XHPは、国立老化研究所（NIHK01AG024496）と母子保健と人間開発のユニスケネディシュライバー国立研究所（NIHR21HD056530）から健康（NIH）助成金の国立研究所によってサポートされています。

1。ソリューションとメディアの準備<ol><li>ゼラチンコーティング溶液：4で0.1％（w / v）ののddH 2 O、オートクレーブでゼラチンと店舗℃の</li><li>マトリゲルコーティングソリューション。ストック溶液：° C一晩、10mlの氷冷DMEMまたはDMEM/F12を追加、よく混ぜて、アリコートを1ml /滅菌組織培養フードの下にチューブ、-20℃で保存します。4でゆっくりと解凍マトリゲル（10ml）をワーキングソリューション：遅い雪解け4で1ミリリットルマトリゲルのアリコート° C DMEMまたはDMEM/F12を冷やして14ミリリットルまで1-2時間、転送およびコーティングの直前に滅菌組織培養フードの下によく混ぜる。 </li><li>人間のラミニンコーティング溶液：希釈1ミリリットルのヒトラミニン溶液を氷冷DMEMまたはDMEM/F12へと（トリスでは0.5 mg / mlの-80店舗、NaClをバッファ° C、1〜2時間、4℃でゆっくりと解凍） 12.5ミリリットルワーキング溶液（40μg/ ml）を滅菌​​組織培養フードの下にすぐにコーティングの前に。 </li><li>成長因子のストック溶液（500 - 1000X）：10μgのに成長因子を溶かす滅菌緩衝液に/ mlの（0.5％BSA、1.0mMのDTT、10％グリセロール、1XPBS）と-80℃で50〜100μL/チューブアリコートなどの店舗℃まで</li><li>オールトランスレチノイン酸ワーキングソリューション（1000X）：DMSO中の10mM、-80℃でアリコートの店舗℃に</li><li> hESCのメディア：DMEM/F12またはKO - DMEM（80％）、KO血清の交換（20％）、L -アラニル- L - GLNまたはL - GLN（2 mM）を、MEM非必須アミノ酸（MNAA、1X）、およびβ-メルカプトエタノール（100μM）、フィルタリングして4℃で保存、使用前に20 ng / mlのbFGFを補充したC、。または定義されたコンポーネントで、&quot;（KO）血清代替物をノックアウト&quot;交換：DMEM/F12またはKO - DMEM（100％）、L -アラニル- L - GLNまたはL - GLN（2 mM）を、MNAA（1X）、MEM不可欠アミノ酸（MEAA、1X）、およびβ-メル​​カプトエタノール（100μM）は、濾過し、4℃のbFGF（20 ng / ml）を、ヒトインスリン（20μg/ ml）を、アスコルビン酸（濃度50μg/を添加したC、使用前にml）を、人間のアクチビンA（50 ng / ml）を、（10 mg / ml）をAlbumax /ヒトアルブミン、およびヒトトランスフェリン（8μg/ mlの）。 </li><li> NSCメディア：DMEM/F12（100％）、N - 2 supplemeNT（1X）、ヘパリン（8μg/ mlの）。 </li></ol> 2。プレートコーティング<ol><li>ゼラチンでコートプレートは6ウェルプレートにゼラチン溶液を2.5ml /ウェルを追加し、37℃の加湿インキュベーターで一晩インキュベートする。 </li><li>コー​​トのラミニンとプレート：チルゼラチンコートプレートとゼラチン削除は、2.5 mlを追加/予備冷却にもマトリゲルまたはヒトラミニンコーティングワーキングソリューションは、4℃で一晩6ウェルプレートとインキュベートしてゲル化。 </li></ol> 3。定義された条件の下で未分化ヒトES細胞を継代し、シーディング<ol><li>ヒトES細胞のコロニー5-7日齢に成長できるように、と解剖顕微鏡（プリウォーム37に段階を解剖° C）滅菌フードを解剖下にヒトES細胞培養プレートを取る。 </li><li>ヒトES細胞のコロニーを分割する]を選択します。形態学的に、これらのコロニーは、定義されたエッジ国連に通常わずかに不透明&gt; 75％未分化ヒトES細胞を（小さなコンパクト細胞）、（白積み重ねではない細胞ではなく、明確な分化細胞）が必要です解剖顕微鏡をderneath。慎重に選択したコロニーを概説し、コロニーと、すべての差別化された部品をP2滅菌ピペットチップのエッジを持つコロニーの（もしあれば）またはガラスキャピラリーを引っ張っ周囲の差別化された線維芽細胞の層を取り除く。 （解剖顕微鏡による100％未分化な、&gt; 75％が未分化は通常、通過点として考えられている優先するものの、これを知る論文の細胞に難しい、さらに最適な条件下で自発的な分化を受け、人工多能性ヒトESが一時的な段階にある、注意してください。分化した細胞は通常、シードされず、継代過程で除去、成長を続ける） </li><li>吸引することで、浮動戸分化細胞を含む古いメディアを削除します。かつてhESCのメディア（bFGFを除く）で洗浄する。 3ミリリットル/ウェル20 ng / mlのbFGFを含む新鮮なhESCのメディアを追加します。 </li><li>小片に未分化ヒトES細胞のコロニーを切断し、滅菌ピペットチップを使用してデタッチまたはガラスキャピラリーを引っ張った。</li><li> 50 mlコニカルチューブに一緒に分離されたコロニーの部分を含むメディアプール。を1ml /一緒に20 ng / mlのbFGFおよびプールを含むだけでなくhESCのメディアで一回プレートを洗浄してください。 </li><li>コー​​ティングされた新鮮なプレートからマトリゲルまたはヒトラミニン液を吸引除去する。 6ウェルプレートにコロニーの部分を含むアリコート4ミリリットル/よくhESCのメディア。静かに振盪せずに培養器にプレートを転送し、5％CO 2の雰囲気で加湿37℃のインキュベーターを乱すことなく一晩コロニーピースシードを許可する。 </li></ol> 4。レチノイン酸で定義された培養システムの下でヒトESの神経誘導<ol><li>播種後3日目に、プレートの各ウェルから古いメディアのほとんどを削除し、ヒトES細胞のコロニーは、（ヒトES細胞が乾燥しても決して許さない）浸水することを許可するのに十分なメディアを残す。 20 ng / mlのbFGFおよび10μMのレチノイン酸を含む4ミリリットル/よく新鮮なhESCのメディアと交換してください。 </li><li> 20 ng / mlのbFGFを含む新鮮なhESCのメディアと古いメディアを交換し、10μMのレチノイン酸一日おきに、と神経誘発性hESCのコロニーは、7日または8に成長することができます。コロニー内のすべてのセルは、乗算を続ける大規模な分化細胞に形態変化を受けることになる。コロニーは、7日または8でプレートをカバーする大きさで増加し、細胞がコロニーのいくつかの分野で積み上げを開始します。 </li></ol> 5。浮遊培養での継続的な神経分化<ol><li>滅菌フードを解剖下に解剖顕微鏡（37〜プリ暖かい解剖段階° C）へのヒトES細胞培養プレートを取る。慎重にコロニーを概説し、P2滅菌ピペットチップのエッジでコロニーを取り巻く線維芽細胞の層（分化した細胞がコロニー外に移行）を削除したり、ガラスが管を引っ張った。 </li><li>吸引することで、浮動戸線維芽細胞を含む古いメディアを削除します。かつてhESCのメディア（bFGFを除く）で洗浄する。 3ミリリットル/ウェルの新鮮なhESCのメディア（bFGFをせずに）を追加します。 </li><li>カット神経- I細かくnduced hESCのコロニー、および滅菌ピペットチップを使用してデタッチまたはガラスキャピラリーを引っ張った。 </li><li> 50 mlコニカルチューブに一緒に分離されたコロニーの部分を含むメディアプール。一緒に1ミリリットル/ウェルhESCのメディア（bFGFを除く）と、プールで一回プレートを洗浄してください。 </li><li>分注し4ミリリットル/よく4〜5日間を形成する浮遊細胞のクラスターを（神経芽細胞）を許可するには、37℃加湿インキュベーター中、6ウェル超低取付板とインキュベートしてコロニーの部分を含む無血清hESCのメディア。 </li></ol> 6。接着培養におけるニューロン表現型の成熟<ol><li> 50 mlコニカルチューブに一緒にフローティング神経芽細胞を含むメディアプール。 5分、1400 rpmで遠心する。あなたができる限り古い培地を吸引除去し、VEGF（20 ng / ml）を、NT - 3（10 ng / mlの）、およびBDNF（10 ng / ml）を含有する新鮮なNSCメディアの同量を追加します。 </li><li> 4ミリリットル/ウェル、6ウェルプレートにフローティング神経芽細胞と一定量を混合するために上下にピペッティングし。神経芽細胞はまた、SEになることができるラミニン/コラーゲン（マトリゲル）またはヒトラミニン重合VEGF（20 ng / ml）を、NT - 3（10 ng / mlの）、およびBDNF（10 ng / ml）を含む無血清NSCメディアにおける3次元マトリックスでeded 。神経芽細胞は一晩アタッチできるように37℃の加湿インキュベーターにプレートを転送する。 </li><li> VEGF（20 ng / ml）を、NT - 3（10 ng / mlの）、およびBDNF（10 ng / ml）を一日おきにを含むNSCのメディアを交換してください。神経突起有利子神経細胞と色素細胞の広範なネットワークは、連続培養し、時間と数の増加の2週間以内に表示されるようになります、そして3ヶ月以上持続することができます。 </li></ol> 7。代表的な結果： レチノイン酸（RA）が独占的に多能性の神経外胚葉性の表現型（ 図2A）に移行するために定義された培養系で維持ヒトES細胞を誘導するのに十分レンダリングされます。 RAへの未分化ヒトES細胞の露光時に、コロニー内のすべてのセルは形態変化を受けることになる多能性関連マーカーを発現停止大きな分化した細胞は、などのOCT - 4で示され、様々な神経外胚葉関連などHNK1ようなマーカー、、AP2、およびTrkCを（ 図2B）を発現始まります。これらの大規模な分化細胞は、乗算していきますし、コロニーが初期神経マーカーβ- III -チューブリン（ 図2B）を発現するために自発的に進んで、サイズが大きくなります。より成熟した神経のマーカーMAP - 2は細胞が（ 図2B）積み上げてきたコロニーの地域で表示されるようになります。神経外胚葉細胞と神経分化の外観と一致する、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）遺伝子16のドーパミン作動性ニューロンの分化活性化に関与する神経細胞特異的転写因子Nurr1は、核（ 図2B）に転位するでしょう。取り外した後は、RA処理したヒトES細胞は、懸濁液のカルトに浮遊細胞のクラスターを（神経芽細胞）が形成される神経分化のプロセスを継続するものをいい、ラベルにより表示。 bFGFおよび組織培養プレートに付着または無血清定義された培地中でラミニン/コラーゲン重合3次元マトリックス中に播種する神経芽細胞を許可した後、β- III -チューブリンとMAP - 2発現、神経突起の除去時に有利子細胞と色素細胞は、同じ期間での治療なしでヒトES細胞の自発的な多系統分化に比べて効率の大幅な増加と表示されるようになります、そして3ヶ月以上（ 図2C）のために持続することができる。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig1.jpg" /> 図1に排他的に小分子の単純な提供により、特定の臨床的に意義のある系統のヒト多能性幹細胞のよく制御された効率的な誘導の概略図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig2.jpg" /> 図2 <stroNG&gt;レチノイン酸は、神経系統の仕様と定義された条件の下で多能性の直接の神経細胞の進行を誘導する。（A）回路図は、ヒトES細胞の指示神経分化のプロトコルのタイムラインを描く。コントロールとして、模擬処理（DMSO）ヒトES細胞に比べて（B）定義された培養システムの下でレチノイン酸（RA）への未分化ヒトES細胞の曝露時には、コロニー内の大規模差別OCT - 4（赤）陰性細胞は、現れ始めた。 RA誘導性差別OCT - 4陰性細胞が発現するHNK - 1（赤）、AP2（赤）、TrkC（緑）、および初期の神経外胚葉の分化と一貫してβ- III -チューブリン（赤）、し始めた。これらの細胞は、最終的に通常の細胞を蓄積し始めたの分野における神経マーカーMAP - 2（緑）を発現する成熟し続けた。神経外胚葉細胞と神経分化の外観と一致する、で神経細胞特異的転写因子Nurr1（緑）、関与ドーパミン作動性ニューロンの分化チロシンヒドロキシラーゼ（TH）遺伝子の活性化は、核へ移行。すべての細胞はその核のDAPI染色（青色）で表示されます。 β- III -チューブリン（赤）およびMAP - 2を（緑、3次元マトリックスに示されている）を発現する神経突起有利子細胞の広範なネットワークにより評価される（C）RAの治療は、高効率で神経細胞系に向かって分化を誘導する。矢印は、中枢神経系におけるそれらの典型的な色素細胞を示している。すべての細胞は、インセットで、その核のDAPI染色（青色）で表示されます。スケールバーは0.1ミリメートル。

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

著者らは、競合する利害を宣言する。 XHPはXceltheraの創設者です。 XHPとEYSは、ヒトES細胞に関連する知的財産を持っている。

発達研究と臨床の翻訳の両方の主要な課題の一つは、効率的かつ予測可能所望の表現型に多能性ヒト幹細胞の広範な分化能をチャネルする方法をされています。そのような細胞が多系統の集約の段階を経由して、すべての胚葉の細胞に試験管内で自発的に区別することができますが、細胞のほんの一部は、特定の系統の1,4を追求する。これらのヒトES細胞由来の凝集体では、三胚葉の層に存在する可能性が広く発散望ましくない細胞型のかなりの量の同時出現はしばしば非効率的なだけでなく、目的の表現型の出現になりますが、手に負えないと信頼できないとしても。心臓と神経系は、しかし、前回のレポートでtransplantatio以下の多能性細胞の胚​​葉誘導および腫瘍形成のリスクが高いを通じて特殊な細胞を生成する際に非効率性を導出しているが、nは、さらなる臨床の翻訳を妨げている。 hESCの行は最初に成長-逮捕されたマウス胚性繊維芽細胞（MEF）4との共培養で導出され、維持された。いくつかのヒトフィーダーは、フィーダーフリー、および化学的に定式化培養系がヒトES 11月13日のために開発されているが、ヒト多能性細胞の自己複製を維持するために必要かつ十分な要素が未解決のままです。これらの外因性フィーダー細胞と生物学的試薬は、発達の信号に応答する多能性幹細胞の能力をマスク一方、未分化ヒトES細胞の長期的な安定成長を維持するのに役立ちます。忠実な展開と制御可能な直接差別化を可能に定義されている生物学的製剤血清培養系で未分化ヒトES細胞を維持することは、それらの治療的有用性と可能性への鍵の一つです。 RAは、以前に報告されたコンディットの下で保持未分化ヒトES細胞の神経分化を誘導するのに十分ではなかった外因性フィーダー細胞を含むイオン。神経系はRAでヒトES細胞に分化した多系統の集約を（胚様体）の治療、hESCの分化の比較的早い段階で表示されますがわずかにニューロン1、14、15の低収量を増加させた。一様に特定の系統のヒト多能性幹細胞の変換を達成するために、我々は特定の臨床的に意義のある系統に独占的に多能性ヒトES細胞の十分に制御された効率的な誘導のための条件を識別するために、未分化ヒトES細胞の増殖を保証することのできる定義された培養系を採用小分子の単純な提供（ 図1、図2）によって。今後の研究は再生治療のために臨床的に意義のある系統を派生させる場合にhESCの多能性の運命の小分子を介した直接制御と変調のための道を開く可能性がある、代替案として、ヒトCNSの開発に遺伝的およびエピジェネティックな制御分子を明らかにする。 RA治療、1-5なし％のヒトESはニューロン1、14、15に自発的な分化を受けることになる。 RAの治療では、我々は、人間の胚発生14をエミュレートする可能性があるプロセスで定義する文化の下で保持ヒトES細胞から&gt; 95％の胚性神経前駆細胞と神経細胞を生成することができた。最近、遺伝子を決定する既知の神経の運命は0.5から8パーセント17、18までの低効率と大人の神経前駆細胞と神経細胞にマウスの線維芽細胞の分化形質転換するために使用されている。しかし、再プログラム体細胞は、歴史的に異常な遺伝子発現および障害の治療ユーティリティ19から21までの加速老化と関連している。最後に、我々はここで確立されたプロトコルは、内部細胞塊（ICM）またはヒトの胚盤胞4の胚盤葉上層に由来する多能性ヒトES細胞に限定され、動物由来ES細胞を含む他の多能性細胞、には適用されない場合があります、以前の桑実胚（8から得られるES細胞-セル）段階の胚22、およびartificially再プログラム細胞23。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマ</td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>バイオサイエンスBD </td><td> 356231 </td><td>成長因子は減少</td></tr><tr><td>人間のラミニン</td><td>シグマ</td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td>オールトランスレチノイン酸</td><td>シグマ</td><td> R2625 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td>インビトロジェン</td><td> 10565018 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM - KO </td><td>インビトロジェン</td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替物</td><td>インビトロジェン</td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> MEM非必須アミノ酸溶液（MNAA、100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> MEM美濃酸溶液（MEAA、100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>インビトロジェン</td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td>インビトロジェン</td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトトランスフェリン</td><td>シグマ</td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトbFGF </td><td>ぺプロ</td><td> AF - 100 - 18B </td><td></td></tr><tr><td>人間のインスリン</td><td>インビトロジェン</td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td>人間のアクチビン</td><td>ぺプロ</td><td> 120 - 14E </td><td></td></tr><tr><td>人間のBDNF </td><td>ぺプロ</td><td> AF - 450から02 </td><td></td></tr><tr><td>ヒトVEGF </td><td>ぺプロ</td><td> AF - 100から20 </td><td></td></tr><tr><td>人間NT - 3 </td><td>ぺプロ</td><td> 450から03 </td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</tD&gt; <td>シグマ</td><td> H5284 </td><td></td></tr><tr><td> N - 2サプリメント（100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 17502048 </td><td></td></tr><tr><td> 6ウェル超低取付板</td><td>コー​​ニング</td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6ウェルプレート</td><td>コー​​ニング</td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

今日の医療業界で損傷した中枢神経系（CNS）の構造と回路の修復や再生のための臨床的に適切な人間の神経細胞のソースのための大規模な満たされていない必要があります。細胞ベースの治療は、中枢神経系疾患のための失われた神経組織と機能を復元するために偉大な約束を保持する。しかし、に基づいて、細胞治療CNS由来の神経幹細胞は、広範囲1-3継代後の培養と失敗可塑性におけるそれらの限られた拡張機能のため、臨床現場で使用するための供給制限や困難に遭遇した。いくつかの有益な成果にもかかわらず、CNS由来のヒト神経幹細胞は、（hNSCs）内因性細胞が1-3を救うために栄養と神経保護分子を製造を通じて、主に彼らの非神経子孫で、その治療効果を発揮するように見える。また、多能性ヒト胚性幹細胞（ヒトES）supplyinによる神経疾患の幅広い申し出る治療グラム再生1,4-7のための開発CNSにおけるヒト神経細胞タイプの多様性。しかし、所望の表現型に効率的かつ予測可能な多能性ヒトES細胞の広い分化能をチャネルする方法を発達研究と臨床の翻訳の両方にとって大きな課題となっています。従来のアプローチは、しばしば表現型の異質性と不安定性、それゆえ、腫瘍形成7-10のリスクが高いが続いている非効率的で制御不能系統コミットメントの結果として、自発的な胚層の差別化による多能性幹細胞の多系統傾きに依存しています。加えて、未定義の動物/外国の生物学的なサプリメントおよび/ ​​または一般的に単離のために使用されているフィーダ、拡張、およびヒトES細胞の分化は11月13日 、問題のある患者ではそのような細胞の特殊な移植を直接使用することがあります。これらの障害を克服するために、我々はのために必要かつ十分な定義培養系の要素を解決して臨床的に適切なヒトES細胞の de novo導出するためのプラットフォームとして、ヒトES細胞の胚盤葉上層のpluripotenceをustainingと効果的に小分子14（ 図で回路図を参照してください。1）により臨床的に意義のある系統に向かって一様にそのようなヒトES細胞を演出。レチノイン酸（RA）がフィーダ1、14で維持未分化ヒトES細胞の神経分化を誘導しない。とマウスのES細胞とは異なり、ヒトES細胞に分化した胚様体（EB）を治療することで、わずかにニューロン1、14、15の低収量を増加させる。しかし、小分子および増殖因子の様々なスクリーニングした後、我々はそのような定義された条件は、さらに、人間の神経前駆細胞と神経細胞を生成した神経芽細胞に進行多能性ヒトES細胞から直接神経外胚葉の仕様を誘導するレチノイン酸（RA）が十分なレンダリングされたことがわかった高効率で開発するCNS（ 図2）。我々は、神経の誘導のための条件を定義細胞ベースの治療のための発達段階のスペクトルにわたって人間の神経細胞の大量供給のよく制御された効率的な導出を可能に介在する複数の系統胚様体のステージのない多能性ヒトES細胞から直接爆発、。

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Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

efficient-derivation-human-neuronal-progenitors-neurons-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K ビュー.  San Diego Regenerative Medicine Institute. 私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

げっ歯類からの神経細胞とヒト以外の霊長類の脳スライスのDiOLISTIC標識

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

神経科学

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

ヒト多能性幹細胞から終脳のグルタミン酸作動性ニューロンの仕様

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

ヒト人工多能性幹細胞由来脳微小血管内皮細胞の誘導、拡大、凍結保存および特性評価

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and Leber Congenital Amaurosis (LCA) cause progressive and debilitating vision loss. There is an unmet need for therapies that can restore vision once photoreceptors have been lost. Transplantation of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue (organoids) into the subretinal space of an eye with advanced RD brings retinal tissue sheets with thousands of healthy mutation-free photoreceptors and has a potential to treat most/all blinding diseases associated with photoreceptor degeneration with one approved protocol. Transplantation of fetal retinal tissue into the subretinal space of animal models and people with advanced RD has been developed successfully but cannot be used as a routine therapy due to ethical concerns and limited tissue supply. Large eye inherited retinal degeneration (IRD) animal models are valuable for developing vision restoration therapies utilizing advanced surgical approaches to transplant retinal cells/tissue into the subretinal space. The similarities in globe size, and photoreceptor distribution (e.g., presence of macula-like region area centralis) and availability of IRD models closely recapitulating human IRD would facilitate rapid translation of a promising therapy to the clinic. Presented here is a surgical technique of transplanting hPSC-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model allowing assessment of this promising approach in animal models.

Presented here is a surgical technique for transplanting human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model.

ネコ大型動物モデルにおけるヒト胚性幹細胞由来網膜組織の網膜下移植

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

多能性幹細胞からのヒト神経細胞および希突起膠細胞の作製によるニューロン-希突起膠細胞相互作用のモデル化

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

ヒトミクログリア様細胞:人工多能性幹細胞からの分化とヒトシナプトソームを用いた in vitro 生細胞貪食アッセイ

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...