We thank Sergio G&#243;mez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.

동물 실험은 승인 된 프로토콜과 독일의 동물 보호 법률의 지침을 따라 수행 하였다. 동물 실험을 수행하는 모든 직원은 카테고리 B 또는 유럽 실험 동물 과학 연맹의 C에 따라 훈련 프로그램을 통과시켰다. 역 유전학에 의해 재조합 약독 화 인플루엔자 백신의 1 세대 참고 : 역 유전학에 의해 재조합 인플루엔자 바이러스의 생성에 대한 자세한 프로토콜은 이전의 연구 (5)에 의해 설명이 보고서의 범위를 벗어나있다. 간단히, 추위에 적응 인플루엔자 백신 (CAV)의 구조는 바이오 안전성 수준에 따라 바이오 안전성 클래스 II 캐비닛 2 (BSL2) 봉쇄를 수행하고, 아래에 자세히 단계를 포함한다. 형질 감염 프로토콜의 다음 마르티네즈 - Sobrido 등. 5. <ol><li> 재조합 체 감기 적응 인플루엔자를 생성배경으로 냉 적응 된 균주 A / Ann 나무 / 60분의 6 (H2N2)뿐만 아니라, 헤 마글 루티 닌 (HA)과 변형 뉴 라미니다 제 (NA)를 A / PR / 8 / 34 (H1N1) 균주 (사용 백신 도 1a). NA 유전자 변형 닭의 난백 알부민 (OVA) 유래 펩타이드 SIINFEKL (그림 1B)를 암호화하는 짧은 cDNA 서열에 의한 단백질 줄기 (잔류 65-72)에 보존 시퀀스의 PCR 기반의 교체로 구성되어 있습니다. SIINFEKL 펩티드는 C57BL / 6 생쥐 (12)의 응답이 I 제한된 H-2B MHC 클래스의 문맥에서 매우 면역 펩티드이다. </li><li> 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / E)이 보충 된 DMEM, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 사용하여 6 웰 플레이트에 웰 당 접시 106 293T 세포. </li><li> 플라스미드 형질 전환 혼합물을 준비합니다 추가 NA 인코딩 PB2, PB1, PA, NP, M, NS 인플루엔자 A / 앤아버 / 60분의 6 변형에 대한 cDNA를하고 플라스미드의 1 μg의를 암호화하는 플라스미드 각각 1 μg의 -SIINFEKL과인플루엔자 A / PR / 8 / 34에서 HA. (/ 잘 100 μL의 최종 부피 15 μl를) 티멤를 미리 예열 추가. </li><li> RT에서 30 분 동안 형질 믹스 부화. </li><li> 잘 / 형질 믹스 100 μl를 추가하고 37 ℃에서 16 시간, 5 % CO 2 품어. </li><li> 5 시간 동안 CO 2를 33 ℃에서 DMEM 0.3 % BSA 1 % P / E로 세포 매체를 변경하고 5 %. </li><li> L-1-Tosylamide -2- 페닐 에틸 클로로 메틸 케톤 (TPCK-트립신)으로 처리 소 췌장 트립신의 1 ㎍ / ㎖의 DMSO를 함유하는 10 6 인플루엔자 허용 MDCK 세포를 추가한다. 33 ℃에서 3 일, 5 % CO 2 - 2 293T - MDCK 공동 문화를 유지한다. </li><li> 5 분 260 XG에서 원심 분리하여 MDCK-293T 세포의 공동 문화의 상층 액과 명확한를 수집합니다. </li><li> 멸균 조건 10 일 된 닭 유정란 - 9 접종. 마르티네스-Sobrido 등에 의해 나타낸 바와 같이,이를 위해, 껍질의 상부에 구멍을 만든다. 5. </li><li> 달걀 껍질 기지를 커버시간은 면봉을 사용하여 33 ℃에서 3 일간 접종 닭 알을 품어 왁스를 용융. </li><li> 감염된 유정란에서 막액을 수확 : 70 % 에탄올로 달걀 껍질을 씻으십시오. 아주 부드럽게 상부에 균열 및 멸균 집게를 사용하여 뇨 막을 제거와 계란을 엽니 다. (- 10 ml의 일반적으로 6) 가능한 한 많은 유체를 수집하기 위해 10 ML의 피펫을 사용합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 260 XG에 원심 분리기 새로운 튜브로 뇨 삭제 유체를 전송합니다. </li></ol> 2. 추적 백신 별 내성 <ol><li> 펩타이드 함유 수지상 세포의 추적 (DCS) <ol><li> 마우스 접종, 정밀 기화기를 사용 산소 5 % 이소 플루 란으로 마취 된 마우스. 마우스 콧 구멍에 직접 방울을 통해 SIINFEKL 펩타이드를 발현하는 백신의 10 3 플라크 형성 단위 (PFU)를 포함하는 PBS의 50 μl를 관리하는 200 μL 피펫을 사용합니다. </li><li> 백신 접종 후, euthaniz 세 일이소 플루 란 마취를 통해 E 마우스는 경추 탈구시켰다. </li><li> 단지 집게로 흉곽 아래의 중간 선에서 마우스 피부를 들어 올리고 가위로 피부를 통해 작은 절개를 잘라. 5cm 길이 양쪽 끝에서 옆으로 중간 선에서 다음, 머리와 꼬리 양쪽을 향해 피부를 통해 두 2cm의 절개를 잘라 - 절개의 관점에서, 3합니다. 껍질은 다시 피부는 복막과 흉부 충치를 공개합니다. 조심스럽게 가슴을 노출 복막을 둘러싼 세포막을 통해 잘라. </li><li> 종격동이 diafragma와 케이지 리브의 바닥을 잘라 액세스 할 수 있습니다. 약간 지느러미와 기관의 복부 측면에 가까운, 완두 동맥 내측에 인접, 흉선에 횡 방향으로 인접 찾기 및 2 종격동 림프절 (mLNs)를 제거합니다. </li><li> mLNs는 곡선 집게를 사용하여 수확합니다. 림프절 아래 집게를 놓고 부드럽게를 당깁니다. DMEM 1ml를 포함하는 6 웰 플레이트에서 림프절을 배치하고 접속 .. 제거적이거나 지방 조직 주변 노드. <ol><li> 1 ml의 주사기에 부착 된 두 개의 26 G 바늘로 완전히 각각의 샘플을 애무 해줘. 다른 바늘 림프 노드를 엽니 다 파괴하면서 림프절을 애타게, 하나의 바늘을 누르고 있습니다. 이것이 제대로하면 림프절에서 붕괴 농축 세포를 배지에서 쉽게 관찰된다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 70 ㎛의 나일론 필터를 통해 모든 조직 재료를 전달. </li></ol></li><li> 냉장 원심 분리기 260 XG에 10 분 동안 원심 분리기 단일 세포 현탁액. 적혈구를 용해시키기 위해 적혈구 용균 (RBCL) 완충액 2 ㎖로 세포 펠렛을 재현 탁. 용해는 실온에서 3 분간 할 수있게합니다. </li><li> 얼음 - 냉각 PBS로 2 ㎖를 원심 분리하고 세포를 재현 탁 통해 RBCL 버퍼 중화. </li><li> 플레이트에 세포를 100 μL의 최종 부피 107 세포 / ml의 농도로 96 웰 플레이트를 U 자형. </li><li> 분석 블록 셀의 Fc- 수용체를 이용한 유동 세포 계측법얼음에 15 분 동안 10 6 세포 당 항 마우스 CD16 / CD32 항체의 1 μg의. </li><li> 원심 분리기 플레이트와 플레이트 쓸어 넘겨 상층 액을 버린다. 선택의 표면 항체 조합으로 개별 우물을 품어. 일반적으로 림프절에서 수지상 세포의 검출, 항체 칵테일은 다음을 포함한다 : 0.25 방지하는 CD11c의 μg의, CD11b를 0.25 μg의, MHC 클래스 II의 0.5 μg의, CD103의 0.25 μg의 100의 최종 부피에 CD8α 0.15 μg의를 μL. </li><li> 음의 게이트를 들어, 항 CD3, CD19, NK1.1 또는 혈통 칵테일 (그림 2A)의 0.25 μg의를 추가합니다. 대체 게이팅 전략뿐만 아니라 다수의 형광 염료의 적절한 보상을위한 프로토콜은 면역 게놈 프로젝트의 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다. 원하는 표면 마커 이외에도, 칵테일에 SIINFEKL 수밖에 H-2K의 B에 대한 항체 1 μg의 추가. 이 상업적으로 이용 가능한 항체는 DC가 난의 시각화 수 있습니다SIINFEKL 펩타이드가 MHC 클래스 I.를 표면에 결합되는 N </li><li> 얼음에 30 분 동안 표면 항체와 세포를 품어. 빛 플레이트를 보호합니다. 260 XG에 원심 분리기 판 5 분 동안 PBS로 두 번 2 ㎖로 세척한다. 분석을 위해 세포 계측법 튜브 흐름 세포를 전송합니다. </li></ol></li><li> 백신 특이 T 세포 증식의 평가 <ol><li> 시판 TCR 유전자 변형 마우스 (OT-I 마우스)로부터 공여 T 세포를 구하는 (C57BL / 6-TG와 (TCR aTcrb) 1100Mjb / J)가있는 모든 생성 CD8 T 세포 SIINFEKL 펩타이드에 특이. 자궁 경부 전위 다음 이소 플루 란 마취로 쥐를 안락사. 복강에 절개를 수행하여 수확 비장. DMEM / 비장의 2 ml의 비장 / S를 놓고 결합과 지방 조직을 제거합니다. </li><li> 2.1.2 및 2.1.3에 기술 된 절차에 따라, 비장으로부터 단일 세포 현탁액을 생성한다. </li><li> 상기 T 세포의 단일 세포 현탁액을 농축, 자기 비드 분리 프로토콜을 적용양 또는 음의 선택 절차 (12)를 사용. 받는 사람 세포에서 기증자를 차별화 기증자 T 세포가 CD45.2 12 표현 예를 들어받는 사람 마우스 백혈구 마커 CD45.1을 표현할 수 있도록 congenic 마우스를 사용합니다. </li><li> T 세포를 레이블링하기 위해 5 × 106 세포 / ml의 최적의 셀 밀도에 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE) 5 μM을 함유하는 1 ml의 PBS에서 그들을 부화. 빛 노출로부터 보호 37 ℃에서 20 분 동안 세포를 품어. 배양 후, 3 ml의 소 태아 혈청 (FBS) 5 분, 폐기 상등액 재현 탁하고 세포를 260 XG에 원심 세포 CFSE 중화. </li><li> PBS의 적절한 볼륨에서 10 분, 재현 탁 동안 260 XG에 원심 분리기 세포 용액 100 ㎕를 2 × 10 6 세포를 함유하도록. 2 × 10 6 세포 / 복고풍 궤도 동 주사 (13)를 통해 마우스를 사용하여받는 사람 congenic 쥐를 달이다. </li><li> 일 3, 4 및 5에서 수신자 사후 마우스를 안락사자궁 경부 전위 다음 이소 플루 란 마취를 사용하여 예방 접종. 종격동 림프절을 수확하고 2.1.2-2.1.5에 표시된 유동 세포 계측법에 대한 단일 세포 현탁액을 준비합니다. </li><li> 포함한 항체 칵테일 100 ㎕의 단일 세포 현탁액을 염색하여 공여 세포를 식별 : 항 - 마우스 CD3, CD4 및 CD8 항체를 0.25 μg의; 항 - 마우스 또는 CD45.1 CD45.2 항체 (공여 세포의 표현형에 따라) 0.5 μg의. CFSE (12) (그림 2B)의 희석 프로파일을 결정하기 위해 열린 (FITC) 흐름 cytometer의 FL-1 채널을 남겨주세요. </li></ol></li></ol> 유전자 특정 백신 응답을 해부 3. 키메라 마우스 주 : DTR 계 마우스 모델을 사용하여 경쟁 골수 키메라의 생성은 백신에 대한 면역 반응 동안 셀 고유 함수의 차별을 허용한다. 여기에서 우리는의 조합에 의해 기증자 C를 DTR 발현 추가 전략을 보여녹아웃 쥐 허가의 세포와 ELL 학생은 특정 세포 구획에서 면역 유전자 중 특정 기능을 연구한다. 예에서 우리는 Langerin + CD103 + 수지상의 수신자 같은 수용체 3 (TLR3)의 특정 삭제와 마우스를 생성합니다. <ol><li> 골수 공여 세포의 제조 <ol><li> 바이오 안전성 레벨 II 장에서 작업 할 수 있습니다. 독점적으로 멸균 악기를 사용하여 오염을 피하십시오. </li><li> 골수 키메라 쥐를 생성받는 사람으로 congenic CD45.1 + C57BL / 6 암컷 마우스를 사용 TLR3 사용 - / -, Langerin-DTR / EGFP, 또는 중량 마우스 기증자로 CD45.2 +를 표현합니다. congenic 기증자와받는 사람 마우스를 사용하여 유동 세포 계측법을 통해 기증자와받는 사람 세포의 분화를 허용하고이 생착을 평가 할 수 있습니다. </li><li> , 기증자의 골수 세포를 얻기 자궁 경부 전위 다음 이소 플루 란 마취와 기증자 쥐를 안락사합니다. 날카로운 가위는 발목 주위에 절개를 수행으로 M 있도록여러개 근육이 노출되어있다. </li><li> 그 다리 근육이 표시되도록 사용 무딘 집게는 엉덩이쪽으로 발목에서 부드럽게 마우스 모피를 당깁니다. </li><li> 날카로운 가위로 엉덩이의 높이와 대퇴골의 머리 위에 마우스 다리를 잘라. </li><li> 배양 접시에 얼음에 다리를 놓습니다. 빠른 작업과 뼈를 노출하는 모든 근육을 제거합니다. </li><li> 별도의 대퇴골과 경골. 가능한 세균을 제거하고 무 혈청 DMEM 5 ㎖를 함유하는 다른 페트리 접시에 즉시 배치를 5 분 동안 70 % 에탄올 용액에서 뼈를 놓는다. 잘라 뼈는 DMEM으로 골수를 날카로운 가위를 사용하여 세척 끝납니다. 5 ML의 주사기에 부착 된 26 G 바늘을 삽입하여 뼈에, 그래서 DMEM의 플러시 1 ml의 작업을 수행합니다. 뼈는 세척 후에는 흰색 (빈)보고해야합니다. </li><li> DMEM 10ml에 공여 마우스의 모든 골수 세포를 수집. 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 수확 전달하여 골수 세포의 단일 세포 현탁액을 생성한다. </li><li> CL냉장 원심 분리기에서 4 ° C에서 10 분 동안 260 XG에서 원심 분리하여 골수 세포의 귀 단일 세포 현탁액. PBS 10 ㎖에 재현 탁 된 세포 펠렛. 2.1.3 및 2.1.4에 기술 된 바와 같이 RBCL 용액을 사용하여 적혈구를 고갈. </li><li> 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 골수 세포를 카운트. 트리 판 블루 염색 (13)를 통해 죽은 세포의 결정에 의해 세포 생존 능력을 평가합니다. 최적으로는 적어도 80 %의 생존율을 가진 하나의 동물 수율 약 3 × 107 개의 백혈구 세포 / 마우스. </li><li> - / - 또는 중량 공여 세포 전체 골수 키메라의 경우, TLR-3을 제조. PBS 100 ㎕에서 2 × 106 세포는 이식을 위해 사용되기 때문에 최적의 세포 농도를 2 × 107 세포 / ㎖이다. 즉시 사용하지 않으면, 10 % DMSO로 느린 냉동 FBS 및 기법을 사용하여 -80 ° C에서 공여 세포를 보존. 혼합 된 키메라 모델 들어 Langerin-DTR 공여자 세포와 혼합 TLR3 - / - </sup&gt; 75:25 비율 공여 세포. 대조군 마우스를 생성하기 위해 골수 세포 중량 25 Langerin-DTR : 75의 혼합을 준비한다. </li></ol></li><li> 마우스 조사 및 이식 <ol><li> 세슘 137 소스 조사기 연령의 6~8주 사이의 여성 쥐를 조사. 쥐에게 떨어져 550 RAD 4 시간의 두 가지 용량을 제공합니다. 분할 조사는 급성 간 독성을 최소화하고, 따라서 조사 프로토콜에 의한 마우스의 치사율을 감소시킨다. </li><li> 조사 후, 2 주 동안 항생제로 치료에서 쥐를 유지한다. Baytril / ㎏의 5 mg의 - 2.5에서 식수와 항생제를주십시오. </li><li> 2 - 두 번째 조사 후 4 시간, 정맥 기증자의 골수 세포 이식 마우스. 2 × 106 세포를 함유하는 PBS 100 ㎕의 최대 음량을 사용하여 레트로 안와 분사 (13)를 통해 이소 플루 란 마취하에 공여 세포의 주입을 수행한다. </li><li> 네 개의 주 이식 후, (100)의 샘플을 평가 생착적어도 두 가지 색상을 판독 할 수있는 기계를 사용하여 유세포 분석을 통해 말초 혈액 μL. 시중에서 판매하는 형광 표지 CD45.1 및 1/100과 1/200 사이에 희석을 사용 CD45.2 항 마우스 항체를 사용, 기증자와 라디오 방지받는 사람 세포를 구분합니다. 공여 세포의 생착 최적의 말초 혈액에서 전체 조혈 세포의 적어도 80 %이어야한다. </li></ol></li><li> 예방 접종 대상이 고갈 <ol><li> 비강을 통해 재조합 라이브 감쇠 인플루엔자 백신과 쥐를 예방 접종. 마우스 접종, 정밀 기화기를 사용 산소 5 % 이소 플루 란으로 마취 된 마우스. 백신의 10 3 플라크 형성 단위 (PFU)를 포함하는 PBS의 50 μl를 관리하는 200 μL 피펫을 사용합니다. </li><li> 최종 마우스 모델을 생성하기 위해, 비강 PBS의 50 μL에 희석 DT 50 NG와 쥐를 치료​​. 3.3.1에 ​​설명 된대로 마취 된 쥐의 콧 구멍에 직접 강하에 의한 DT 드롭을 관리 할 수​​ 있습니다. 취급의 미2 일 백신 접종 후 (그림 3B)까지 예방 접종 전날 -2에 치료를 시작 매일 복용과 CE. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

본 연구에서는 백신 유발 면역 생리학 및 분자 메커니즘을 규명하기 위해 이용 될 수있는 방법을 역 유전학 및 키메라 마우스 모델을 설명한다. 인플루엔자 역 유전학은 많은 실험실에서 설립 및 인플루엔자 발병 기전, 복제 및 전송 (17)을 이해하는데 주요한 역할을하고있다. 우리의 프로토콜의 핵심은 외국 항원을 표현 추위 적응 인플루엔자 백신의 구조입니다. 뉴 라미의 줄기로 짧은 cD...

질병의 부재하에 면역 학적 기억의 발생이 효율적으로 접종 한 생리 기초이다. 최근, 시스템 생물학 기반의 접근 방식은 이러한 황열병 백신 성공적인 백신, 차례로, 리드 항원의 활성화를 multilineage하는 선천성 면역 반응과 수지상 세포 (DCS)의 여러 부분 집합의 활성화 강력한 유도를 유도하는 것으로 밝혀졌다 특정 T 세포 2,3-. DC가 항원 특이 나이브 T 세포 (4)를 활성화 할 수있는 능력을 가진 경우에만 면역 세포 집단이므로, 예방 접종 동안 그들의 기능의 연구는 백신에 대한 면역 반응을 이해하고 도전 병원균 미래 전략을 설계하는 것이 중요하다. 백신에 대한 면역 반응시 DC가 다른 서브 세트들의 추적을 허용하는 시스템을 제공하는 것이다 림프 조직으로 DC 이동의 정확한 동력학을 설정하기 위해 바람직하고, 것백신 특정 적응성 면역 개시 할 책임 생리 메커니즘 통찰력. 유전학을 기반 역방향 접근 방식은 가능성이 수정 생성이 목적으로 실험적으로 사용할 수있는 생균 백신을 제공합니다. 인플루엔자 연구에 구현하기 때문에, 플라스미드 - 기초 역 유전학 널리 LAIVs 포함한 재조합 인플루엔자 균주를 생성하기 위해 사용되어왔다. 표준 프로토콜은 (재조합 인플루엔자 바이러스는 Madin-다비 개과의 신장과 같은 허용 시스템에서의 증폭뿐만 아니라 여덟 인플루엔자 바이러스 분절을 함유 ambisense 플라스미드 매우 형질 세포주 (포지티브 및 네거티브 센스 RNA 모두 제조)의 다 형질을 필요 구출 MDCK) 세포 및 / 또는 닭 유정란 5. 그러나, 백신의 면역 기전을 연구하기 위해 분자 도구를 생성하는 역 유전학의 적용은 비경 남아있다. 세대수지상 세포를 포함하는 면역 세포 하위 집합의 특정 고갈을 허용하는 새로운 마우스 모델, 백신 유도 보호의 기초가되는 기본 면역 메커니즘을 이해하는 새로운 가능성을 열었다. 마우스와 인간에서의 DC 서브 세트 함수 사이의 비교는 크게, 마우스 및 인간 DC가 강하게 상동 기능적 이러한 발견 -6,7-있는 마우스 모델의 개발은 정상 상태의 DC 특이 공핍을 허용하는 것이 제안 것을 밝혔다 염증 상태 동안, 인간 DC 응답의 생리를 이해 될 수있다. 최근 마우스 모델의 수는 8,9 관심의 유전자의 프로모터 영역의 제어하에 유인원 디프테리아 독소 (DT) 수용체 (DTR)를 발현하는 유전자를 운반 생성되었다. 마우스 조직 자연스럽게 DTR을 표현하지 않기 때문에,이 모델은 DT와 마우스 접종에 따라 관심의 대상으로 유전자를 운반하는 세포의 부분 집합의 조건 고갈을 할 수 있습니다. 따라서, 우리의 abili생리 학적 과정에서 생체 내에서 특정 수지상 등의 백혈구를 소모하는 타이는 크게 DTR 기반 RO의 개발에 의해 향상되었습니다. 이들 트랜스 제닉 마우스 모델은 면역계의 개체 발생을 이해하기 위해 광범위하게 사용되었지만 그러나, 백신 개발에 따라 적용이 부족하게 테스트되지 않았다. 여기서, 인플루엔자 역 유전학 DTR 기반 경쟁 골수 키메라를 결합함으로써, 우리는 생체 내에서 백신에 대한 면역 반응 동안 백신 면역뿐만 아니라 개개의 유전자 기능의 동역학을 연구하는 방법을 제안한다. 도전 감염성 질병에 대한 새로운 백신의 임상 평가를 위해이 기술의 응용은 백신 설계 합리화 및 생체 내 백신 후보를 테스트하는 데 도움이 될 수.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Modified Eagle Medium (DMEM 1X)</td>
			<td>Gibco RL-Life Technologies</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti MEM</td>
			<td>Gibco RL-Life Technologies</td>
			<td>31985-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen-Life Technologies</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td>
			<td>PAA</td>
			<td>p11-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryonated eggs</td>
			<td>Valo biomedia Gmbh</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;M Nylon Filters</td>
			<td>Greiner-Biorad</td>
			<td>542-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2)</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>141605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Anti-mouse CD11c (HLA3)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-5321-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Anti-mouse CD45.1 (A20)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0453-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>562130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>46-0081-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-Cy7-Anti-mouse CD3&#949; (145-2611)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>48-0041-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE Proliferation dye</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baytril 2.5%</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>65-0850-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dymethil-Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin&#160;</td>
			<td>Molecular probes&#160;</td>
			<td>O23020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphteria Toxin (DT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-TPCK</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACsCanto II Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo cell analysis software 9.5</td>
			<td>Flowjo inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automatic Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen-Life Technologies</td>
			<td>C10227</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intranasal administration of recombinant influenza vaccines in chimeric mouse models to study mucosal immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

재조합 인플루엔자 생균 백신의 생성은 양방향 5 프로모터의 제어하에 인플루엔자 바이러스의 8 세그먼트를 코딩하는 플라스미드의 형질 감염에 의해 달성 될 수있다. 추위에 적응 된 인플루엔자 백신은 일반적으로 감기에 적응 변형뿐만 아니라 선택의 인플루엔자 균주의 HA 및 NA (예, H1N1) (그림 1A)의 여섯 세그먼트가 포함되어 있습니다. 냉 적응의 원리는 33 ° C, 마우?...

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Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

intranasal-administration-recombinant-influenza-vaccines-chimeric

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.4K 조회수.  Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology. There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

비디오: Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

연구

면역학 및 감염병학

Protocol for Recombinant RBD-based SARS Vaccines: Protein Preparation, Animal Vaccination and Neutralization Detection

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide variety of pathogens 1-3. Since the mammalian cell system is capable of post-translational modification, thus forming properly folded and glycosylated proteins, recombinant proteins expressed in mammalian cells have shown the greatest potential to maintain high antigenicity and immunogenicity 4-6.
Although no new cases of SARS have been reported since 2004, future outbreaks are a constant threat; therefore, the development of vaccines against SARS-CoV is a prudent preventive step and should be carried out. The RBD of SARS-CoV S protein plays important roles in receptor binding and induction of specific neutralizing antibodies against virus infection 7-9. Therefore, in this protocol, we describe novel methods for developing a RBD-based subunit vaccine against SARS. Briefly, the recombinant RBD protein (rRBD) was expressed in culture supernatant of mammalian 293T cells to obtain a correctly folded protein with proper conformation and high immunogenicity 6. The transfection of the recombinant plasmid encoding RBD to the cells was then performed using a calcium phosphate transfection method 6,10 with some modifications. Compared with the lipid transfection method 11,12, this modified calcium phosphate transfection method is cheaper, easier to handle, and has the potential to reach high efficacy once a transfection complex with suitable size and shape is formed 13,14. Finally, a SARS pseudovirus neutralization assay was introduced in the protocol and used to detect the neutralizing activity of sera of mice vaccinated with rRBD protein. This assay is relatively safe, does not involve an infectious SARS-CoV, and can be performed without the requirement of a biosafety-3 laboratory 15.
The protocol described here can also be used to design and study recombinant subunit vaccines against other viruses with class I fusion proteins, for example, HIV, respiratory syncytial virus (RSV), Ebola virus, influenza virus, as well as Nipah and Handra viruses. In addition, the methods for generating a pseudovirus and subsequently establishing a pseudovirus neutralization assay can be applied to all these viruses.

This protocol describes a general procedure for studying recombinant receptor-binding domain (RBD)-based subunit vaccines against SARS. It includes methods for transfection and expression of RBD protein in 293T cells, immunization of mice with RBD and detection of neutralization activity of mouse sera using an established SARS pseudovirus neutralization assay.

재조합 RBD 기반 SARS 백신에 대한 프로토콜 : 단백질 준비, 동물 예방 접종 및 중화 감지

Based on their safety profile and ability to induce potent immune responses against infections, subunit vaccines have been used as candidates for a wide ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. The NALT are two parallel bell-shaped structures located in the nasal passages above the hard palate, and are usually considered to be secondary components of the mucosal-associated lymphoid system4-6. Located within the NALT are discrete compartments of B and T lymphocytes interspersed with antigen-presenting dendritic cells4,7,8. These cells are surrounded by an epithelial cell layer intercalated with M-cells that are responsible for antigen retrieval from the mucosal surfaces of the air passages9,10. Naive lymphocytes circulating through the NALT are poised to respond to first encounters with respiratory pathogens7. While NALT disappear in humans by the age of two years, the Waldeyer's Ring and similarly structured lymphatic organs continue to persist throughout life6. In contrast to humans, mice retain NALT throughout life, thus providing a convenient animal model for the study of immune responses originating within the nasal sinuses11.
Cultures of single-cell suspensions of NALT are not practical due to low yields of mononuclear cells. However, NALT biology can be examined by ex vivo culturing of the intact organ, and this method has the additional advantage of maintaining the natural tissue structure. For in vivo studies, genetic knockout models presenting defects limited to NALT are not currently available due to a poor understanding of the developmental pathway. For example, while lymphotoxin-&alpha; knockout mice have atrophied NALT, the Peyer's patches, peripheral lymph nodes, follicular dendritic cells and other lymphoid tissues are also altered in these genetically manipulated mice12,13. As an alternative to gene knockout mice, surgical ablation permanently eliminates NALT from the nasal passage without affecting other tissues. The resulting mouse model has been used to establish relationships between NALT and immune responses to vaccines1,3. Serial collection of serum, saliva, nasal washes and vaginal secretions is necessary for establishing the basis of host responses to vaccination, while immune responses originating directly from NALT can be confirmed by tissue culture. The following procedures outline the surgeries, tissue culture and sample collection necessary to examine local and systemic humoral immune responses to intranasal (IN) vaccination.

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue NALT in Mouse Responses to Vaccines

Methods to examine contributions of the nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) to nasal and systemic immune responses of mice to intranasal vaccines are described. We demonstrate a surgical procedure to establish a NALT-dependent mouse model and ex vivo cultures of extracted NALT.

백신에 마우스 응답 Nasopharyngeal - 관련 Lymphoreticular 조직 (NALT)의 역할을 검토

The nasopharyngeal-associated lymphoreticular tissues (NALT) found in humans, rodents, and other mammals, contribute to immunity in the nasal sinuses1-3. ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

전단 응력의 인간 간 사인 내피에서 조건에 백혈구 모집을 연구하는 흐름 접착 분석

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We demonstrate the procedure for preparing H. influenzae inoculum, intra-tracheal instillation of H. influenzae into the lung, collection of broncho-alveolar lavage fluid (BALF), analysis of immune cells in the BALF, and RNA isolation for differential gene expression analysis. This procedure can be used to study the lung inflammatory response to any bacteria, virus or fungi. Direct tracheal instillation is mostly preferred over intranasal or aerosol inhalation procedures because it more efficiently delivers the bacterial inoculum into the lower respiratory tract with less ambiguity.

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.

의 내부 기관 관리<em&gt; 헤모필루스 인플루엔자</em&gt; 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

보호 효능 및 폐 면역 반응은 마우스에 피하 및 비강 BCG 관리에 따라

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

인간 인플루엔자 바이러스 감염의 Zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...