私たちは、優れた技術サポートのために役立つ提案やマルティナゲプハルトならびに平家Arthenための幹細胞とヴュルツブルク大学の再生医療グループのすべてのメンバーに感謝したいと思います。この作品は、ドイツ学術協会DFG（ED79 / 1-2）からの助成金、教育研究BMBF（01 GN 0813）のドイツ省、バイエルン研究ネットワーク人工多能性幹細胞」forIPS」と「財団シビルAssmusによってサポートされていました&quot; 図1は、www.servier.com Servier社から入手可能医療技術を用いて製造しました。

本研究で用いたヒト線維芽細胞は、ヴュルツブルク、ドイツの大学の倫理委員会によって同意し、倫理的なクリアランスを通知取得後の皮膚のパンチ生検から得た（倫理的な報告なし：11分の96 2011年6月10日の日付）。 1.パンチ生検<ol><li>患者の皮膚を消毒。皮内に0.5〜1ミリリットルメピバカイン塩酸塩を使用して生検を（優先あまり日光にさらされる領域）から採取されるの皮膚の一部を麻酔し、滅菌3ミリメートル生検パンチを使用して、皮膚生検を準備し、DPBSで生検+ 1μL/ 1ミリリットルゲンタマイシンをすすぎ、削除脂肪。完全DPBS +ゲンタマイシン、吸引DPBSで二回の生検をすすぎ、ディスパーゼII（2.4 U / ml）で生検をカバーし、16インキュベート - 4℃で18時間を。 </li><li>吸引しディスパーゼは完全に、DPBSで二回洗浄し、ピンセットで表皮を取り除きます。 15mlチューブで、転送2ミリリットルのコラゲナーゼタイプ2（500 U / mlのCDU）を追加し、DPBSで二回の生検を洗浄しCollagenaを追加SE最大5 mlの全容量。 37℃、5％CO 2で45分間インキュベートします。 </li><li>遠心分離機5 180×gで分、その後、上清を捨てます。 180×gで5分間、再び10ミリリットルDMEM-FCS-ゲンタマイシンメディア（10％FCS、1μL/ mlのゲンタマイシン）と遠心機でペレットを再懸濁。 1.5ミリリットルDMEM-FCS-ゲンタマイシンメディアに上清を再懸濁ペレットを捨てます。付着組織培養フラスコをT25、37℃、5％CO 2でインキュベートし移します。 </li><li> 3日ごとに培地を変更します。 </li><li>約2週間後、細胞は、皮膚の部分の周りに、トリプシン/ EDTA（0.05％）を用いて分割細胞コンフルエントされる場合：DPBSで一度洗浄細胞を、37℃で5分間インキュベートし、5％CO 2×2 mlのトリプシン/ EDTAを添加した後（0.05％）、5分間180×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機に転送、DMEM-FCS-ゲンタマイシンメディアの2ミリリットルを追加します。 DMEM-FCS-ゲンタマイシンメディアの適切な量の上清と再懸濁ペレットを捨てます。 </li><li>さらに、培地ごとに3つのRを変更することにより、細胞を拡大細胞がコンフルエントである場合に上記のようなDの昼と分裂。ゲンタマイシンの添加は、通路2の後に停止することができます。 </li><li>直接変換実験のために細胞を使用する前に、標準的なアッセイによってマイコプラズマ汚染を除外するようにしてください。 </li><li>細胞が拡張されていたら、直接変換を開始または10％DMSO、90％FCSを用いて細胞を下にフリーズすることがあります。細胞を、2日間-80℃に保存し、その後長期保存のために液体窒素に移すべきです。 </li><li>変換の調製のために、DPBS、吸引DPBSで細胞を1回洗浄し、2.5 mlのトリプシン/ EDTA（0.05％）を追加します。 37℃、5％CO 2で5分間おいてください。 、細胞を剥離するために静かにフラスコをタップし、線維芽細胞培地（DMEM込みL-Gluの+ 10％FCS + 1％NEAA + 1％のピルビン酸ナトリウム）の2.5ミリリットルで再懸濁し、15 mlチューブに移します。 5分間、180×gで遠心分離し、上清を吸引除去します。単一細胞懸濁液を生成するために、上下に1ミリリットル線維芽細胞培地とピペットで細胞を再懸濁し。&lt;/ LI&gt; <li>フックス-Rosenthal-またはノイバウアー細胞計数室とプレート24ウェルプレートのウェルあたり3×10 4個の細胞を用いて細胞数をカウントします。 37℃、5％CO 2でO / Nインキュベートします。 </li></ol>センダイウイルスや分化転換とヒト線維芽細胞の2感染注：安全性を確保するために、ウイルスを処理する次の手順では、粘膜の露出を防止するために、特に外科用マスク、生物学的安全キャビネットと、層流フード中で、適切な個人の安全装置を用いて実施されなければなりません。 <ol><li> 100μlの線維芽細胞培地（ステップ1.9）に細胞を切り替えます。 Oct4-、Klf4-、Sox2-およびc-MYC-センダイウイルスのアリコートを解凍し、1mlの線維芽細胞のメディアをそれぞれのウイルスを再懸濁します。細胞への3のMOI（ウイルス力価はロット毎に異なるが、各ウイルスの1つのアリコートは、一般的に24ウェルプレートの10ウェルの感染のために使用することができます）で、各ウイルスを加え、穏やかに混合。 37℃、5％CO 2でO / Nインキュベート</sUB&gt;。 </li><li> 24後の時間媒体を吸引し、neuroinductionメディアの500μlを添加する（1：1 DMEM / F-12：神経基礎、1×N2、1×B27、1％グルタ、10 ngの/ mlののhLIF、3μMCHIR99021、2μMSB431542）および今から39°C、5％CO 2で培養。一日おきにメディアを変更します。 </li><li>ラミニンコーティングした6ウェルプレートを準備し、感染後6日目：6ウェルプレート上に溶液1mlを添加し、4℃で24時間維持し、DPBS中1μg/ mlのラミニンを希釈します。 </li><li>感染後7日目にDPBS / EDTAを用いて細胞を分割：その後、DPBS / EDTAの500μlを添加し、37℃、5％CO 2で10分間インキュベートし、培地を吸引し、DPBSで細胞を1回洗浄します。 </li><li> DMEM / F12の500μlを添加して、5分間、180×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機でプレートからサスペンションを削除します。 </li><li>上清を吸引し、neuroinductionメディア、ラミニン被覆6ウェルプレート上にプレートを1.5 ml中にペレットを再懸濁し、最終conceでROCK阻害剤Y27632を追加細胞に10μMのntration、39℃、5％CO 2で培養。 </li><li>一日おきにメディアを変更します。 </li><li>感染培養後14日目から37°C、5％CO 2で細胞。神経上皮コロニーは、位相差顕微鏡によって感染後17日目の周りに明らかとなります。彼らは、感染後20日目の周りを取り出すことに十分大きくなければなりません。 </li></ol>推定上INPCコロニーの3分離<ol><li> 、DPBS中1μg/ mlのラミニンを希釈プレート上の溶液300μlを添加し、4℃で24時間維持：ある日、ラミニンでコート1 48ウェルプレートを選ぶ前に。一日後吸引ラミニンプレートから、ウェルにneuroinductionメディアの200μlを添加します。 </li><li> DPBSで一度ピックアップするコロニーを含む6ウェルプレートを洗浄し、6ウェルプレートのウェルあたり2mLのDPBSを追加します。機械的にコロニーを選択してください：周囲の細胞を取り除くために細い針を使用して、コロニーの周りにこすり。 200を設定します1;50μlの上のLピペットマンとそれぞれのピペットチップを使用してコロニーを選択します。 </li><li>ラミニン被覆48ウェルプレートの1ウェルに1つのコロニーそれぞれを転送し、ダウン10回ピペッティングして機械的に単一細胞懸濁液を生成します。細胞への10μMの最終濃度で、ROCK阻害剤Y27632を追加します。 </li><li> 2日間、37℃、5％CO 2で48ウェルプレートに細胞を増殖させます。 90％の集密度（約3 - - 4日）細胞が80に到達するまで、一日おきにメディアを変更します。 </li></ol> 4.拡張とiNPCsの凍結保存<ol><li>継代とiNPCsの拡大<ol><li>培地を吸引し、DPBSで細胞を洗浄。 DPBSを吸引し、200μlのDPBS / EDTAを添加し、37℃、5％CO 2で10分間インキュベートし、追加のDMEM / F12の200μLを、5分間180×gで、15ミリリットルチューブにプレートから遠心分離機をサスペンションを削除。 </li><li>上清を吸引し、neuroi 0.5mlにペレットを再懸濁nductionメディア（2.2ステップ）、ラミニン被覆12ウェルプレートにプレートし、細胞に10μMの最終濃度で、ROCK阻害剤Y27632を追加し、37℃で培養、5％のCO 2。細胞が80に到達した後に - 90％の集密度を、彼らはいずれかをさらに拡大することができるか、次のようにダウンして凍結しました。 </li></ol></li><li> iNPCsの凍結<ol><li>培地を吸引し、DPBSで細胞を洗浄。吸引しDPBSおよび300μlのDPBS / EDTAを添加し、37℃、5％CO 2で10分間インキュベートし、DMEM / F12の300μlを添加し、5分間180×gで、15ミリリットルチューブにプレートから遠心分離機をサスペンションを削除します。 </li><li>上清を吸引し、商業NSC凍結培地0.5mlにペレットを再懸濁します。凍結バイアルに移し、懸濁液を、細胞凍結容器に入れました。 2日間-80℃で保存し、長期保存のために液体窒素に移します。 </li></ol></li></ol> iNPCs 5.分化<ol><li>ニューロンへの分化アル系譜<ol><li>ラミニン被覆プレート上の培養細胞は、上記のように。細胞が約70％であるニューロ差分メディア（DMEM / F-12、1×N2、1×B27、300 ngの/ mlのcAMPを、200μMのビタミンC、10 ngの/ mlのBDNF、10 ngの/ mlのGDNF）にメディアを変更コンフルエント。 3週間一日おきにメディアを変更します。分化中の細胞を分割しないでください。 </li><li> 3週間後、細胞は、神経マーカーTUJ1を表現する必要があります。より成熟した神経細胞と神経細胞のサブタイプを得るためには、3ヶ月までの分化を続けています。 </li></ol></li><li>グリア細胞系列への分化<ol><li>グリア誘導培地（1にメディアを変更します。1 DMEM / F-12：神経基礎、1×N2、1×B27、10μMのβメルカプトエタノール、100μMの非必須アミノ酸、1.5mMのL-グルタミン、5μg/ mlのインスリン、 40 ng / mlでのT3）を20ng / mlのEGFは、グリア前駆細胞への分化を誘導することを含みます。メディアの半分を削除し、約2週間、一日おきに新鮮な培地により交換してください。この期間中に細胞を分割する必要があります1：100％コンフルエントで10μMROCK阻害剤Y27632の存在下での3に達したとき。 </li><li>細胞は、市販のアストロサイトのメディアにほぼコンフルエント変化媒体である場合には、一日おきにメディアを変更します。2週間後、さらに星状細胞への細胞を分化します。約7日後、細胞は、星状細胞マーカー（ 例えば、GFAP）を発現し始めます。 10μMのROCK阻害剤Y27632の存在下で2比：細胞が分化プロトコルの間に100％コンフルエントを取得する場合、1でそれらを分割します。 </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ここでは、単離および拡張可能な導入遺伝子を含まない神経前駆細胞へのヒト線維芽細胞の直接変換および細胞補充療法や薬物スクリーニング分析に適用するための推定上の基礎として、その分化した子孫を示します。 NPCの中に体細胞の直接の系譜変換は系統特異的転写の強制発現26,33,34を要因によって達成されました。それにもかかわらず、多くの場合、胎児の線維芽細胞は、分?...

2006年に山中らは初めて多能性状態1への体細胞の再プログラミングの可能性を示すことができました。この脱分化は、4つの転写マウス線維芽細胞でのOct4、Sox2の、Klf4及びc-Myc因子の過剰発現によって達成されました。生成されたいわゆる人工多能性幹細胞（iPS細胞）は胚性幹細胞（ESC）に機能的な等価性を示し、したがって、成体生物のすべての細胞型に分化することができます。後で性IPSCに再プログラム一年は、ヒト線維芽細胞2のために達成することができます。動物モデルにおける実験は、iPS細胞由来の細胞は、一般に、パーキンソン病（PD）3-5に、例えば 、細胞置換療法に使用することができることを実証します。しかし、性IPSCの使用に関連するいくつかの制限は、それらの治療の可能性を完全に実現するための障害物を表します。まず第一に、多能性状態への細胞の再プログラミングとその後品質管理は、一般的に大規模なので、高価な細胞培養の手順で得た時間がかかり、非効率的なプロセスです。第二に、性IPSCは、生物医学アプリケーションの前に、目的の所望の細胞型に再分化される必要があり、分化した集団中の残留多能性細胞の確率がかなりの腫瘍形成能力を保有し、したがって、細胞移植後6高リスクが表示されます。第三に、初期化プロセスは、通常lenti-またはレトロウイルス感染によって、再プログラミング因子を誘導することによって達成されます。宿主ゲノムへのこれらのウイルスの統合は、挿入突然変異誘発および/ ​​または導入遺伝子7,8の制御されない活性化につながる可能性があります。非統合システムが挿入突然変異及びトランスジーン活性化の危険性を最小限にする、標的細胞への再プログラミング因子を送達するために開発されてきました。これらの導入遺伝子のないアプローチの例は、非組み込みを用いた細胞の再プログラミングされていますアデノまたはセンダイウイルス9,10、DNAベースのベクター11または組換えタンパク質13,14の合成mRNAを12または形質導入のトランスフェクションなどのDNAフリー法の適用。導入遺伝子を含まないiPS細胞の誘導のためのもう一つの有望な方法は、loxP配列で修飾されたレンチウイルスの再プログラミングの構築物の使用とのCre-loxP配列のDNA組換えシステム15,16を用いて、導入遺伝子のその後の欠失です。 細胞置換療法のための神経細胞を生成するために、より簡単な方法は、有糸分裂後のニューロン17-20への線維芽細胞の直接変換を表します。 Vierbuchen らは、転写の過剰発現は、マウス線維芽細胞17〜20％のニューロンの生成にASCL1、Brn2とMyt1l結果因子と報告しました。 2011年にはNeuroD1の過剰発現と組み合わせて、同じ3つの転写因子がノイへのヒト線維芽細胞の分化転換を可能にすることが、示されましたRONS 19。人為的なニューロンは、デュアルSMAD-とGSK3β-阻害20下ASCL1とNgn2の過剰発現によって生成することができます。注目すべきは、ニューロンへの線維芽細胞の直接変換をさらに拡大し、バイオバンクを許可していない非増殖性、有糸分裂後の細胞集団を生成します。 最近では、増殖性神経幹/前駆細胞集団への線維芽細胞の直接変換は、21-26を報告しました。明確にするために、すべてのこれらの細胞型は、このレポートに誘導される神経前駆細胞（iNPCs）と命名されます。 Han らは iNPCsを生成するBrn4、Sox2、c-Myc、およびKlf4を過剰発現します。一次組織または多能性細胞のいずれかに由来し、それらの神経幹細胞の対応と同様に、これらのiNPCsはtripotentialであり、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト21に分化することができました。当社グループは、Sox2の、Klf4の過剰発現を伴うわずかに異なる変換プロトコルを報告しました、およびc-Mycおよびわずか5日間誘導されたOct4-式。このアプローチでは、我々は再プログラミング22因子の完全な抑制を示し、マウス胚および成体の線維芽細胞から安定して増殖するiNPCsを生成することができます。性IPSCとは対照的に、iNPCsは、移植後の27腫瘍形成能を示さありません。我々はiNPCs 22臨床的に有用であることが実証された、脱髄の動物モデル、ミエリン欠損ラットに正常に変換細胞を使用しました。それまでは、NPCは唯一の多能性幹細胞または一次神経組織28-32から生成することができます。 iNPCsは凍結保存し、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトに分化することができますすることができ、安定拡張可能な細胞です。多くの努力は、ヒト細胞23,26,33,34に対するマウスから直接変換プロトコルを適応させるためになされています。 2012年には、線維芽細胞におけるSox2の単一因子の過剰発現は、マウスおよびヒトiNPCsを生成するのに十分であることが発表されました<s&gt; 33アップ。著者らは、胎児包皮線維芽細胞からのヒトiNPCsの発生を報告し、Sox2のとネスチンに対して染色することによって、それらを特徴とします。しかし、再プログラミングのために使用される標的細胞は、臨床で利用できるようにして行われ、動物モデルでの移植によって変換された細胞の機能的特徴付けがなかったしません、非常に特定の細胞型を表します。より最近の刊行物は、Sox2の、C-MycおよびBrn2またはBrn4 34のいずれかの過剰発現によりヒト胎児線維芽細胞からのニューロン限定前駆細胞の生成を説明しています。生成された細胞株は、自己再生能を示し、末端神経の様々なタイプに分化することができます。これらの細胞は異種の起源であり、1つは、残留例えば、製剤中の神経堤幹細胞の存在を除外することはできませんしかし、胎児線維芽細胞の使用は、好ましくない。 2014年に、朱らは、ヒト成人とネオの直接変換を報告しました単独でのOct4またはOct4のと共にSox2の過剰発現及び細胞培養培地への小分子の添加によりtripotential神経前駆細胞への出生線維芽細胞。注目すべきは、彼らの研究のSox2のに基づいて、単独で直接変換26を誘導するのに不十分でした。さらに最近では、呂らは山中の過剰発現は、拡張可能tripotential神経の発生で温度上昇の結果により、ウイルスの24時間およびその後の不活性化のためにセンダイウイルスによってOct4-、Sox2-、Klf4-、C-Mycの因子ことを報告しました前駆細胞23。結論として、ヒト細胞に公開変換プロトコルはこれまで、共通の山中因子の少なくとも一つ以上の過剰発現を持っているが、多くの場合、タイムリーな制限された方法で、直接駆動するのに必要な最小限の分子要因の明確な兆候はありませんiNPCsへの変換。タイムリーな制限されたいずれかの遺伝的手段によるのOct4の過剰発現、合成mRNAを用いたトランスフェクション、またはcエル透過性共にSox2の、KLF-4、およびc-mycの構成的発現を有するタンパク質は、まだ安定人間INPC線をもたらさありませんでした。このように、センダイウイルスのアプリケーションは、すべての山中因子を過剰発現し、タイムリー22,31がこれまで得意な作戦を表す一緒に最適化された神経のメディア誘導条件とウイルス23の熱不活性化することによってその活性を制限します。 いくつかの研究は、NSCの、または異なる動物疾患モデルにおけるそれらの分化対応の携帯の機能を実証します。ヒト多能性幹細胞から神経前駆細胞は、神経炎症性疾患、多発性硬化症35,36のマウスモデルに移植されています。 EAEにおけるhESC由来神経前駆細胞の適用性（実験的自己免疫性脳脊髄炎）-miceは最初2008年に示された35。多能神経前駆細胞は、マウスの脳の脳室に注入し、移植の結果EAEの臨床徴候の減少に編。 Kim らは、ヒトES細胞からのオリゴデンドログリア前駆体を生成し、EAE-マウスに脳室内のものを移植しました。移植は10日以上生存しなかったが、マウスは、神経機能および白質36において炎症誘発性免疫細胞の減少の有意な改善を示しました。幹細胞療法はまた、NPCのに成功し、それぞれの動物モデルで使用することができるように前臨床パーキンソン病の標的化のために適用されています。このために、前駆細胞は、いずれの多能性幹細胞38-40または41が使用された間葉系幹細胞から分化した胎児脳組織37から誘導しました。 2012年には、我々は、マウスiNPCsはミエリン欠損（MD）のラット22の脳に移植後のプロテオリタンパク質、主要ミエリンタンパク質成分を、生成することができることを示しました。その証明の原理実験治療applicabilによるiNPCsの性は、最初に証明され、すぐに別の研究32で確認しました。しかし、人間のiNPCsの治療的使用の完全な可能性が探求されていません。 ここでは、（i）皮膚生検を介して、成人患者からのヒト初代細胞の誘導、神経前駆状態にヒト線維芽細胞の（ii）の直接変換およびニューロンに分化するiNPCsの（iii）の能力の堅牢かつ統合されたプロセスを表示しますおよびグリア系統。このプロトコルの使用は、治療用途のための自家ヒト細胞の生成を高速化するのに役立ちます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Astrocyte media</td>
			<td>ScienCell</td>
			<td align="right">1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>pfm medical</td>
			<td align="right">48301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Axon medchem</td>
			<td align="right">1386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type2</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>PAN&#160;</td>
			<td>P10-032100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Roth</td>
			<td align="right">4720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>PHG0313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td align="right">50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>450-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP-antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hLIF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>300-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Seralab</td>
			<td>GEM-700-112-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67-antibody</td>
			<td>NeoMarkers</td>
			<td>RM-9106-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB1259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSC freezing media</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oct4-antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc9081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pax6-antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>inh-sb43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sendai virus: CytoTune Sendai Reprogramming Kit</td>
			<td>&#160;LifeTechnologies</td>
			<td>A1378001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumpyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox1-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2-antibody</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-205725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1-antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>CAS 146986-50-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td align="right">21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of adult human fibroblasts and their direct conversion into expandable neural progenitor cells

体細胞への成人皮膚線維芽細胞およびその後の分化の誘導多能性幹細胞（性IPSC）の生成は、組織適合性の障壁を回避する自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、所望の系統に多能性状態とその後の完全な差別化の進行が原因関連する新生物の可能性とゲノム不安定性のiPS細胞技術の臨床翻訳のための障害のままです。最近、我々及び他の体細胞だけそれによって多能性状態の進行を回避する、定義された係数を用いてiPS細胞にも多能体性幹細胞の別の型に変換することができないことを示しました。具体的には、誘発された神経前駆細胞（iNPCs）へのヒト線維芽細胞の直接変換は、そのような細胞置換、疾患モデルとして、さまざまな用途のための新規な自己細胞供給源の可能性を告げますおよび薬剤スクリーニング。ここでは、タイムリーな制限のOct4、Sox2の、Klf4の発現、ならびにC-MycのことでiNPCsに皮膚生検とその効率的な直接変換することにより、成人ヒト一次線維芽細胞の単離を記載しています。 SOX2陽性神経上皮コロニーは、誘導の17日後に表示され、INPCラインはモノクローナル単離および拡張することにより効率的に確立することができます。誘導期の間に感染し、白血病抑制因子の補充のウイルス多数の正確な調整は、最大0.2％の変換効率を達成するための重要な要素を表しています。これまでのところ、患者固有INPCラインは12以上の継代のために拡張することができ、均一に、このようなネスチンおよびSox2の発現などの神経幹/前駆細胞の形態学的および分子的特徴を表示します。それぞれ、TUJ1およびGFAPに対して染色することによって判断されるようにINPCラインは、ニューロンとアストロサイトに分化させることができます。結論として、我々は派生と悲惨のための堅牢なプロトコルを報告しますこのような自家神経細胞置換および疾患モデルとして、生物医学的用途のための細胞源を提供するかもしれない安定拡張可能な神経前駆細胞へのヒト線維芽細胞のCT変換。

ここでは、以下の8週間（ 図1）内に皮膚からパンチ生検により得られたヒト線維芽細胞から誘導された神経前駆細胞（iNPCs）の生成を可能にする統合されたプロセスの説明を提示します。患者specifc iNPCsはさらに、ニューロンとグリア系統に分化し、細胞置換療法および疾患モデリングのための大きな可能性を保有することができます。 Oct4-、Klf4-、Sox2-およ?...

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Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

Generation of&#160;induced pluripotent stem cell (iPSCs) from adult skin fibroblasts and subsequent differentiation into somatic cells provides ...

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JoVE Journal

Neuroscience

15.3K ビュー.  University of Würzburg. 人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。 

ビデオ: Derivation of Adult Human Fibroblasts and their Direct Conversion into Expandable Neural Progenitor Cells

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

神経科学

Neural-Colony Forming Cell Assay: An Assay To Discriminate Bona Fide Neural Stem Cells from Neural Progenitor Cells

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). Furthermore, this serum-free culture system has also been employed to expand stem cells and determine their frequency from a variety of tumors and normal tissues. It has been shown recently that a one-to-one relationship does not exist between neurosphere formation and NSCs. This suggests that the NSA as currently applied, overestimates the frequency of NSCs in a mixed population of neural precursor cells isolated from both the embryonic and adult mammalian brain. This video practically demonstrates a novel collagen based semi- solid assay, the neural-colony forming cell assay (N-CFCA), which has the ability to discriminate stem from progenitor cells based on their long-term proliferative potential, and thus provides a method to enumerate NSC frequency. In the N-CFCA, colonies &ge;2 mm in diameter are derived from cells that meet all the functional criteria of a NSC, while colonies &lt; 2mm are derived from progenitors. The N-CFCA procedure can be used for cells prepared from different sources including primary and cultured adult or embryonic mouse CNS cells. Here we use cells prepared from passage one neurospheres generated from embryonic day 14 mice brain to perform N-CFCA. The cultures are replenished with proliferation medium every seven days for three weeks to allow the plated cells to exhibit their full proliferative potential and then the frequency of neural progenitor and bona fide neural stem cells is calculated respectively by counting the number of colonies that are &lt; 2mm and the ones that are &ge;2mm in reference to the number of cells that were initially plated.

This video protocol demonstrates how to discriminate and enumerate bona fide neural stem cells in a mixed population of neural precursor cells using the neural colony-forming cell assay.

神経コロニー形成細胞アッセイ：神経前駆細胞から善意の神経幹細胞を区別するアッセイ

The neurosphere assay (NSA) is one of the most frequently used methods to isolate, expand and also calculate the frequency of neural stem cells (NSCs). ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis and enable new strategies for in vitro modeling or repairing the diseased brain. Identifying brain-resident non-neuronal cell types amenable to direct conversion into iNs might allow for launching such an approach in situ, i.e. within the damaged brain tissue. Here we describe a protocol developed in the attempt of identifying cells derived from the adult human brain that fulfill this premise. This protocol involves: (1) the culturing of human cells from the cerebral cortex obtained from adult human brain biopsies; (2) the in vitro expansion (approximately requiring 2-4 weeks) and characterization of the culture by immunocytochemistry and flow cytometry; (3) the enrichment by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using anti-PDGF receptor-&#946; and anti-CD146 antibodies; (4) the retrovirus-mediated transduction with the neurogenic transcription factors sox2 and ascl1; (5) and finally the characterization of the resultant pericyte-derived induced neurons (PdiNs) by immunocytochemistry (14 days to 8 weeks following retroviral transduction). At this stage, iNs can be probed for their electrical properties by patch-clamp recording. This protocol provides a highly reproducible procedure for the in vitro lineage conversion of brain-resident pericytes into functional human iNs.

Targeting brain-resident cells for direct lineage-reprogramming offers new perspectives for brain repair. Here we describe a protocol of how to prepare cultures enriched for brain-resident pericytes from the adult human cerebral cortex and convert these into induced neurons by retrovirus-mediated expression of the transcription factors Sox2 and Ascl1.

誘導された神経細胞への成人の脳の周皮細胞由来細胞の系統の再プログラミング

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

セル成体マウス脳室下帯から神経幹細胞および前駆細胞の選別とその細胞周期ダイナミクスのライブイメージング

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

早期の生後早期のマウス脳に介在ニューロン前駆体の Homochronic 移植

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

シアログリカンの代謝標識による原発神経幹および前駆細胞の細胞表面マーカーの同定

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...