システムの検証

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

高スループットの自動モデル IgG1 CHO 細胞での生産のための Microbioreactor システム

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

自動化された微生物叢システムを用いた中国ハムスター卵巣細胞からのモノクローナル抗体の精製と分析

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested cell culture fluid. While traditional methods like centrifugation or filtration are widely implemented for cell removal, the equipment for these processes have large footprints and operation can involve contamination risks and filter fouling. Additionally, traditional methods may not be ideal for continuous bioprocessing schemes for primary clarification. Thus, an alternate application using acoustic (sound) waves was investigated to continuously separate cells from the cell culture fluid. Presented in this study is a detailed protocol for using a bench-scale acoustic wave separator (AWS) for the primary separation of culture fluid containing a monoclonal IgG1 antibody from a CHO cell bioreactor harvest. Representative data are presented from the AWS and demonstrate how to achieve effective cell clarification and product recovery. Finally, potential applications for AWS in continuous bioprocessing are discussed. Overall, this study provides a practical and general protocol for the implementation of AWS in primary clarification for CHO cell cultures and further describes its application potential in continuous bioprocessing.

Presented here is a protocol for the primary clarification of CHO cell culture using an acoustic separator. This protocol can be used for the primary clarification of shake flask cultures or bioreactor harvests and has the potential application for continuous clarification of the cell bleed material during perfusion bioreactor operations.

音響セパレータを用いたCHO採取細胞培養液の一次解明

Primary clarification is an essential step in a biomanufacturing process for the initial removal of cells from therapeutic products within the harvested ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

3Dバイオプリンティングのための脂肪由来幹細胞スフェロイドの大規模自動生産

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

3D音響アセンブリデバイスを用いた均一細胞スフェロイドのスケーラブルな生成

Three-Dimensional Acoustic Assembly Device for Mass Manufacturing of Cell Spheroids

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method for manufacturing high-quality and high-throughput cell spheroids using a 3D acoustic assembly device through maneuverable procedures. The acoustic assembly device consists of three lead zirconate titanate (PZT) transducers, each arranged in the X/Y/Z plane of a square polymethyl methacrylate (PMMA) chamber. This configuration enables the generation of a 3D dot-array pattern of levitated acoustic nodes (LANs) when three signals are applied. As a result, cells in the gelatin methacryloyl (GelMA) solution can be driven to the LANs, forming uniform cell aggregates in three dimensions. The GelMA solution is then UV-photocured and crosslinked to serve as a scaffold that supports the growth of cell aggregates. Finally, masses of matured spheroids are obtained and retrieved by subsequently dissolving the GelMA scaffolds under mild conditions. The proposed new 3D acoustic cell assembly device will enable the scale-up fabrication of cell spheroids, and even organoids, offering great potential technology in the biological field.

著者スポットライト:高品質3D細胞スフェロイド培養のためのスキャフォールドフリー音響アセンブリ法の開発 

Cell spheroids have been considered one potential model in the field of biological applications. This article describes protocols for scalably generating cell spheroids using a 3D acoustic assembly device, which provides an efficient method for the robust and rapid fabrication of uniform cell spheroids.

細胞スフェロイドの量産のための3次元音響組立装置

Cell spheroids are promising three-dimensional (3D) models that have gained wide applications in many biological fields. This protocol presents a method ...