We thank Sergio G&#243;mez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.

動物実験は承認されたプロトコルに従って、およびドイツの動物保護法のガイドラインに従って行いました。動物実験を実施するすべてのスタッフは、カテゴリB又は欧州実験動物学連盟のCに応じた研修プログラムに合格しました。 逆遺伝学による組換え弱毒インフルエンザワクチンの1世代注：逆遺伝学による組換えインフルエンザウイルスを生成するための詳細なプロトコールは、以前の研究5によって説明され、本報告書の範囲外であるされています。簡単に言えば、低温適合性インフルエンザワクチンの救出（CAV）はバイオセーフティーレベル2（BSL2）の封じ込め下バイオセーフティクラスIIキャビネットで行われ、以下に詳述する手順が含まれています。トランスフェクションおよび感染プロトコルは、それを次の マルティネス-Sobrido ら 5。 <ol><li>再集合体低温適応性インフルエンザの生成背景として低温適合株A / PR / 8/34（H1N1）株のA /アナーバー/ 60分の6（H2N2）、ならびに赤血球凝集素（HA）および変性ノイラミニダーゼ（NA）を（使用して、ワクチン図1A）。 NA遺伝子における修飾は、ニワトリオボアルブミン（OVA）由来のペプチドSIINFEKL（ 図1B）をコードする短いcDNA配列によるタンパク質の茎（残基65から72）で保存された配列のPCRベースの交換で構成されています。 SIINFEKLペプチドは、C57BL / 6マウス12の応答をI制限H-2B MHCクラスの文脈において非常に免疫優性ペプチドです。 </li><li>プレート1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / E）を補充したDMEM、10％ウシ胎児血清（FBS）を使用して、6ウェルプレート中のウェルあたり10 6個の 293T細胞。 </li><li>プラスミドトランスフェクション混合物を準備します。追加NAをコードするPB2、PB1、PA、NP、M、NSインフルエンザからのA /アナーバー/ 60分の6株についてのcDNAおよびプラスミド1μgのをコードするプラスミドのそれぞれ1μgの-SIINFEKLとインフルエンザA / PR / 8/34からのHA。追加予め温めておいたOptiMEM（100μl/ウェルの最終容量15μL）。 </li><li> RTで30分間トランスフェクション混合物をインキュベートします。 </li><li>ウェル/トランスフェクションミックスの100μLを加え、37℃で16時間、5％CO 2インキュベートします。 </li><li> 5時間、CO 2を 33℃で、DMEM、0.3％BSA、1％のP / Eで細胞培地を変更し、5％。 </li><li> L-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン（TPCKトリプシン）で処理されたウシ膵臓からのトリプシンを1μg/ mlを含むDMSO中に10 6インフルエンザ許容MDCK細胞を追加します。 33℃で3日間、5％CO 2 - 2のための293T-MDCK共培養を維持します。 </li><li> MDCK-293T細胞の共培養物の上清を収集し、5分間、260×gで遠心分離することによって明らかにされます。 </li><li>無菌状態で10日齢の鶏孵化卵 - 9を接種します。マルティネス-Sobrido らによって示されるようにこれを行うには、卵殻の上部に穴を作る。5。 </li><li>卵殻ウィットをカバーhは綿棒を使用して、ワックスを溶融し、33℃で3日間接種鶏の卵をインキュベートします。 </li><li>感染した孵化卵から尿膜液を収穫：70％エタノールで卵の殻を洗ってください。非常に穏やか上部に亀裂や滅菌ピンセットを使用して尿膜を除去して、卵を開きます。 （ - 10ミリリットル、通常、6）できるだけ多くの流体を収集するために10ミリリットルのピペットを使用してください。 4℃で10分間、260×gで遠心分離し、新しいチューブにクリア尿膜液を移します。 </li></ol> 2.トラッキングワクチン特異的免疫<ol><li>ペプチド担持樹状細胞（DC）のトレース<ol><li>マウスのワクチン接種のために、精密な気化器を使用して、酸素中5％イソフルランでマウスを麻酔。マウスの鼻の穴に直接液滴を介して、SIINFEKLペプチドを発現するワクチンの10 3プラーク形成単位（PFU）を含む50μlのPBSを投与するために200μlのピペットを使用してください。 </li><li>三日後、ワクチン接種、euthanizイソフルラン麻酔を経由して電子マウスは頸椎脱臼が続きます。 </li><li>鉗子でちょうど胸郭の下に正中線にマウスの皮膚を持ち上げ、ハサミで皮膚を通して小さな切開をカット。長さ5cm、各端部から横方向に正中線から、次に、先頭と末尾の両方に向かって皮膚を介して2つの2cmの切開をカット - 切開の観点から、3が作ります。ピールバックスキンは、腹膜および胸腔を明らかにしました。慎重に胸部を露出させるために腹膜を囲む膜を切断。 </li><li>縦隔にアクセスするにはdiafragmaとケージリブの底を切りました。気管の腹側の近くに、腕頭動脈に内側に隣接して、わずかに背側と横方向に胸腺に隣接し、2縦隔リンパ節（mLNs）を検索し、削除します。 </li><li> mLNsを採取するためには、湾曲した鉗子を使用しています。リンパ節の下に鉗子を置き、静かにそれらをプルアップします。 1mlのDMEMを含む6ウェルプレート中のリンパ節を配置し、任意のconnectiを削除VEのか、ノードの周囲の脂肪組織。 <ol><li> 1ミリリットル注射器に取り付けられた2つの26 G針で十分に各サンプルをいじめます。他の針でリンパ節を開いて壊しながらリンパ節をいじめるために、一方の針でそれを押したままにします。これが正しく行われた場合、リンパ節から濃縮された細胞の破裂を容易培地において観察されます。単一細胞懸濁液を得るために、70μmのナイロンフィルターを通してすべての組織材料を渡します。 </li></ol></li><li>冷却遠心機で260×gで10分間遠心操作し、単一細胞懸濁液。赤血球を溶解するために赤血球細胞溶解（RBCL）緩衝液2ml中の細胞ペレットを再懸濁します。溶解は室温で3分間進行させます。 </li><li>氷冷PBSの2ミリリットルで遠心分離し、細胞の再懸濁を介しRBCLバッファを中和します。 </li><li> 100μlの最終容量で10 7細胞/ mlの濃度のU字型96ウェルプレート中のプレートの細胞。 </li><li>フローサイトメトリー分析のために、使用して細胞のFc受容体をブロックします氷上で15分間、10 6個の細胞あたり抗マウスCD16 / CD32抗体1μgの。 </li><li>遠心プレートとプレートフリックにより上清を捨てます。選択の表面抗体の組み合わせで個々のウェルをインキュベートします。典型的には、リンパ節における樹状細胞の検出のために、抗体カクテルが含まれている必要があります0.25抗CD11cのμgの、CD11bの0.25μgの、MHCクラスII0.5μgの、CD1030.25μgのと100の最終容量でCD8αの0.15μgのをμlの。 </li><li>負のゲーティングのために、抗CD3、CD19、NK1.1または系統カクテル（ 図2A）の0.25μgのを追加します。代替ゲーティング戦略だけでなく、複数の蛍光色素の適切な補償のためのプロトコルは、免疫学的ゲノム·プロジェクトのウェブサイトで見つけることができます。選択の表面マーカーに加えて、カクテルにSIINFEKLに結合したH-2K b のに対する抗体の1μgのを追加します。この市販の抗体は、DC私の可視化を可能にしますSIINFEKLペプチドは、MHCクラスIを表面に結合するN </li><li>氷上で30分間、表面抗体で細胞をインキュベートします。光からプレートを保護します。 5分間260×gで遠心分離板及び2mlのPBSで2回洗浄します。分析のためのフローサイトメトリー管を流れるように細胞を転送します。 </li></ol></li><li>ワクチン特異的T細胞の増殖の評価<ol><li>生成されたすべてのCD8 T細胞は、SIINFEKLペプチドに特異的である、市販のTCRトランスジェニックマウス（OT-Iマウス）（C57BL / 6-Tgは（TCR aTcrb）1100Mjb / J）からドナーT細胞を得ます。頸椎脱臼が続くイソフルラン麻酔によりマウスを安楽死させます。腹腔の切開を行うことによって収穫脾臓。 DMEM /脾臓の2mlに脾臓/秒を置き、結合して脂肪組織を除去。 </li><li> 2.1.2および2.1.3に記載の手順に従って、脾臓から単一細胞懸濁液を生成します。 </li><li>さらに、T細胞上の単一細胞懸濁液を富化するために、磁気ビーズ分離プロトコルを適用します正または負の選択手順12を使用して。ドナーT細胞は、CD45.2 12を表現しながら、例のレシピエントマウスは、白血球マーカーCD45.1を発現するためのように、レシピエント細胞からドナーを区別するために、コンジェニックマウスを使用します。 </li><li> T細胞を標識するために、5×10 6細胞/ mlの最適な細胞密度にカルボキシスクシンイミジルエステル（CFSE）の5μMを含む1mlのPBSでそれらをインキュベートします。露光から保護し、37℃で20分間細胞をインキュベートします。インキュベートした後、5分間260×gで遠心細胞、上清を廃棄し、細胞を再懸濁する3ml中のウシ胎児血清（FBS）CFSEを中和します。 </li><li> PBSの十分な容量で10分間再懸濁中260×gで遠心細胞溶液100μlを2×10 6個の細胞を含むように。眼窩洞注入13を介して2×10 6細胞/マウスと受信者のコンジェニックマウスを注入。 </li><li>日3,4,5後にレシピエントマウスを安楽死させます頸椎脱臼が続くイソフルラン麻酔を使用して、ワクチン接種。縦隔リンパ節を採取し、2.1.2-2.1.5に示されるように、フローサイトメトリーのための単一細胞懸濁液を調製します。 </li><li>を含む抗体カクテル100μl中の単一細胞懸濁液の染色によってドナー細胞を特定します。抗マウスCD3、CD4とCD8抗体0.25μgのを。抗マウスCD45.1またはCD45.2抗体（ドナー細胞の表現型に依存する）の0.5μgの。 CFSE 12（ 図2B）の希釈プロファイルを決定するためにオープン（FITC）フローサイトメーターのFL-1チャネルのままにしておきます。 </li></ol></li></ol>遺伝子特異的ワクチンの応答を分析する3。キメラマウス注記：DTRベースのマウスモデルを使用して、競争力のある骨髄キメラの生成は、ワクチンに対する免疫応答の間の細胞特異的な機能の識別を可能にします。ここでは、DTRを発現するドナーCの追加の戦略によって組み合わせを表示します特定の細胞区画における免疫間の遺伝子の特定の機能を研究するためのノックアウトマウスが許すから細胞とells。例では、ランゲリン+ CD103 + DCにおけるToll様受容体3（TLR3）の特定の欠失を有するマウスを作製します。 <ol><li>骨髄ドナー細胞の調製<ol><li>バイオセーフティーレベルIIキャビネットの下で働きます。排他的にオートクレーブ処理機器を使用して、汚染を避けます。 </li><li> 、骨髄キメラマウスを作製するレシピエントとしてコンジェニックCD45.1 + C57BL / 6雌マウスを使用して、TLR3使用するには- / - 、ランゲリンDTR / EGFP、またはwtマウスは、ドナーとしてCD45.2 +を発現します。コンジェニックドナーとレシピエントマウスを使用したフローサイトメトリーを介して、ドナーとレシピエント細胞の分化を可能にし、これは、移植を評価することを可能にします。 </li><li>ドナー骨髄細胞を得るために、頸椎脱臼が続くイソフルラン麻酔でドナーマウスを安楽死させます。鋭いハサミは足首の周りの切開を行うとMとなるようウーズの筋肉組織が露出しています。 </li><li>脚の筋肉が表示されるように鈍鉗子を使用すると、腰に向かって足首から静かにマウスの皮膚や被毛を引っ張ります。 </li><li>鋭いハサミで腰の高さにし、大腿骨の頭の上にマウスの足を切りました。 </li><li>ペトリ皿の上に、氷上に足を置きます。高速に動作し、骨を露出させるために、すべての筋肉を削除します。 </li><li>個別の大腿骨と脛骨。可能な細菌を除去し、無血清DMEM 5 mlを含む別のペトリ皿の上にすぐにそれらを配置するために5分間の70％エタノール溶液中に骨を置きます。骨は鋭いハサミを使用して終了カットし、DMEMに骨髄をフラッシュします。 5ミリリットルの注射器に取り付けられた26 Gの針を挿入することにより、骨に、そのDMEMのフラッシュ1ミリリットルをすることができません。骨がフラッシングした後、（空の）白に見えていることを確認します。 </li><li> DMEM 10ml中のドナーマウスからすべての骨髄細胞を収集します。 70μmのセルストレーナーを通して収穫を通過させることにより骨髄細胞の単一細胞懸濁液を生成します。 </li><li> CL冷却遠心機で4℃で10分間、260×gで遠心分離することにより骨髄細胞の耳単一細胞懸濁液。 10mlのPBSで再懸濁細胞ペレット。 2.1.3及び2.1.4に記載したようにRBCL溶液を用いて赤血球細胞を枯渇させます。 </li><li>血球計数器または自動セルカウンターのいずれかを使用して骨髄細胞をカウントします。トリパンブルー染色13を介して死細胞の決意によって、細胞生存率を評価します。最適には、少なくとも80％の生存率を持つ単一の動物利回り約3×10 7白血球細胞/マウス。 </li><li> - / -または重量ドナー細胞の総骨髄キメラの場合には、TLR-3を準備します。 100μlのPBS中の2×10 6細胞を移植のために使用されるので、最適な細胞濃度が2×10 7細胞/ mlです。すぐに使用しない場合は、10％DMSOで緩慢凍結法とFBSを用いて、-80℃でドナー細胞を保存します。混合キメラモデルでは、ランゲリンDTR-ドナー細胞とを混合TLR3 - / - </sup&gt; 75：25の割合でドナー細胞。対照マウスを生成するために、骨髄細胞重量：25ランゲリンDTR：75のミックスを調製します。 </li></ol></li><li>マウスの照射および移植<ol><li>セシウム137のソース照射で生後8週 - 6との間の雌マウスに照射されます。マウスを4時間離れて550ラドの2つの用量を与えます。分割照射は、急性肝毒性を最小限に抑えるため、照射プロトコルによるマウスの致死率を減少させます。 </li><li>照射後、2週間の抗生物質で治療を受けたマウスを保持します。バイトリル/ kgを5 mgの - 2.5で飲料水に抗生物質を与えます。 </li><li> 2 - 第2の照射後4時間、静脈内にドナーの骨髄細胞を用いた移植マウス。 2×10 6個の細胞を含む100μlのPBSの最大容量を使用して、眼窩洞注入13を介して、およびイソフルラン麻酔下でドナー細胞の注入を行います。 </li><li>四週間の移植後、100のサンプルで生着を評価します少なくとも2つの色を読み取ることができる装置を用いて、フローサイトメトリーを介して、末梢血のマイクロリットル。ドナーと放射線耐性レシピエント細胞を区別するために、100分の1と1/200の間で希釈液を用いて、市販の蛍光標識CD45.1およびCD45.2抗マウス抗体を使用しています。ドナー細胞の最適な移植は、末梢血中の全造血細胞の少なくとも80％であるべきです。 </li></ol></li><li>ワクチン接種および標的に枯渇<ol><li>鼻腔を介して組換え生弱毒化インフルエンザワクチンをマウスにワクチン接種します。マウスのワクチン接種のために、精密な気化器を使用して、酸素中5％イソフルランでマウスを麻酔。ワクチンの10 3プラーク形成単位（PFU）を含む50μlのPBSを投与するために200μlのピペットを使用してください。 </li><li>最終的なマウスモデルを生成するには、鼻腔内に50μlのPBS中に希釈したDT 50ngのでマウスを治療します。 3.3.1で説明したように麻酔したマウスの鼻孔に直接ドロップすることによりDT降下を管理します。マイルを扱います2日目ワクチン接種後（ 図3B）までワクチン接種前日-2で治療を開始する日用量でCE。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understand+memory,+design+better+vaccines.">Understand memory, design better vaccines.</a> Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).</li><li>Gaucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yellow+fever+vaccine+induces+integrated+multilineage+and+polyfunctional+immune+responses.">Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses.</a> J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).</li><li>Querec, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+approach+predicts+immunogenicity+of+the+yellow+fever+vaccine+in+humans.">Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans.</a> Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. 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Immunol. 120, 1-49 (2013).</li><li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+depletion+of+CD11c++dendritic+cells+abrogates+priming+of+CD8++T+cells+by+exogenous+cell-associated+antigens.">In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens.</a> Immunity. 17, 211-220 (2011).</li><li>Lahl, K., Sparwasser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+depletion+of+FoxP3++Tregs+using+the+DEREG+mouse+model.">In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model.</a> Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).</li><li>Duffield, J. 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The authors have nothing to disclose.

本研究では、ワクチン誘導免疫の生理学的および分子メカニズムを解明するために利用することができますどのように逆遺伝学およびキメラマウスモデルについて説明します。インフルエンザ逆遺伝学は、多くの研究室で確立され、インフルエンザ発病、複製、および伝送17を理解する上で主な役割を果たしてきました。我々のプロトコルで重要な点は、外来エピトープを発現する寒...

疾患の非存在下での免疫記憶の発生を効率的にワクチン接種1の生理学的基礎です。近年、システム生物学に基づくアプローチは、順番に、リードが抗原の活性化を多系列ためにどのような黄熱病ワクチンとして成功したワクチンは、強力な自然免疫応答の誘導および樹状細胞（DC）のいくつかのサブセットの活性化を誘導することを明らかにしました特異的T細胞の2,3。 DCは、抗原特異的ナイーブT細胞4を活性化する能力を持つ唯一の免疫細胞集団であるため、ワクチン接種時にその機能の研究は、ワクチンに対する免疫応答を理解し、挑戦的な病原体に対する今後の戦略を設計することが重要です。 ワクチンに対する免疫応答の間に別のDCのサブセットのトレースはリンパ組織へのDCの遊走の正確な速度を確立するために望ましいであろうため、提供することを可能にするシステムワクチン特異的適応免疫の開始を担う生理学的メカニズムへの洞察。逆遺伝学ベースのアプローチは、この目的に実験的に使用することができる修飾された、生弱毒化ワクチンを生成するための可能性を提供します。インフルエンザ研究に実装するので、プラスミドベースの逆遺伝学は広くLAIVs含む組換えインフルエンザ株を生成するために使用されてきました。組換えインフルエンザウイルスを救出するための標準的なプロトコルは、（マディンダービーイヌ腎臓として許容システムでは8個のインフルエンザウイルスのセグメントと同様に増幅を含む（正と負の両方のセンスRNAを産生する）アンビセンスプラスミドを有する高度のトランスフェクト細胞株の多トランスフェクションを必要としますMDCK）細胞および/ ​​またはニワトリ孵化卵5。しかし、ワクチン接種の免疫機構を研究するための分子ツールを生成するための逆遺伝学の適用が未開拓のままです。 世代DCを含む免疫細胞サブセットの特定の枯渇を可能にする新しいマウスモデルの、ワクチン誘発保護の根底にある基本的な免疫機構を理解するための新たな可能性を開きました。マウスおよびヒトにおけるDCサブセット機能との比較、大幅に、マウスおよびヒトDCは機能的に相同6,7であることがこれらの調査結果を明らかにした、強力にマウスモデルの開発は、定常状態でのDCの特定の枯渇を可能にすることを示唆していますおよび炎症状態の間、ヒトにおけるDC応答の生理を理解するために役立つことができます。近年、マウスモデルの数は、目的8,9の遺伝子のプロモーター領域の制御下にサルジフテリア毒素（DT）受容体（DTR）を発現する導入遺伝子を保有する生成されています。マウス組織が自然にDTRを発現しないので、これらのモデルはDTでマウスの接種時に対象となる標的遺伝子を有する細胞サブセットの条件枯渇を可能にします。したがって、我々のabili生理学的プロセスの間に、生体内で特定のDCおよび他の白血球を枯渇させるTYは、大幅にDTRベースのROの開発によって強化されました。これらのトランスジェニックマウスモデルは、免疫系の個体発生を理解するために広く使用されているがしかし、ワクチン開発への応用はほとんどテストされていません。ここでは、インフルエンザの逆遺伝学とDTRベースの競争骨髄キメラを組み合わせることによって、我々は、in vivoでのワクチンに対する免疫応答の間にワクチン免疫の動態ならびに個々の遺伝子機能を研究するための方法を提案します。挑戦的な感染症に対する新たなワクチンの前臨床評価のためのこの技術の適用は、ワクチン設計を合理化し、in vivoでのワクチン候補をテストするために助けることができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Modified Eagle Medium (DMEM 1X)</td>
			<td>Gibco RL-Life Technologies</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti MEM</td>
			<td>Gibco RL-Life Technologies</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen-Life Technologies</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>p11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonated eggs</td>
			<td>Valo biomedia Gmbh</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M Nylon Filters</td>
			<td>Greiner-Biorad</td>
			<td>542-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Anti-mouse CD11c (HLA3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-5321-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Anti-mouse CD45.1 (A20)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0453-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0081-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7-Anti-mouse CD3&#949; (145-2611)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0041-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE Proliferation dye</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 2.5%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymethil-Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin&#160;</td>
			<td>Molecular probes&#160;</td>
			<td>O23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria Toxin (DT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-TPCK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACsCanto II Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo cell analysis software 9.5</td>
			<td>Flowjo inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automatic Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen-Life Technologies</td>
			<td>C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intranasal administration of recombinant influenza vaccines in chimeric mouse models to study mucosal immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

組換え生弱毒化インフルエンザワクチンの生成は、双方向性プロモーター5の制御下でインフルエンザウイルスの8つのセグメントをコードするプラスミドをトランスフェクトすることによって達成することができます。低温適応インフルエンザワクチンは通常、低温適応株と同様に、任意のインフルエンザ株のHAとNA（ 例えば 、H1N1）（ 図1A）の6つのセグメントが?...

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Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K ビュー.  Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology. There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

免疫・感染学

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide variety of pathogens 1-3. Since the mammalian cell system is capable of post-translational modification, thus forming properly folded and glycosylated proteins, recombinant proteins expressed in mammalian cells have shown the greatest potential to maintain high antigenicity and immunogenicity 4-6.
Although no new cases of SARS have been reported since 2004, future outbreaks are a constant threat; therefore, the development of vaccines against SARS-CoV is a prudent preventive step and should be carried out. The RBD of SARS-CoV S protein plays important roles in receptor binding and induction of specific neutralizing antibodies against virus infection 7-9. Therefore, in this protocol, we describe novel methods for developing a RBD-based subunit vaccine against SARS. Briefly, the recombinant RBD protein (rRBD) was expressed in culture supernatant of mammalian 293T cells to obtain a correctly folded protein with proper conformation and high immunogenicity 6. The transfection of the recombinant plasmid encoding RBD to the cells was then performed using a calcium phosphate transfection method 6,10 with some modifications. Compared with the lipid transfection method 11,12, this modified calcium phosphate transfection method is cheaper, easier to handle, and has the potential to reach high efficacy once a transfection complex with suitable size and shape is formed 13,14. Finally, a SARS pseudovirus neutralization assay was introduced in the protocol and used to detect the neutralizing activity of sera of mice vaccinated with rRBD protein. This assay is relatively safe, does not involve an infectious SARS-CoV, and can be performed without the requirement of a biosafety-3 laboratory 15.
The protocol described here can also be used to design and study recombinant subunit vaccines against other viruses with class I fusion proteins, for example, HIV, respiratory syncytial virus (RSV), Ebola virus, influenza virus, as well as Nipah and Handra viruses. In addition, the methods for generating a pseudovirus and subsequently establishing a pseudovirus neutralization assay can be applied to all these viruses.

This protocol describes a general procedure for studying recombinant receptor-binding domain (RBD)-based subunit vaccines against SARS. It includes methods for transfection and expression of RBD protein in 293T cells, immunization of mice with RBD and detection of neutralization activity of mouse sera using an established SARS pseudovirus neutralization assay.

タンパク質調製物、動物の予防接種と中和の検出：遺伝子組換えRBDベースのSARSのワクチンのためのプロトコル

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

すべてのインフルエンザA型の定量的な分析シンプルなスロットブロットアッセイでユニバーサル抗体を用いたウイルスHemagglutininsとノイラミニダーゼ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. The NALT are two parallel bell-shaped structures located in the nasal passages above the hard palate, and are usually considered to be secondary components of the mucosal-associated lymphoid system4-6. Located within the NALT are discrete compartments of B and T lymphocytes interspersed with antigen-presenting dendritic cells4,7,8. These cells are surrounded by an epithelial cell layer intercalated with M-cells that are responsible for antigen retrieval from the mucosal surfaces of the air passages9,10. Naive lymphocytes circulating through the NALT are poised to respond to first encounters with respiratory pathogens7. While NALT disappear in humans by the age of two years, the Waldeyer's Ring and similarly structured lymphatic organs continue to persist throughout life6. In contrast to humans, mice retain NALT throughout life, thus providing a convenient animal model for the study of immune responses originating within the nasal sinuses11.
Cultures of single-cell suspensions of NALT are not practical due to low yields of mononuclear cells. However, NALT biology can be examined by ex vivo culturing of the intact organ, and this method has the additional advantage of maintaining the natural tissue structure. For in vivo studies, genetic knockout models presenting defects limited to NALT are not currently available due to a poor understanding of the developmental pathway. For example, while lymphotoxin-&alpha; knockout mice have atrophied NALT, the Peyer's patches, peripheral lymph nodes, follicular dendritic cells and other lymphoid tissues are also altered in these genetically manipulated mice12,13. As an alternative to gene knockout mice, surgical ablation permanently eliminates NALT from the nasal passage without affecting other tissues. The resulting mouse model has been used to establish relationships between NALT and immune responses to vaccines1,3. Serial collection of serum, saliva, nasal washes and vaginal secretions is necessary for establishing the basis of host responses to vaccination, while immune responses originating directly from NALT can be confirmed by tissue culture. The following procedures outline the surgeries, tissue culture and sample collection necessary to examine local and systemic humoral immune responses to intranasal (IN) vaccination.

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Methods to examine contributions of the nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) to nasal and systemic immune responses of mice to intranasal vaccines are described. We demonstrate a surgical procedure to establish a NALT-dependent mouse model and ex vivo cultures of extracted NALT.

ワクチンには、マウスの応答における鼻咽頭関連リンパ網内系組織（NALT）の役割を調べる

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

の気管内の管理<em&gt;インフルエンザ菌</em&gt;マウスモデルにおいて気道炎症を研究します

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

防御効力および肺免疫応答は、マウスに皮下および鼻腔内BCG投与後の

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

酵素結合レクチンアッセイによってインフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価を測定します

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...