このプロトコルを使用して、患者の皮膚線維芽細胞から神経前駆細胞を作り、神経疾患および神経変性疾患を研究します。私たちは、このプロトコルは、速度を含む古典的なIPS技術よりも多くの利点を持っているように感じますが、また、特定のケースでは、より重篤な疾患表現型を取得します。私たちは神経疾患や神経変性疾患を研究し、皮膚サンプルを使用して、患者の多様性を本当に評価することができます。
私の研究室は特に病気におけるアストロサイトの役割に興味があり、NPCから作るアストロサイトを使用して薬をテストし、病気のメカニズムを研究するだけでなく、ヒトおよびマウスニューロンとの共培養にも使用しています。私たちは、このプロトコルが有益であることを願って、あなたが任意の質問がある場合は手を差し伸べてください。ありがとうございました。
細胞のバンクまたは皮膚生検から得ることができる原発性ヒト皮膚線維芽細胞を使用する。5%CO2組織培養インキュベーターで37°Cの培養細胞。少なくとも1〜2つの通路の通路細胞は、実験で使用する前に解凍後に行う。
細胞の準備ができたら、室温でPBSで希釈した1:200濃度でヒトフィブロネクチンを6ウェルプレートのウェルに15〜20分間コーティングします。表1に示すように線維芽細胞培地を用意する。細胞がメッキされる準備ができたら、フィブロネクチンを皿から取り出し、すぐに細胞溶液または2つの繊維芽細胞培地を加える。
培地を追加する前に皿を乾燥させないでください。細胞の成長の速さに応じて、ヒトフィブロネクチンコーティングされた6ウェルプレートの2つのウェルに150,000〜200,000個の線維芽細胞が入っている。5%CO2組織培養インキュベーターで37°Cの培養細胞。
播種の翌日、顕微鏡下で線維芽細胞をチェックし、細胞密度が4つのレトロウイルスベクター(Oct3/4、Klf4、Sox2、およびc-Myc)すべてで1井戸を1つうまくTransduceすることを確認します。急速に成長する場合は10、成長の遅い線維芽細胞には15の感染の多重度を使用してください。トランスダクション効率は、各ベクターに対して70%以上の陽性細胞を超える必要があります。
ウイルスミックスに通常の線維芽細胞培地を加え、井戸当たり1ミルの総体積を記録します。第二の井戸を未処理のままにし、一晩インキュベートする組織培養インキュベーターに細胞を返します。伝達の翌日、PBSで細胞を1回洗浄し、新鮮な線維芽細胞培地を1ミル添加する。
5%CO2組織培養インキュベーターで37°Cの培養細胞。翌日、表1に示した変換培地を調製し、細胞をPBSで1回洗浄して残留線維芽細胞培地を取り除き、次いで1milの変換培地を添加する。未処理のメディアを変換メディアにも変更してください。
顕微鏡下で細胞を観察し、形態の変化を観察します。細胞培地は、変換プロセスを通じて毎日1~2ミルの変換培地に交換し、その後のiNPC培養のために交換する必要があります。ウェルから 70% のメディアを慎重に削除し、残りの 30% のメディアでセルがカバーされるようにすることで、メディアを変更します。
細胞を観察し続け、変換メディアの1〜2ミルで毎日メディアを変更します。変換培地で約5〜6日後、または細胞が非常に密になったとき、それらを1〜2または最大1〜3に通過させる。アキュターゼを温め、PBSで1ミル総フィブロネクチンを室温で15〜20分間希釈した6ウェルプレートに適切な数の井戸をコーティングします。
細胞を取り外さずにPBSで細胞を丁寧に洗浄してください。ウェルの壁を使用して、細胞にPBSを穏やかに塗布します。慎重にピペットまたは吸引によってPBSを除去します。
500マイクロリットルのアキュターゼを加え、組織培養インキュベーターで摂氏37度で2~3分インキュベートします。顕微鏡で確認し、ほとんどの細胞が剥離していることを確認します。細胞が外れた場合は、新鮮な変換培地の2ミルを追加し、塊を解離するために2〜3回上下にピペットを穏やかに。
15ミルチューブに細胞を収集し、さらにアキュクターゼを希釈するために3ミルメディアを追加します。室温で200Gで4分間遠心分離機。細胞ペレットから上清を取り除き、新鮮な培地の1ミルで細胞を再懸濁します。
細胞の塊を解決するために2〜3回上下にピペットを軽く。コーティングされた6つの井戸からフィブロネクチンを取り除き、すぐに各井戸に1ミル新鮮な培地を追加します。分割比が1:2の場合、1つのウェルに500マイクロリットルの細胞懸濁液を加え、もう1つのウェルに他の500を加えます。
6つのウェルを北東西方向に穏やかに振って細胞を分配し、37度の組織培養インキュベーターに入れます。翌日顕微鏡下の細胞を観察し、1~2ミルで培地を交換します。セルを再び分割する準備が整うまで、メディアを毎日変更します。
表1に見られるようにEGFまたはヘパリンなしで増加濃度でFGFを含むNPC培地を調製する。この新しい分割では、変換メディアにセルのウェルを1つ、NPCメディアにもう1つのウェルをシードします。NPCメディアの1〜2ミルで毎日iNPCのメディアを変更し続けます。
表1に従ってアストロサイト培地を準備する。新鮮なiNPCからアストロサイトを作るために、10センチメートルのフィブロネクチンコーティングプレートで10ミルのアストロサイト培地に直接iNPCを播種し、翌日10%程度の合流度になるようにします。5%CO2組織培養インキュベーターで37°Cの培養細胞。
めっきの3日後に10ミルのアストロサイト培地で培地を交換します。細胞を5~7日間分化し続けます。実験のために種をまくには、ステップ2から2.6に記載されているようにトリプシンまたはアキュターゼを使用してアストロサイトを分割します。
推奨されるシード密度は、表 2 に含まれています。iNPCを分割して誘導アストロサイトを生成する方法の説明を表3に示します。凍結したiNPCストックからアストロサイトを作るために、液体窒素貯蔵タンクから部分在庫ファイルを取り除き、37°Cで素早く解凍します。
細胞が解凍されるとすぐに、5ミルのアストロサイト培地を含む15ミルチューブ内のピペット細胞溶液。200G室温で4分間遠心分離機。上清を取り除き、1ミル新鮮なアストロサイト培地で再中断します。
フィブロネクチンコーティングされた10センチメートル皿に9ミルの新鮮なアストロサイト培地を加え、1つのミルセル溶液を加え、北東西の動きで細胞を穏やかに分配します。5%CO2組織培養インキュベーターで37°Cの培養細胞。このプロトコルは、山中因子を含むレトロウイルスを用いて、ヒト皮膚線維芽細胞から直接iNPCを迅速かつ容易に生成することを可能にする。
この方法は、幹細胞状態とクローン選択の必要性をバイパスし、それによってクローンの変動を回避することを可能にする。細胞が変換プロセスを経ている間に留意する重要なステップは、線維芽細胞の播種密度、培地pH、および最適な合流度で細胞を維持することです。変換プロセス中の最適な合流性および形態変化の例は図1に見られる。
変換プロセスが完了すると、NPCは線維芽細胞マーカーおよび形態の発現を強く減少させたり発現しなかったり、NPC特異的な細胞マーカーを発現する。さらに、それらは誘発されたニューロン、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトのような異なる細胞株を生成するためにまた使用することができる。私たちの経験では、特に誘発されたアストロサイトは、再現可能な多数の純粋な集団で生成することができるので、薬物および疾患メカニズム検査にとって非常に貴重です。
誘導アストロサイトは、分裂中に細胞の小さなアリコートを取るか、または以前に凍結したiNPC部分を取り、アストロサイト媒体で直接めっきすることによって、iNPCから分化することができる。このプロセスの間の重要な考慮事項は、高い播種密度が分化プロセスを妨げることが示されているとして、iNpCsの初期シード密度を低く維持し、酸性化が健康なアストロサイトを活性化することができるので、培地pHに追加の注意を払うことである。要約すると、直接変換プロトコルは、患者の皮膚サンプルから神経前駆細胞を作ることができる非常に迅速な方法である。
これにより、より多くの細胞サンプルを同時に研究し、病気の文脈における多様性を実際に見ることができます。これは、神経前駆細胞、ニューロンだけでなく、共培養や薬物検査や機械研究にも使用できるアストロサイトを作るために使用できる非常に強力なアッセイであると感じています。
