NGLは、ウェイン州立大学周産期母子でイニシアティブ、周産期や小児保健によってサポートされていました。私たちは感謝して、原稿の彼らの重要な読書のためのモーリーンMcGertyとエイミーE. Furcron（ウェイン州立大学）を認めます。

このプロトコルに記載されたサンプルを使用して作業する前に、動物の倫理的な承認は、現地研究倫理委員会及び治験審査委員会によって与えられなければなりません。このプロトコルで述べたように、動物の血液、細胞、または危険な薬剤で作業している場合は、適切なバイオセーフティと実験室の安全行動に従わなければなりません。 1.マウスの取扱い及び組織収集<ol><li>無菌ワークステーションを準備し、組織収集のための無菌のツールを入手してください。これらのツールは、大小の手術用ハサミ、ピンセット、および先の細いピンセットが含まれます。 （ - 22°C 20）を室温に平衡化 - （5ミリリットル3）1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を充填し、適切な組織名で標識された小さなペトリ皿が挙げられます。 （10〜15ミリリットル）も1×PBS溶液で満たされた標識されていない大きなペトリ皿を、含みます。 </li><li>妊娠中のマウスを安楽死させる（10.5から19.0日後交尾（DPC）または送達の前に）二酸化炭素を使用して（CO 2）。マウスを安楽死させていることを確実にするために、頸椎脱臼技術を使用しています。 注：10.5 DPCの前に、それは手動で子宮組織から脱落膜組織を分離することは困難です。脱落膜白血球の分離が必要でない場合、子宮非妊娠マウスの組織または10.5 DPC &lt;におけるマウス由来のものからの白血球は、このプロトコルに従うことによって行うことができます。 </li><li>無菌手術用ハサミを使用して、完全に皮膚や筋肉組織の下腹部の部分を削除します。子宮と卵巣が表示されるまで、ピンセットで、さておき、他のすべての臓器に移動します。子宮がついたままで、腹腔（ 図1A）の外に移動するために鉗子を使用しています。 </li><li>各子宮角の卵管と子宮卵管接合部の遠位に卵巣の位置を確認します。小さな手術用はさみを使用して、子宮卵管接合部で切開を行い、子宮血管を含む腸間膜から子宮角を分離します。その後、子宮頸部での消費税は腹腔（ 図1B）から子宮角をデタッチします。 </li><li>小さな手術用ハサミで、子宮頸部と子宮角の下側セグメント間の切開を行います。子宮角を開けないようにするために、このプロセス（ 図1C）の間、子宮頸部の一部を添付しておきます。 </li><li>移植部位を水和するために - （15ミリリットル10）1×PBS溶液で満たされた大きなペトリ皿に（子宮頸部を含む）子宮角を浸し。 </li><li>まだ1×PBS溶液に浸漬しているが、小さな手術用ハサミで子宮角から任意の脂肪をトリミングします。解剖を通して1×PBS溶液に浸漬した組織にしてください。 </li><li>ピンセットで所定の位置に子宮角を持ち、小さな手術用はさみ（ 図1D）を使用して、インター注入領域を切断横と子宮からの移植部位の1つを削除します。移植部位はに囲まれ、胎児が含まれています漿尿膜、および子宮、脱落膜、および胎盤組織。 </li><li>鉗子を使用して、所定の位置にサイトを保持し、胎盤と脱落膜組織（ 図1E）に隣接した子宮壁に小さな切開を行います。これらは子宮壁と胎児を含む漿尿膜（ 図1F）の両方から分離された状態になるまで、胎盤/脱落膜の周囲にトリム。 </li><li>胎盤を除去し、1×PBS溶液中に脱落膜組織と場所を添付（3〜5ミリリットル;ステップ1.12を参照してください）​​。 </li><li> （3〜5ミリリットル）1×PBS溶液で満たされたペトリ皿に子宮組織に取り付けられた絨毛尿膜に囲まれた胎児を配置します。これらの組織の水和は、子宮壁（ステップ1.14参照）からの漿尿膜の分離を容易にします。 </li><li>先の細いピンセットを使用して、静かに胎盤表面から脱落膜組織（白灰色の層）を剥離。これを実行します胎盤および脱落膜組織（ 図1G）の完全性を維持するために慎重に進みます。 </li><li> （ - 5 mlずつ3）1×PBS溶液で充填された2つの別々に標識されたペトリ皿中の胎盤および脱落膜組織を配置します。 </li><li>静かに先の細いピンセットで絨毛尿膜から子宮壁を取り除きます。これらは、子宮組織です。 </li><li> （3〜5ミリリットル）1×PBS溶液で満たされたペトリ皿に子宮組織を配置します。 </li><li>すべての移植部位が処理されるまで繰り返して、1.15を介して1.8を繰り返します。 </li><li>酵素消化の間に細胞の収率を向上させるためにいくつかの子宮、脱落膜、および胎盤組織を収集します。組織の量は、ごみの大きさに依存します。しかし、白血球の分離が組織の&gt; 2枚が必要です。 注：別の妊娠日に移植部位の解剖に関する詳細情報については、Investigatiにガイドの第二章で見られる画像を表示マウスの妊娠42の上。 </li></ol> 2.子宮、脱落膜、および胎盤組織解離<ol><li>適切な組織名を使用して、いくつかの滅菌2ミリリットルをコニカルチューブにラベルを付けて、氷上で酵素液を1000μlのバイアルを置きます。 </li><li>標識された2ミリリットルの円錐管に子宮、脱落膜、または胎盤組織の - （150から100mg）、1×PBS溶液で満たされたペトリ皿から、二枚を転送します。 </li><li>各2ミリリットルコニカルチューブに冷酵素溶液500μlを追加します。 </li><li>細かい滅菌ハサミで、それは細かくみじん切りされるまで酵素溶液に浸漬した組織を解離し始めます。時間が経つにつれて、懸濁液は乳白色の外観を開発します。このステップでは、サンプルの過剰な操作を防止するために、以上の2分を超えてはなりません。 </li><li>組織が解離された後、2ミリリットルコニカルチューブに冷酵素液の余分な500μlを添加します。 </li><li>氷上で2ミリリットルコニカルチューブを置きます。 </li><li>すべての組織が処理されるまで繰り返し、個々の組織に2.6を介して2.2を繰り返します。 </li><li> 37ºCでインキュベーターに氷からホモジナイズした組織（みじん切り組織+酵素溶液）サンプルを用いて、すべての2ミリリットルを円錐管に移し、穏やかな軌道撹拌（80 rpm）を行ってください。 35分 - 30インキュベートします。インキュベーターの温度はインキュベーション時間を開始する前に安定化していることを確認します。 </li><li>インキュベーション後、インキュベーターから解離組織と2ミリリットルを円錐管を除去し、それ以上の消化を防止するために氷の上に置きます。 </li><li>組織タイプに応じて滅菌50mlコニカルチューブにラベルを付けます。ふたを取り外し、滅菌セルストレーナー（100μmの孔サイズ）に置き換えます。 </li><li> 〜1×PBS溶液20mlをセルストレーナーを介して、円錐管が使用して2ミリリットルから解離した組織を注ぎます。組織の断片は、セルストレーナーに残る細胞懸濁液は、それを通過します。 </li><li>ジを洗いますセルストレーナーでssociated組織2 - トランスファーピペットを用いて1×PBS溶液20mlで3回。 </li><li>空の2ミリリットルを1×PBS溶液（1ml）で円錐管を洗浄し、セルストレーナーを介してコンテンツを注ぎます。 </li><li> 50mlコニカルチューブからの細胞ストレーナーを取り外し、蓋を交換してください。 4ºCで10分間、1,250×gでチューブを遠心。 </li><li>慎重に、細胞ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。細胞ペレットは、単離された白血球との間質細胞が含まれています。 </li><li>ウシ胎児血清（FBS）を含まないRPMI培地1ml中の細胞ペレットを再懸濁します。穏やかに混合します。渦を使用しないでください。 </li><li> 5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブにきちんとFBSの500μlを添加して、ゆっくりと細胞懸濁液をオーバーレイ。 </li><li>細胞破片をPBS / FBSの界面に保持される生細胞をペレット化するために、室温でブレーキなしで1100×gで10分間遠心分離します。 </li><li>細胞ペレットを触れることなく、上清を吸引除去します。セルLペレットは、主に生細胞が含まれています。 </li><li> オプション：以下に説明するように、20％の飽和多糖溶液を使用し、単核細胞を濃縮します。 <ol><li> FBSを含まないRPMI培地1000μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>製造業者の説明書に従って5mlのポリスチレンプラスチックチューブに20％飽和の多糖溶液1mlを加え、ゆっくりとこの溶液の上に細胞懸濁液をオーバーレイ。サンプルを重ねているが、細胞懸濁液を20％飽和多糖溶液を混合することは避けてください。 </li><li>ブレーキなしで室温で30分間、500×gで、スイングアウトローターで遠心します。これは、細胞を混合し、勾配が失われないようにブレーキをオフにすることが非常に重要です。単核細胞を、20％飽和多糖類溶液と1×PBS溶液との間のインターフェイスに記載されています。 </li><li>吸引し、上清を捨てます。細胞ペレットは、主に単核細胞が含まれています。 いいえテ：、生存性染色および細胞内染色を行い免疫表現を実行するには、手順3を参照して、唯一の生存性染色および細胞外染色を実行するには、手順4を参照して、分離された白血球の細胞培養を実行するには、手順5を参照して、実行するには、手順6を参照するには磁気細胞選別は、ステップ7を参照してください。 </li></ol></li></ol>修正可能細胞3.生存率染色<ol><li> 1×PBS溶液を1100μlの細胞ペレットを再懸濁します。マイクロピペットを用いて穏やかに混合します。 </li><li> 5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブに100μlの細胞懸濁液を転送します。 5ミリリットルポリスチレンチューブに1×PBS溶液400μlを添加します。このチューブは、組織の自家蛍光のためのコントロールです。ステップ3.5まで4ºCで保管してください。 </li><li>新しい5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブに細胞懸濁液の残りの千μLを転送します。生存性色素の1μLを加え、穏やかに均質化します。 4ºCで暗所で30分間インキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、千＆＃を追加181; 1×PBS溶液のL。手で穏やかに混合します。 </li><li>遠心分離機の両方の5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブは、4ºCで10分間1250×gで（3.2と3.3ステップ）。吸引し、上清を捨てます。 注：細胞ペレット（ステップ3.3）は、細胞ペレット（ステップ3.2）は、組織の自家蛍光のための対照となるステップ4で使用されます。 </li></ol> 4.免疫表現<ol><li>抗マウスCD16 / CD3250μlに細胞ペレットを再懸濁し（1希釈：FACS緩衝液で100 [0.1％BSA、0.05％アジ化ナトリウム、1×PBS溶液を、pHが7.4]）。静かに細胞懸濁液を混ぜます。渦を使用しないでください。 </li><li> 10分間4℃で暗所での5mlポリスチレンチューブ中の細胞懸濁液をインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、細胞外の細胞表面マーカーまたはアイソタイプ適合対照抗体と反応する各抗白血球モノクローナル抗体50μlの（抗体希釈液を検証する必要があります）を追加します。例えば、白血球亜集団を分析するために、抗MOを使用CD45、Ly6G、F4 / 80、CD11cの、CD49b、B220、CD3、CD4、およびCD8（ 表1）：以下の白血球の細胞表面マーカーと反応する抗体を使用しています。 </li><li>細胞外マーカーに対する抗体は、5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブに追加された後、穏やかに混合します。 4℃で30分間、暗闇の中でインキュベートします。 </li><li>このインキュベーションの間、固定緩衝液調製及び前ウォーム（脱イオン水で希釈し、1：5）37ºCに、必要に応じ。その使用が必要になるまで、暗闇の中で37ºCでバッファをしてください。 </li><li> 30分間のインキュベーション後、5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブにFACS緩衝液の500μlを添加し、穏やかに混合します。この工程は、細胞を洗浄し、未結合の抗体のいずれかの過剰を除去するために必要です。 </li><li> 10分間4℃で1,250×gでサンプルを遠心。吸引し、上清を捨てます。 注：細胞内染色を必要としない場合、細胞内染色が必要な場合は、ステップ5を参照の透過を行い、セル内その後、ウラルここ染色、および固定（ステップ4.8）に進みます。 </li><li>細胞ペレットに予熱した固定緩衝溶液500μlを添加し、37ºCで10分間暗闇の中でインキュベートします。 </li><li> 5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブにFACS緩衝液500μlの分注します。穏やかに混合します。 </li><li> 10分間4℃で1,250×gでサンプルを遠心。吸引し、上清を捨てます。 </li><li>各サンプルにFACS緩衝液500μlのを追加します。これらのサンプルは、現在、フローサイトメトリーによって分析することができます。最良の結果を得るためにすぐにサンプルを取得します。 </li></ol>修理不可能細胞5.生存率染色<ol><li>細胞外免疫表現した後、FACS緩衝液500μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>サンプルのみを取得する前に4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩（DAPI、200 / mlの）の1μlを添加します。 </li><li>フローサイトメーターを使用して、DAPIを追加した後、2分 - 1内のサンプルを可視化します。 </li></ol><ol><li>滅菌ヒュームフードの下にワークステーションを準備します。水浴を用いて37℃にRPMI培地を事前に温めます。 </li><li>細胞計数のためにFACS緩衝液1000μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>製造者の指示に従って、自動細胞カウンターまたは血球計および0.4％トリパンブルー溶液を使用して生細胞の数を数えます。総生細胞数を記録します。 </li><li>遠心分離機FACS緩衝液を除去するために10分間、4℃で1,250×gで細胞。 </li><li>静かに2〜3回ピペッティングすることによって予め温めておいたRPMI培養培地500μlで細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>滅菌した24ウェルプレート中の細胞の所望の数をプレートし、37℃でインキュベートします。インキュベーション時間は、調査の質問によって決定されます。 </li></ol> 7.磁気細胞ソーティング<ol><li> MSカラム、磁気細胞分離、15：次の物質とクリーンワークステーションをセットアップしますmlのコニカルチューブ、30μmの分離前フィルタ、およびマルチスタンド。 </li><li> MACS緩衝液（0.5％BSA、2mMのEDTA、1×PBS溶液、pH7.2）で500μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>自動セルカウンターまたは血球計および0.4％トリパンブルー溶液を使用して、全生細胞数をカウントし、記録します。 </li><li> 10分間4℃で1,250×gで細胞を遠心。吸引し、上清を捨てます。 MACS緩衝液の別の500μlのを追加します。 </li><li>製造メーカーの推奨事項に従って、磁気分離を行うに進みます。 </li><li>フローサイトメトリーまたは顕微鏡によって純度を決定します。 </li></ol>

著者らは、利害の対立を開示していません。

母体·胎児の界面に浸潤白血球の豊かさと表現型の特徴を記録する一貫性のあるデータの収集は、妊娠関連の合併症の病因を理解するために不可欠です。いくつかの技術は、妊娠31,38,39,43-46を通して母体胎児の界面でのマウス組織からの白血球浸潤の単離を容易にすることが記載されています。しかし、それぞれの技術は、異なる別の酵素を使用するか、またはそれらの組み合わせを?...

妊娠中の免疫寛容は、独特の変化が母親の免疫システム内で発生する期間です。これらの変更は、母親が胎児、半同種移植片1を許容することができます。胎児が父親の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）は2抗原発現、および胎児細胞が母体循環3において見出されています。しかし、胎児は4,5を拒否されていません。この謎は完全には理解されていません。 最新の仮説は、母体·胎児寛容は性交と受精6,7中に作成され、満期妊娠8-10を維持するために維持されていることを述べています。この母体·胎児寛容の内訳は、妊娠10〜16の初期および後期の段階で病気のメカニズムを考えられています。母体胎児の耐性は、Mac、T細胞（調節性T細胞、Th1細胞、Th2細胞、およびTh17細胞）を含む様々な白血球サブ集団の参加を含みますrophages、好中球、マスト細胞、NK細胞、及びNKT細胞、樹状細胞、及びB細胞、妊娠15,17-19を通して密度および局在のその変化。母親の免疫系が胎児性抗原20,21と相互作用する解剖学的部位-母体·胎児許容範囲は、母体·胎児の界面20で濃縮されています。 胎児の絨毛外栄養膜細胞が子宮粘膜22-24に侵入したときに母体胎児のインターフェイスは、胎盤形成中に作成されています。このインタフェースの胎児側には、胎児の周囲の膜は、胎盤内で特殊な上皮表面を作成し、合胞体栄養細胞が母体血22との直接接触を介して栄養交換を制御します。インターフェイスの母体側では、脱落膜は、マウスですべての脱落膜細胞の50％〜30％を占めて白血球の異種のプールを募集しています。 maternへの参加に加えて、アル免疫寛容、これらの細胞は、妊娠中の異なるプロセス、 例えば 、感染症、受精から生殖器官の保護、胚移植の7,25、脱落膜血管新生26、血管リモデリング24,27、栄養膜浸潤28、胎盤に重要な貢献者であります開発24,25、および、最終的には、分娩15,17。したがって、母体·胎児寛容に関与する白血球の研究は、妊娠関連の合併症の病因を解明するために不可欠です。 免疫組織化学および免疫蛍光法の使用は、直接可視化および子宮、脱落膜、または胎盤白血球29,30のローカリゼーションのためのデータを生成しているが、さらに、これらの組織31,32のそれぞれに白血球の特定のサブセットを明らかにしたフローサイトメトリー分析。さらに、フローサイトメトリー母校の密度および割合を決定するために使用されていますNAL-胎児のインターフェイス白血球33と外および細胞内タンパク質8-10,34の発現レベル。母体胎児の界面での白血球のフローサイトメトリー分析は、単一細胞懸濁液を必要とします。脱落膜、子宮、胎盤組織から浸潤白血球を単離するために、組織解離の二つの方法が使用されてきた：機械的および酵素。両方の方法は、これらの組織の細胞外マトリックス（ECM）の浸潤白血球の分離を可能にします。それはより少ないせん断力関連の損傷35と白血球のより高い収率を可能にするような酵素組織解離は、機械的組織解離よりも優れています。その結果、機械的な組織解離は、サンプルの変動性と不均一性を高めることができるプールの組織36を必要とします。しかし、機械的解離は、目的の抗原を酵素的解離または時によって変更することができるときに選択することができる細胞の機能興味のあるのは、（ 例えば 、NK細胞の細胞傷害性）を保持する必要がある35。 ECMを分解する特定の酵素を用いたタンパク質分解の使用は、機械的解離で観察された低い収率を排除します。いくつかの研究は、37 32コラゲナーゼ、トリプシンの使用を報告している、DNアーゼ31は、38ディスパーゼ、および種々の酵素32,39の商業カクテル。しかし、自然と異なる酵素の濃度と消化の期間は、細心の注意を払って定義され、免疫表現するために必要な細胞表面抗原エピトープの完全性の維持を確実にするために検証する必要があります。さまざまな表面構造は、多数のモノクローナル抗体によって認識される白血球の表面エピトープを除去するための悪名高いされ、トリプシンなどのいくつかの酵素を用いて、異なる酵素による破壊に差次受けやすいです。 本明細書の導入proteolytを用いる方法でありますICおよびコラーゲン分解酵素カクテルは、のAccutaseと呼ばれます。この酵素溶液は、母体胎児の界面でのマウス組織を解離まだ効率的ながら十分に穏やかであり、解離反応を停止し、他の解離試薬または血清の添加を必要としません。また、解離の時間を検証する必要があるが、それは上記の酵素40,41よりも堅牢で、供給として使用する準備ができていると。 組織の脱凝集の両方のタイプの組合せの利用は、得られた細胞の質および量を改善します。このように、いくつかの研究は、満足のいく結果31,32,37に機械的および酵素的解離の併用を実装しています。本明細書に記載されるプロトコルが確立され、我々の研究室で確認されました。それは強固な酵素分解に続いて穏やかな機械的解離の組み合わせを使用しています。このプロトコルは、の単離およびさらなる研究を可能にします母体·胎児の界面でのマウス組織における浸潤白血球（子宮、脱落膜、および胎盤）。フローサイトメトリー分析によって示されるように、以下のプロトコルは、細胞表面マーカー及び収率下流アプリケーションのための十分な生存可能な細胞の完全性を維持します。最後に、このプロトコルは、母体·胎児のインターフェイスを構成する種々のマウス組織の分析と比較のための細胞調製物の整合性を維持します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Magentic Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Separator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre separation filters</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe lock conical tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/CD32</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse extracellular antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(BSA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixation buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% bovine serum albumin, 0.5% sodium azide, and 1X PBS ph 7.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface

妊娠中の免疫寛容は、母親の免疫系が発達中の胎児を受け入れ、育成するために、特徴的な変化を受けることが必要です。この公差は、性交中に開始受精および注入中に設立され、妊娠中を通して維持されています。母体·胎児の寛容の活性細胞および分子メディエーターは、胎盤と子宮と脱落膜組織を含む母体胎児のインターフェイスとして知られている胎児と母体組織との接触部位に濃縮されています。このインタフェースは、間質細胞および浸潤白血球で構成され、その豊かさと表現型の特徴は、妊娠の経過とともに変化します。母体胎児のインターフェイスにおける浸潤白血球は、一緒に妊娠を維持局所微小環境を作成し、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、T細胞、B細胞、NK細胞およびNKT細胞を含みます。これらの細胞間の不均衡、または任意inappropそれらの表現型でriate変化は、妊娠中の病気のメカニズムと考えられています。したがって、母体胎児のインターフェイスに侵入白血球の研究は、妊娠関連の合併症を引き起こす免疫機構を解明するために不可欠です。本明細書に記載の母体胎児の界面でのマウス組織から浸潤白血球を分離するために、タンパク質分解およびコラーゲン分解酵素カクテルと強固な酵素分解に続いて穏やかな機械的解離の組み合わせを使用するプロトコルです。このプロトコルは、十分に保存された抗原性および機能的特性を有する生存可能な白血球（&gt; 70％）の高い数の分離を可能にします。単離された白血球は、その後、免疫表現型、細胞選別、イメージング、免疫ブロット法、mRNA発現、細胞培養物、およびこのような混合白血球反応、細胞増殖、または細胞傷害性アッセイなどのインビトロの機能的アッセイを含むいくつかの技術によって分析することができます。

母体·胎児のインターフェイスからのマウスの組織の切開は、 図1に示されています。この手順は、移植部位（ 図1D）を含む、腹腔（ 図1A、B）、子宮角（ 図1C）を開くと、子宮組織の集合（ 図1E）、胎盤（ 図1F）、および脱落膜組織16.5で（ 図1G）が DPC。 図2は、単離されたマクロファージの...

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Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.1K ビュー.  Wayne State University School of Medicine. Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis. 

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Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

脳浸潤白血球の分離

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

免疫・感染学

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

のRNAの単離緑膿菌マウス消化管に定着

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

脳から隔離された白血球の単離と解析<em&gt;マラリアベルゲイ</em&gt; ANKA感染マウス

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

ヒト白血球と血小板の単離と評価のためのプロトコル：生体エネルギーと酸化バースト

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

単離と異なる高齢マウス胸腺移植片の移植。

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

ヒト母体·胎児のインターフェイスから白血球の単離

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

酵素消化および勾配分離を使用したマウス皮膚から浸潤白血球の単離

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...