We thank Sergio G&#243;mez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.

Tierversuche wurden nach anerkannten Protokollen und nach den Richtlinien des Deutschen Tierschutzgesetz durchgeführt. Alle Mitarbeiter Durchführung von Tierversuchen geführt Trainingsprogramme nach Kategorie B oder C der Federation of European Laboratory Animal Science Associations. 1. Erzeugung rekombinanter lebenden attenuierten Influenza-Impfstoffe durch reverse Genetik HINWEIS: Die ausführliche Protokoll für die Erzeugung von rekombinanten Grippeviren durch reverse Genetik wurde von früheren Studien 5 beschrieben worden ist und aus dem Rahmen dieses Berichts. Kurz gesagt, Rettung der kälteangepassten Influenza-Impfstoffe (CAV) in einem biologischen Sicherheitsschrank der Klasse II unter Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) Containment durchgeführt und beinhaltet Schritte unten detailliert beschrieben. Die Transfektion und Infektion Protokoll folgt, daß der Martinez-Sobrido et al. 5. <ol><li> Generieren Sie eine Reassortante kälteangepassten InfluenzaImpfstoff mit als Hintergrund die kälteangepassten Stamm A / Ann Arbor / 6/60 (H2N2), sowie die Hämagglutinin (HA) und ein modifiziertes Neuraminidase (NA) des A / PR / 8/34 (H1N1) Stamms ( 1A). Die Abwandlung in der NA-Gen besteht aus einem PCR-basierten Austausch einer konservierten Sequenz im Protein Stiel (Reste 65 bis 72) durch einen kurzen cDNA-Sequenz, die Hühner-Ovalbumin (OVA) abgeleitetes Peptid SIINFEKL (1B) kodiert. Das SIINFEKL-Peptid ist ein hochimmundominanten Peptids in Zusammenhang mit der H-2b-MHC-Klasse-I-restringierte Antwort von C57BL / 6-Mäusen 12. </li><li> Platte 10 6 293T-Zellen pro Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen mit DMEM 10% fötalem Rinderserum (FBS) mit 1% Penicillin / Streptomycin (P / E) ergänzt. </li><li> Vorbereitung Plasmid Transfektionsgemisch: 1 &amp; mgr; g von jedem der Plasmide cDNAs für PB2, PB1, PA, NP, M, NS vom Influenza A / Ann Arbor / 6/60-Stamm, und 1 ug der Plasmide für die NA kodieren -SIINFEKL undHA von Influenza-A / PR / 8/34. Add vorgewärmtem OptiMEM (15 &amp; mgr; l für ein Endvolumen von 100 ul / Vertiefung). </li><li> Inkubieren Transfektionsmischung für 30 min bei RT. </li><li> 100 l Transfektionsmischung / Vertiefung und Inkubation für 16 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Ändern Zellmedium durch DMEM 0,3% BSA 1% P / E bei 33 ° C und 5% CO 2 für 5 Stunden. </li><li> Werden 10 6 Influenza permissive MDCK-Zellen in DMSO, enthaltend 1 ug / ml Trypsin aus Rinderpankreas mit L-1-Tosylamid-2-phenylethyl-chlormethylketon (TPCK-Trypsin) behandelt. Die 293T-MDCK Co-Kulturen für 2 zu halten - 3 Tage bei 33 ° C und 5% CO 2. </li><li> Sammeln Ständen von MDCK-293T Zell Kokulturen und klar durch Zentrifugation bei 260 × g für 5 min. </li><li> Impfen 9 - 10 Tage alten Hühner befruchteten Eiern in sterilen Bedingungen. Um dies zu tun, machen Sie ein Loch an der Spitze der Eierschale, wie Martinez-Sobrido et al. 5 angedeutet. </li><li> Decken Sie die Eierschale with geschmolzenes Wachs mit einem Wattestäbchen und bebrüten die geimpft Hühnereiern für 3 Tage bei 33 ° C. </li><li> Ernten Sie die Allantoisflüssigkeit aus infizierten bebrüteten Eiern: Waschen Sie die Eierschalen mit 70% Ethanol. Öffnen Sie das Ei mit einem sehr sachte knacken im oberen Teil und nehmen Sie die Allantois-Membran unter Verwendung einer sterilen Pinzette. Verwenden Sie eine 10 ml-Pipette, um so viel Flüssigkeit wie möglich zu sammeln (in der Regel 6 bis 10 ml). Zentrifuge bei 260 × g für 10 min bei 4 ° C geklärt Allantoisflüssigkeit übertragen in neue Röhrchen. </li></ol> 2. Tracking-Impfstoff-spezifische Immunität <ol><li> Tracing von Peptid-tragenden dendritischen Zellen (DCs) <ol><li> Für Maus-Impfung, betäuben Mäuse mit 5% Isofluran in Sauerstoff unter Verwendung eines Präzisions-Verdampfer. Verwenden eine 200 ul-Pipette 50 ul PBS, enthaltend 10 3 Plaque-bildende Einheiten (pfu) der Impfstoff das SIINFEKL-Peptid über Tröpfchen direkt exprimieren den Maus Nase zu verabreichen. </li><li> Drei Tage nach der Impfung, euthanize Mäusen über Isoflurananästhesie durch Genickbruch folgte. </li><li> Heben Sie die Haut von Mäusen an der Mittellinie direkt unter dem Brustkorb mit einer Pinzette und schneiden Sie einen kleinen Schnitt durch die Haut mit einer Schere. Unter dem Aspekt der Einschnitt, machen Sie eine 3-5 cm lange durch die Haut in Richtung sowohl Kopf und Schwanz von jedem Ende geschnitten, dann zwei 2 cm Einschnitte von der Mittellinie seitlich. Ziehen Sie die Haut um die Peritonealdialyse und Brusthöhle zu offenbaren. Vorsichtig durch die Membranen rund um das Bauchfell, um den Brustkorb freizulegen geschnitten. </li><li> Für den Zugriff auf das Mediastinum schneiden die diafragma und den Boden des Käfigs Rippe. Finden und zu entfernen 2 mediastinalen Lymphknoten (MLNS), leicht dorsal und lateral neben dem Thymus, medial neben dem Truncus brachiocephalicus, in der Nähe der Bauchseite der Trachea. </li><li> Zu ernten die MLNs verwenden gebogenen Pinzette. Zeigen Zange unterhalb der Lymphknoten und ziehen Sie sie vorsichtig ab. Platzieren Lymphknoten in einer 6-Well-Platte mit 1 ml DMEM und keine connecti entfernenve oder Fettgewebe rund um den Knoten. <ol><li> Necken jeder Probe gründlich mit zwei 26 G Nadeln auf 1 ml Spritzen befestigt. Um die Lymphknoten zu necken, halten Sie sie gedrückt, während mit einer Nadel Aufbrechen der Lymphknoten mit der anderen Nadel. Wenn dies richtig gemacht wird, sind konzentrierte Zellen platzen aus dem Lymphknoten leicht in den Medien beobachtet. Geben Sie das Gewebematerial durch einen 70 &amp; mgr; m Nylon-Filter, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten. </li></ol></li><li> Zentrifuge Einzelzellsuspensionen für 10 Minuten bei 260 × g in einer gekühlten Zentrifuge. Zellpellet in 2 ml Rotes Blutkörperchen lysierende (RbCl) Puffer, um rote Blutkörperchen zu lysieren. Ermöglichen Lyse für 3 min bei RT ablaufen. </li><li> Neutralisieren RbCl Puffer durch Zentrifugation und Zell Resuspension in 2 ml eiskaltem PBS. </li><li> Platten Zellen in U-förmigen 96-Well-Platten bei einer Konzentration von 10 7 Zellen / ml in einem Endvolumen von 100 ul. </li><li> Für die Durchflusszytometrie-Analyse, Blockzelle Fc-Rezeptoren mit Hilfe1 ug anti-Maus-CD16 / CD32-Antikörper pro 10 6 Zellen für 15 Minuten auf Eis. </li><li> Zentrifugenplatten und entsorgen Überständen durch flicking Platte. Inkubieren einzelnen Wells mit der Oberfläche Antikörper Kombination der Wahl. Typischerweise für die Detektion von dendritischen Zellen in Lymphknoten, sollte die Antikörpermischung sind: 0,25 &amp; mgr; g anti-CD11c, 0,25 ug CD11b, 0,5 ug von MHC-Klasse II, 0,25 ug CD103 und 0,15 ug CD8a in einem Endvolumen von 100 ul. </li><li> Bei negativen Gating, fügen 0,25 ug anti-CD3, CD19, NK1.1 oder einer Linie Cocktail (2A). Alternative Gating-Strategien sowie Protokolle für die angemessene Entschädigung von mehreren Fluoreszenzfarbstoffen können auf der Website des immunologischen Genome Project gefunden werden. Zusätzlich zu den Oberflächenmarker der Wahl wird mit 1 ug eines Antikörpers gegen H-2K b verpflichtet, dem Cocktail SIINFEKL. Das im Handel erhältliche Antikörper Visualisierung von DCs i ermöglichenn, die der SIINFEKL Peptid gebunden ist, an die Oberfläche MHC Klasse I. </li><li> Zellen, die mit Oberflächen Antikörper inkubieren für 30 Minuten auf Eis. Schützen Platte aus Licht. Zentrifuge Platten bei 260 × g für 5 min und wäscht mit 2 ml PBS zweimal. Übertragen Zellen Zytometrie zur Analyse Strömungsrohre. </li></ol></li><li> Beurteilung der Impfstoff-spezifischen T-Zellproliferation <ol><li> Erhalten Spender-T-Zellen aus kommerziell erhältlichen TCR-transgene Mäuse (OT-I-Mäusen) (C57BL / 6-Tg (Tcr ATCRB) 1100Mjb / J), bei dem alle erzeugten CD8 T-Zellen spezifisch für das SIINFEKL-Peptid. Euthanize Mäusen durch Isofluran-Narkose durch Genickbruch folgte. Ernte Milz durch Ausführen eines Schnittes in der Bauchhöhle. Zeigen Milz / s in 2 ml DMEM / Milz und entfernen Binde- und Fettgewebe. </li><li> Generieren Einzelzellsuspensionen aus Milz nach der in 2.1.2 und 2.1.3 beschriebenen Verfahren. </li><li> Weiter bereichern die Einzelzellsuspension auf T-Zellen, gelten Magnetic Bead Separation Protokolleentweder mit positiven oder negativen Selektionsverfahren 12. Um Spender von Empfängerzellen zu unterscheiden, verwenden kongenen Mäusen, so dass beispielsweise Empfängermäuse drücken die Leukozytenmarker CD45.1 während Spender-T-Zellen exprimieren CD45.2 12. </li><li> T-Zellen zu markieren, inkubieren in 1 ml PBS, das 5 &amp; mgr; M Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) in einer optimalen Zelldichte von 5 x 10 6 Zellen / ml. Inkubieren Zellen für 20 min bei 37 ° C von Belichtung geschützt. Nach der Inkubation Zentrifuge Zellen bei 260 g für 5 min, Überstand verwerfen und Resuspension Zellen in 3 ml fötales Rinderserum (FBS) zu CFSE neutralisieren. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 260 · g während 10 min und resuspendieren in der adäquaten Volumen PBS, so dass 100 &amp; mgr; l-Lösung enthält 2 x 10 6 Zellen. Infundieren Empfänger kongenen Mäusen mit 2 x 10 6 Zellen / Maus über retro-orbitalen Sinus Einspritzung 13. </li><li> Euthanize Empfängermäuse an den Tagen 3, 4 und 5 post-Impfung mit Isofluran-Narkose durch Genickbruch folgte. Ernten Lymphknoten und bereiten Einzelzellsuspensionen für die Durchflusszytometrie als in 2.1.2-2.1.5 angezeigt. </li><li> Identifizieren Spenderzellen durch Färben der Einzelzellsuspensionen in 100 ul einer Antikörper-Cocktail, enthaltend: 0,25 ug anti-Maus-CD3, CD4 und CD8-Antikörper; 0,5 ug anti-Maus CD45.1 oder CD45.2-Antikörpers (abhängig von dem Phänotyp der Spenderzellen). Verlassen Sie die FL-1-Kanal des Durchflusszytometers offen (FITC), um die Verdünnung Profil CFSE 12 (2B) zu bestimmen. </li></ol></li></ol> 3. chimären Mäusen auf Gene-spezifischen Impfstoff Antworten Dissect HINWEIS: Die Erzeugung von Wettbewerbsknochenmarkchimären mit DTR-basierte Mausmodelle ermöglicht die Unterscheidung von zellspezifischen Funktionen während der Immunantwort auf Impfstoffe. Hier zeigen wir eine weitere Strategie, mit der Kombination von DTR-exprimierenden Spender cEllen mit Zellen von Knockout-Mäusen erlaubt die Gen-spezifischen Funktionen bei der Immunität in spezifische Zellkompartimente zu studieren. Im Beispiel erzeugen wir Mäuse mit spezifischen Deletion von Toll-like Rezeptor 3 (TLR3) in Langerin + CD103 + DCs. <ol><li> Herstellung von Knochenmarkspenderzellen <ol><li> Die Arbeiten im Rahmen einer Sicherheitsstufe II Schrank. Vermeiden Sie Verschmutzung durch die Verwendung ausschließlich im Autoklaven Instrumente. </li><li> Um Knochenmark chimären Mäuse zu generieren, verwenden kongenen CD45.1 + C57BL / 6 weiblichen Mäusen als Empfänger, und verwenden Sie TLR3 - / -, Langerin-DTR / EGFP oder Gew Mäusen, CD45.2 + als Spender. Verwendung kongenen Spender- und Empfänger-Mäusen erlaubt die Differenzierung von Spender- und Empfängerzellen mittels Durchflusszytometrie und dies ermöglicht engraftment bewertet werden. </li><li> Spenderknochenmarkszellen zu erhalten, einschläfern Spendermäusen mit Isofluran-Narkose durch Genickbruch folgte. Mit einer scharfen Schere durchführen Einschnitte um die Knöchel, so dass die mouse Muskulatur freiliegt. </li><li> Verwendung stumpfen Pinzette ziehen Maus Haut und Fell sanft vom Knöchel zur Hüfte hin, so dass die Beinmuskulatur zu sehen sind. </li><li> Mit einer scharfen Schere geschnitten Maus Beinen auf der Höhe der Hüfte und über dem Kopf des Oberschenkelknochens. </li><li> Platzieren Beine auf einer Petrischale und auf Eis. Arbeiten Sie schnell und entfernen Sie alle Muskeln, die Knochen freizulegen. </li><li> Separate Oberschenkelknochen und Schienbeinen. Platzieren Knochen in einer Lösung von 70% Ethanol für 5 Minuten, um mögliche Bakterien entfernen und sie sofort auf eine andere Petrischale mit 5 ml serumfreiem DMEM. Geschnitten Knochenenden mit einer scharfen Schere und spülen Sie das Knochenmark in das DMEM. Um so in den Knochen durch Einsetzen einer 26 G-Nadel in eine 5 ml Spritze befestigt tun, flush 1 ml DMEM. Stellen Sie sicher, die Knochen schauen weiß (leer) Nach dem Spülen. </li><li> Sammle alle Knochenmarkszellen aus Spendermäusen in 10 ml DMEM. Generieren Einzelzellsuspensionen von Knochenmarkzellen, indem man die Ernte durch einen 70 &amp; mgr; m Zellsieb. </li><li> ClOhreinzelzellsuspensionen von Knochenmarkzellen durch Zentrifugation bei 260 × g für 10 min bei 4 ° C in einer Kühlzentrifuge. Resuspendieren Zellpellet in 10 ml PBS. Abbau roter Blutkörperchen mit RbCl Lösung nach 2.1.3 und 2.1.4 beschrieben. </li><li> Graf Knochenmarkzellen unter Verwendung von entweder einer Zählkammer oder eines automatisierten Zellzählers. Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen durch Bestimmung der toten Zellen mittels Trypanblau-Färbung 13. Optimalerweise ein einziges Tier Erträge um 3 x 10 7 Leukozyten / Maus mit einer Tragfähigkeit von mindestens 80%. </li><li> Im Falle von Gesamtknochenmarkschimären, bereiten TLR-3 - / - oder Gew Spenderzellen. Die optimale Zellkonzentration 2 x 10 7 Zellen / ml, da 2 x 10 6 Zellen in 100 ul PBS für die Transplantation verwendet werden. Wenn es nicht sofort verwendet wird, zu erhalten Spenderzellen bei -80 ° C unter Verwendung von langsamen Einfrieren Techniken und FBS mit 10% DMSO. Für den gemischten Chimären-Modell, mischen Langerin-DTR-Spenderzellen und TLR3 - / - </sup&gt; Spenderzellen in einem Verhältnis von 75:25. Bereiten Sie eine Mischung von 75: 25 Langerin-DTR: Gew Knochenmarkszellen, die Kontrolle Mäuse zu erzeugen. </li></ol></li><li> Maus-Bestrahlung und Transplantation <ol><li> Bestrahlen weiblichen Mäusen von 6 - 8 Wochen in einem Cäsium-137 Quelle-Strahler. Geben Sie Mäusen zwei Dosen von 550 rad 4 Stunden auseinander. Split Bestrahlung minimiert akuten Lebertoxizität und reduziert somit Maus Letalität aufgrund der Bestrahlung Protokoll. </li><li> Nach der Bestrahlung halten Mäuse unter der Behandlung mit Antibiotika für zwei Wochen. Geben Antibiotika mit dem Trinkwasser in 2,5-5 mg Baytril / kg. </li><li> 2-4 Stunden nach der zweiten Bestrahlung, Transplantations Mäusen mit Spenderknochenmarkzellen intravenös. Führen die Injektion von Spenderzellen durch Retroorbitalsinus Einspritzung 13 und unter Isofluran-Narkose mit Maximalvolumen von 100 ul PBS, das 2 x 10 6 Zellen. </li><li> Vier Wochen nach der Transplantation, zu bewerten engraftment in einer Probe von 100ul peripheren Blut mittels Durchflußzytometrie unter Verwendung einer Maschine in der Lage, mindestens zwei Farben zu lesen. Um zwischen Spender und Empfänger Radio-resistente Zellen zu unterscheiden, verwenden Sie handelsüblichen Fluoreszenz-markierten CD45.1 und CD45.2 Anti-Maus-Antikörper unter Verwendung von Verdünnungen zwischen 1/100 und 1/200. Optimale Einwachsen von Spenderzellen sollte mindestens 80% der gesamten hämatopoetischen Zellen im peripheren Blut. </li></ol></li><li> Impfung und gezielte Verarmung <ol><li> Impfung von Mäusen mit rekombinanten attenuierten Influenza-Impfstoff intranasal über. Für Maus-Impfung, betäuben Mäuse mit 5% Isofluran in Sauerstoff unter Verwendung eines Präzisions-Verdampfer. Verwenden eine 200 ul-Pipette 50 ul PBS, enthaltend 10 3 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) der Vakzine zu verabreichen. </li><li> Um die endgültige Maus-Modell zu generieren, Behandlung von Mäusen mit 50 ng der DT in 50 ul PBS intranasal verdünnt. Verwalten DT tropfen direkt an den Nasenlöchern des narkotisierten Mäusen, wie in 3.3.1 beschrieben. Treat miCE mit Tagesdosen Beginn der Behandlung an Tag -2 vor der Impfung bis zum Tag 2 nach der Impfung (3B). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In dieser Studie beschreiben wir, wie reverse Genetik und chimären Maus-Modelle können verwendet werden, um die physiologischen und molekularen Mechanismen der Impfstoff-induzierte Immunität aufzuklären. Influenza reversen Genetik wird in vielen Laboren etabliert und hat eine Hauptrolle im Verständnis Influenza Pathogenese, Replikation und Getriebe 17 gespielt. Ein wichtiger Punkt in unserem Protokoll ist Rettung von kälteangepassten Grippeimpfstoffen Expression fremder Epitope. Während die Strategie d...

Die Erzeugung von immunologischen Gedächtnisses in Abwesenheit der Krankheit ist die physiologische Grundlage für die effektive Impfung 1. In jüngster Zeit Systeme biologischer Ansätze haben gezeigt, dass eine erfolgreiche Impfstoffe wie die Gelbfiebervakzin, induzieren eine starke Induktion der angeborenen Immunantwort und Aktivierung verschiedener Untergruppen von dendritischen Zellen (DCs), die wiederum führen zur Aktivierung der antigen multilineärer spezifische T-Zellen 2,3. Da DCs sind die einzigen Immunzellpopulation mit der Fähigkeit, Antigen-spezifische T-Zellen naive 4 zu aktivieren, ist die Untersuchung von deren Funktion bei der Impfung kritisch für die Immunantwort auf Impfstoffe zu verstehen und zukünftige Strategien gegen herausfordernde Pathogene zu entwickeln. Ein System, Rückverfolgung von verschiedenen DCs Teilmengen während der Immunantwort auf Impfstoffe wären wünschenswert, um eine genaue Kinetik der DC Migration auf lymphatischen Gewebe zu schaffen, und es daher,Einblick in die physiologischen Mechanismen für die Einleitung der Impfstoff-spezifischen adaptiven Immunität verantwortlich. Reverse Genetik basierte Ansätze bieten die Möglichkeit, modifizierte erzeugen attenuierten Impfstoffen, die experimentell mit diesem Zweck verwendet werden können. Seit ihrer Umsetzung am Influenza-Forschung hat Plasmid-basierte reversen Genetik weit verbreitet eingesetzt worden, um rekombinante Influenza-Stämme einschließlich LAIVs generieren. Standardprotokolle zur Rettung rekombinanten Influenza-Viren erfordern Mehr Transfektion von hoch transfektierbare Zelllinien mit AmbiSense Plasmide (Herstellung von positiven und negativen Sinn RNA), welche die acht Influenzavirus-Segmente sowie Verstärkung in eine permissive System wie Madin-Darby canine kidney ( MDCK-Zellen) und / oder Huhn embryonierten Eiern 5. Die Anwendung der reversen Genetik, molekulare Werkzeuge, um die Immunmechanismen der Impfung zu untersuchen erzeugen bleibt unerforscht. Die Erzeugungneuer Mausmodelle ermöglicht spezifische Depletion von Immunzellpopulationen, einschließlich DCs hat neue Möglichkeiten eröffnet, um die grundlegenden Immunmechanismen durch Impfung hervorgerufen Schutz zugrunde zu verstehen. Der Vergleich zwischen DC Teilfunktionen in Mäusen und Menschen haben gezeigt, dass, in einem großen Ausmaß, Maus und Mensch DCs sind funktionell homolog 6,7 diese Ergebnisse stark darauf hin, dass die Entwicklung eines Maus-Modelle erlauben spezifische Depletion der DC in dem stationären Zustand und bei entzündlichen Erkrankungen, kann dazu dienen, die Physiologie der DC Reaktionen in Menschen zu verstehen. In den letzten Jahren eine Reihe von Mausmodelle erzeugt worden Durchführung Transgene Simian Diphtherietoxin (DT) Rezeptor (DTR) unter der Kontrolle der Promotorregion eines Gens von Interesse exprimieren 8,9. Seit Mausgeweben nicht natürlich auszudrücken DTR, diese Modelle zu ermöglichen bedingte Erschöpfung der Zell-Untergruppen trägt die gezielte Gen von Interesse auf der Maus Inokulation mit DT. Damit unsere ability, spezifische DCs und anderen Leukozyten in vivo bei physiologischen Prozessen führen, wurde stark von der Entwicklung der DTR-basierten ro verbessert. Während jedoch diese transgenen Mausmodelle sind sehr häufig benutzt worden, um die Ontogenese des Immunsystems zu verstehen, deren Anwendung auf die Entwicklung von Impfstoffen wurde kaum getestet. Hier wird durch die Kombination von Influenza reversen Genetik und DTR-basierten Wettbewerbsknochenmarkchimären, schlagen wir eine Methode, um die Kinetik der Impfstoff die Immunität als auch einzelne Gen-Funktion während der Immunantwort auf Impfstoffe in vivo zu untersuchen. Die Anwendung dieser Technologie für die präklinische Evaluierung neuer Impfstoffe gegen Infektionskrankheiten anspruchs könnte helfen, Impfstoffentwicklung zu rationalisieren und Impfstoffkandidaten in vivo zu testen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Modified Eagle Medium (DMEM 1X)</td>
			<td>Gibco RL-Life Technologies</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti MEM</td>
			<td>Gibco RL-Life Technologies</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen-Life Technologies</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>p11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonated eggs</td>
			<td>Valo biomedia Gmbh</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M Nylon Filters</td>
			<td>Greiner-Biorad</td>
			<td>542-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Anti-mouse CD11c (HLA3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-5321-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Anti-mouse CD45.1 (A20)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0453-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0081-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7-Anti-mouse CD3&#949; (145-2611)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0041-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE Proliferation dye</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 2.5%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymethil-Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin&#160;</td>
			<td>Molecular probes&#160;</td>
			<td>O23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria Toxin (DT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-TPCK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACsCanto II Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo cell analysis software 9.5</td>
			<td>Flowjo inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automatic Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen-Life Technologies</td>
			<td>C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intranasal administration of recombinant influenza vaccines in chimeric mouse models to study mucosal immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

Erzeugung rekombinanter abgeschwächter Lebendinfluenzaimpfstoffe können durch Transfektion von Plasmiden, die die acht Segmente der Influenza-Virus unter der Kontrolle des bidirektionalen Promotoren 5 kodierende Gene erreicht werden. Ein kälteangepassten Influenza-Impfstoff enthält üblicherweise sechs Segmenten eines kälteangepassten Stamm sowie die HA und NA von Influenza-Stamm der Wahl (zB H1N1) (1A). Das Prinzip der Kälteadaptierung an virus beschränkt Replikation bei 33 ?...

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Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Die intranasale Verabreichung von rekombinantem Influenza Vaccines in chimären Maus-Modelle zu Mucosale Immunität Studieren

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

intranasal-administration-recombinant-influenza-vaccines-chimeric

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K Aufrufe.  Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology. There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Serie: Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide variety of pathogens 1-3. Since the mammalian cell system is capable of post-translational modification, thus forming properly folded and glycosylated proteins, recombinant proteins expressed in mammalian cells have shown the greatest potential to maintain high antigenicity and immunogenicity 4-6.
Although no new cases of SARS have been reported since 2004, future outbreaks are a constant threat; therefore, the development of vaccines against SARS-CoV is a prudent preventive step and should be carried out. The RBD of SARS-CoV S protein plays important roles in receptor binding and induction of specific neutralizing antibodies against virus infection 7-9. Therefore, in this protocol, we describe novel methods for developing a RBD-based subunit vaccine against SARS. Briefly, the recombinant RBD protein (rRBD) was expressed in culture supernatant of mammalian 293T cells to obtain a correctly folded protein with proper conformation and high immunogenicity 6. The transfection of the recombinant plasmid encoding RBD to the cells was then performed using a calcium phosphate transfection method 6,10 with some modifications. Compared with the lipid transfection method 11,12, this modified calcium phosphate transfection method is cheaper, easier to handle, and has the potential to reach high efficacy once a transfection complex with suitable size and shape is formed 13,14. Finally, a SARS pseudovirus neutralization assay was introduced in the protocol and used to detect the neutralizing activity of sera of mice vaccinated with rRBD protein. This assay is relatively safe, does not involve an infectious SARS-CoV, and can be performed without the requirement of a biosafety-3 laboratory 15.
The protocol described here can also be used to design and study recombinant subunit vaccines against other viruses with class I fusion proteins, for example, HIV, respiratory syncytial virus (RSV), Ebola virus, influenza virus, as well as Nipah and Handra viruses. In addition, the methods for generating a pseudovirus and subsequently establishing a pseudovirus neutralization assay can be applied to all these viruses.

This protocol describes a general procedure for studying recombinant receptor-binding domain (RBD)-based subunit vaccines against SARS. It includes methods for transfection and expression of RBD protein in 293T cells, immunization of mice with RBD and detection of neutralization activity of mouse sera using an established SARS pseudovirus neutralization assay.

Protokoll für die rekombinante RBD-basierte Impfstoffe SARS: Protein Preparation, Animal Impfung und Neutralisation Erkennung

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. The NALT are two parallel bell-shaped structures located in the nasal passages above the hard palate, and are usually considered to be secondary components of the mucosal-associated lymphoid system4-6. Located within the NALT are discrete compartments of B and T lymphocytes interspersed with antigen-presenting dendritic cells4,7,8. These cells are surrounded by an epithelial cell layer intercalated with M-cells that are responsible for antigen retrieval from the mucosal surfaces of the air passages9,10. Naive lymphocytes circulating through the NALT are poised to respond to first encounters with respiratory pathogens7. While NALT disappear in humans by the age of two years, the Waldeyer's Ring and similarly structured lymphatic organs continue to persist throughout life6. In contrast to humans, mice retain NALT throughout life, thus providing a convenient animal model for the study of immune responses originating within the nasal sinuses11.
Cultures of single-cell suspensions of NALT are not practical due to low yields of mononuclear cells. However, NALT biology can be examined by ex vivo culturing of the intact organ, and this method has the additional advantage of maintaining the natural tissue structure. For in vivo studies, genetic knockout models presenting defects limited to NALT are not currently available due to a poor understanding of the developmental pathway. For example, while lymphotoxin-&alpha; knockout mice have atrophied NALT, the Peyer's patches, peripheral lymph nodes, follicular dendritic cells and other lymphoid tissues are also altered in these genetically manipulated mice12,13. As an alternative to gene knockout mice, surgical ablation permanently eliminates NALT from the nasal passage without affecting other tissues. The resulting mouse model has been used to establish relationships between NALT and immune responses to vaccines1,3. Serial collection of serum, saliva, nasal washes and vaginal secretions is necessary for establishing the basis of host responses to vaccination, while immune responses originating directly from NALT can be confirmed by tissue culture. The following procedures outline the surgeries, tissue culture and sample collection necessary to examine local and systemic humoral immune responses to intranasal (IN) vaccination.

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Methods to examine contributions of the nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) to nasal and systemic immune responses of mice to intranasal vaccines are described. We demonstrate a surgical procedure to establish a NALT-dependent mouse model and ex vivo cultures of extracted NALT.

Überprüfung der Rolle der Nasopharynx-assoziierte lymphoide Gewebe (NALT) in Maus auf Impfstoffe

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophilen-Isolierung und Analyse zur Bestimmung ihrer Rolle in der Lymphom-Zellempfindlichkeit therapeutische Mittel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

Intratracheale Verabreichung von<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In Mausmodelle zur Untersuchung Atemwegsentzündung

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

Die protektive Wirksamkeit und pulmonale Immunantwort nach subkutaner und intranasale BCG Verabreichung an Mäuse

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...