この作品は、児童の健康と人間開発のユニス·ケネディ·シュライバー国立研究所、NIH / DHHSによってサポートされていました。この作品はまた、妊産婦、周産期や小児保健におけるウェイン州立大学周産期イニシアティブにより、部分的には、サポートされていました。 私たちは感謝して、原稿の彼女の重要な測定値のためのモーリーンMcGerty（ウェイン州立大学）を認めます。

このプロトコルは、フローサイトメトリーによる免疫表現の準備のために基底脱落膜および壁側脱落膜からの白血球の分離に適しています。さらに、単離された細胞は、細胞選別、細胞培養、RNAの単離、及び細胞診のために使用することができます。このプロトコルに記載されたサンプルを使用して作業する前に、人間の倫理的な承認は、現地研究倫理委員会及び治験審査会から取得する必要があります。研究目的のためのヒトサンプルの収集と利用が児童の健康と人間開発のユニス·ケネディ·シュライバー国立研究所（NICHD）、国立衛生研究所（NIH）、保健社会福祉省（DHHSの制度審査委員会によって承認されました、ベセスダ、MD、USA）とウェイン州立大学（デトロイト、MI、USA）。書面によるインフォームドコンセントは、従来の組織サンプルの集合をすべての妊婦から得ました。 注：動物血液で作業しながら、細胞、または危険組織単位剤、このプロトコルで述べたように、それは適切なバイオセーフティと実験室の安全措置に従うことが必須です。 ヒト脱落膜組織の1解剖注：基礎プレートは、ベースの下や胎盤に取り付けられており、母体の表面を表します。 chorioamniotic膜は、羊膜と絨毛膜を含みます。基底板は、基底脱落膜を含み、絨毛膜は、壁側脱落膜（ 図1）を含みます。 <ol><li>脱落膜基底<ol><li>胎盤（ 図1Aおよび図1B）のいずれかの子葉から底板の部分を解剖。 </li><li>上向きに胎盤絨毛で滅菌まな板の上に置きます。胎盤絨毛を示す側面は通常、外観の毛むくじゃらの組織と流血の赤です。基底板は、滑らかで、色は淡い赤色です。 </li><li> VILLを削除するには、シャープ、細かい点ハサミやピンセットを使用してOUの組織および血管。プロセス（ 図1C）中に1×PBS（無料- -およびMg 2+のCa 2+）に浸した組織を保ちます。これらの作品の3の2を収集し、血液（ 図1D）を除去するために、1×PBSでそれらを徹底的にすすぎます。 </li></ol></li><li>脱落膜Parietalis <ol><li> chorioamniotic膜（約10cm×10センチ、 図1E）の作品を分析。絨毛膜を上に向けて、ボードの上に置きます。絨毛側は血まみれの血栓が含まれており、通常は色が黄色がかった光です。 </li><li>できるだけ血の塊（ 図1E）の多くを除去するために、細かい点鉗子を使用してください。 1×PBSを明確に実行されるまで、膜から余分な血液をきれいにするために、滅菌1×PBS中で膜を洗浄します。 </li><li>優しく膜から脱落膜層をこすり取るために使い捨ての滅菌細胞スクレーパーを使用してください。 MEMに滅菌1X PBSを適用しますブレーンこのプロセス（ 図1F）が完成しています。脱落膜組織を収集し、滅菌1×PBS（ 図1G）で50mlのプラスチックチューブに配置します。 </li></ol></li></ol> 2.機械的脱凝集および酵素消化<ol><li> 50ミリリットルのプラスチックチューブに滅菌1×PBSで（ステップ1.2.3から）（ステップ1.1.3から）基底脱落膜または壁側脱落膜から解剖組織を洗ってください。室温で5分間、300×gで遠心分離することによって、組織のペレットを収集します。 </li><li>ペレットを乱すことなく、慎重に組織ペレットの上方に位置し、上清を吸引除去します。 注：彼らは赤血球が含まれているため、この時点では、ペレットは非常に緩んでいます。ペレットの体積が約3未満またはmlである場合、細胞剥離溶液を6mlの37℃に予め温めでペレットを再懸濁します。ペレットを3mlの体積よりも大きい場合（約2回目の追加以上の細胞剥離溶液を添加組織サンプルの電子量）。 </li><li> C管に均質化した組織（基底脱落膜+細胞剥離液や壁側脱落膜+細胞剥離液）を転送します。 </li><li>自動解離でCチューブを配置し、対応するプログラムを実行します。 注：基底脱落膜のためのプログラムは、1回あたり668合計ラウンドで17秒間実行されます。壁側脱落膜のためのプログラムは、1回あたり235合計ラウンドで37秒間実行されます。これらのプログラムは、基底脱落膜または良好な収率および細胞生存率と壁側脱落膜から白血球を分離するためにカスタマイズされています。 </li><li>組織の機械的解離に続いて、例えば、ACCUTASEとして市販されている細胞剥離液で組織を消化します。穏やかに攪拌しながら37℃で45分間（タンパク質分解およびコラーゲン分解酵素が含まれていますカクテル）。 </li></ol>白血球の3分離<ol><li>インキュベーション後、DIGEに1×10mlのPBSを追加stion混合し、50mlのプラスチックチューブに100μmのセルストレーナーを介して渡します。消化混合物の粘着性に応じて、1つは、1つの混合物のためのいくつかの細胞ストレーナーを使用する必要があります。 </li><li>室温で5分間、300×gで1×PBSでチューブと遠心分離機を記入してください。慎重に細胞ペレットの上に1×PBSを除去し、氷冷FACS緩衝液5mLでペレットを再懸濁。 注：6.1に進み、一緒に多形及び単核白血球を研究するために、単核白血球を研究するために、3.3に進みます。 </li><li> 15ミリリットルのプラスチックチューブに20％、5mlの密度勾配媒体（1.077 + 0.001グラム/ ml）を加え、ゆっくり密度勾配媒体の上に細胞懸濁液をオーバーレイ。サンプルの積層が、それは、細胞懸濁液を密度勾配媒体を混合しないことが重要です。 </li><li>ブレーキなしで4℃で30分間、500×gで、スイングアウトローターで遠心します。これは、細胞とlの混合を避けるためにブレーキをオフにすることが非常に重要ですグラデーションをosing。白血球は、密度勾配媒体およびFACS緩衝液との間のインターフェイスに記載されています。 </li><li>ピペットを用いて、非常に慎重にFACS緩衝液と細胞の破片が含まれている上位層を削除します。界面でのバンドは脱落膜単核細胞および多形核白血球の一部が含まれています。 </li><li>全く新しい15ミリリットルのプラスチックチューブに界面でのセルを転送します。 FACS緩衝液の少なくとも3倍以上のボリュームを追加します。 </li><li>細胞をペレット化するため5分間、300×gで遠心分離します。上清を吸引除去し、FACS緩衝液で細胞を洗浄します。 RTで5分間、300×gで遠心分離して別の細胞をペレット化。 注：ステップ6を参照して、免疫表現を実行するには、ステップ5を参照して、細胞選別を実行するには、ステップ4を参照して、細胞培養を行うことができます。 </li></ol> 4.アプリケーション - 細胞培養<ol><li> USI生存細胞をカウントし、RPMI培地1640 1mlにステップ3.7からの細胞を再懸濁自動セルカウンターまたは血球計およびトリパンブルー溶液0.4％をngの。 </li><li> 1×10 6細胞/ mlの細胞濃度を作るためにRPMI培地の量を加えます。細胞は、今の文化のための準備が整いました。 </li></ol> 5.アプリケーション - 初代細胞培養のためのマクロファージの単離<ol><li>磁気CD14マイクロビーズ（10 7細胞あたり20μlのビーズ）と、ステップ3.7からの細胞を標識する、CD14 +細胞を単離するために、15 4℃で分、磁場を印加することにより、細胞の他のタイプとは別のCD14 +細胞をインキュベートします。 MACSバッファーと磁場の除去により2回洗浄した後、MACS緩衝液で磁気的に保持さCD14 +細胞を溶出させます。 </li><li> RPMI培地1640中で遠心分離、再懸濁細胞ペレット次の細胞（ 図2）をメッキするための準備ができています。 </li></ol> 6.アプリケーション - 免疫表現<ol><li> immunophenotために細胞を使用するには、yping、1×1mlのPBSにステップ3.7から細胞を再懸濁します。自動セルカウンターまたは血球計およびトリパンブルー溶液0.4％を使用して生細胞を数えます。 </li><li>固定可能な生存力色素（ 図3）を用いて細胞を標識。 FACS緩衝液で2回細胞を洗浄し、染色緩衝液中で細胞を再懸濁します。 4℃で15分間のFcRブロッカーでインキュベートします。 </li><li>蛍光色素に結合させ、細胞外の抗体を追加します。例えば、このプロトコルでは、抗CD3、抗CD19、抗CD14、抗CD15、および抗CD56抗体（ 表1）を使用します。暗所で4℃で30分間インキュベートします。 </li><li> 1×PBSで2回洗浄した後、細胞を、フローサイトメーターを使用して、染色緩衝液500μl中で分析されます。脱落膜組織に見られる白血球亜集団を分析するために使用されるゲーティング戦略の表現は、 図4に示されています。 </li></ol>

The authors disclose no conflicts of interest.

ヒト母体·胎児の界面に浸潤白血球の機能および表現型特性の特徴は、妊娠障害につながる免疫機構の理解に不可欠です。いくつかの技術が妊娠10,14,25,28,37,42,43を通してヒト母体胎児のインターフェイスから白血球を単離するために記載されています。しかし、これらの技術のそれぞれが別個のものである、異なる酵素を使用するか、またはそれらの組み合わせを酵素、異なる解離時?...

妊娠は、3つの異なる免疫学的位相によって特徴付けられる：1）注入およびプロ炎症反応に関連した初期の胎盤形成（ すなわち 、注入は「開いた傷を&#39;似ています）。 2）妊娠中期および免疫恒常性は母体·胎児の界面で主に抗炎症状態を経て達成され、妊娠の第三期のほとんど。 3）分娩、プロ炎症状態1-7。免疫細胞は、妊娠6-9を通して彼らの豊かさと局在変化母体胎児の界面での炎症反応の調節に重要な役割を果たしています。 ヒトでは、母体胎児のインターフェイスは、母体（脱落膜）と胎児（絨毛膜または栄養膜）の組織との間の直接の接触面積を表しています。このインタフェースは含まれています：1）脱落膜は、線が子宮腔胎盤で覆われていないことをparietalisと並置されています平滑絨毛膜に、 2）それは間質性栄養膜10（ 図1）に侵略された胎盤の基底板に位置する基底脱落膜、。接触のこれらの領域の親密は、母体の免疫システム11-13胎児抗原暴露するための条件を作成します。驚くことではないが、白血球は、典型的な間質型細胞と腺細胞8,14,16に加えて、脱落膜細胞8,9,14,15の30〜40％までを含みます。母体·胎児の界面での白血球の役割は、栄養膜浸潤17の制限、らせん動脈のリモデリング18,19、母体の寛容12,20の維持、及び労働21-26の開始を含む複数のプロセスを包含する。適応免疫系の先天性四肢両方の白血球、 すなわち 、T細胞、マクロファージ、好中球、B細胞、樹状細胞、およびNK細胞は、脱落膜組織において同定されており、それらの割合および活性化状態は、妊娠6-10,12,14,24,27-30を通して空間的および時間的に変化することが示されています。白血球集団および/ ​​または機能の摂動は、自然流産31、子癇前症32、子宮内発育制限32,33、および早産7,24に関連しています。したがって、ヒト母体·胎児の界面における表現型の特徴と、白血球の機能の研究では、妊娠障害に調節不全の免疫学的経路の解明を容易にします。 白血球の表現型および機能的特性を決定するために使用される最も強力なツールの一つは、フローサイトメトリーを同時に複数のパラメータ34-36の定量分析を可能にする技術が流れています。フローサイトメトリーにより白血球を分析するために、単一細胞懸濁液中の白血球の分離が必要とされます。したがって、この方法は、レイを浸透分離します母体·胎児のインターフェイスからkocytesは、​​それらの表現型および機能的特性を研究するために必要とされています。 いくつかの方法は、ヒト母体胎児界面10,14,25,27,37-39から白血球を分離するために記載されています。いくつかは、機械的解離10,25,27,38を適用しているが、他の人は組織解離用の酵素消化37,40を使用しています。機械的な分解がより低い収率と低生存率41を生成し、酵素的解離は、生存能力及び細胞表面マーカーの保持42に影響を与える可能性があるため、本明細書に記載の方法は、細胞の生存率を損なうことなく、単離された白血球の収量を増加させるために、酵素前処理して穏やかな機械的解離を組み合わせます。方法の同様の組み合わせは、母体胎児界面39における脱落膜組織からの白血球の分離に有効であることが実証されています。したがって、本明細書に記載されたプロトコルは、メカを伴いますメス、かみそりの刃、または手術用はさみ10,28に対向して、従来のミンチに比べ、時間と労力を節約しながら一貫性を増加させ、自動組織解離とnical分解。組織解離のために選択された酵素は、のAccutaseました。一般的に使用されるコラゲナーゼ43とは異なり、44ディスパーゼ、トリプシン45は 、のAccutase（細胞剥離液）は、一般的なタンパク質分解的かつ効率的なまだ穏やかな解離46,47に貢献するコラーゲン分解活性の両方を兼ね備えています。解離後、白血球は、密度勾配遠心分離により脱落膜細胞の全集団から濃縮​​されます。様々な密度勾配媒体は、以前パーコール（コロイダルシリカ粒子の懸濁液）48とフィコール（高合成分子量のショ糖の重合体）49をしている最も一般的なものは、利用されてきました。ショ糖ポリマーによる分離の優れた効率はprevioされていますusly 50に示し、本明細書にさらに記載されるプロトコルは、この密度勾配媒体は、単核白血球の十分に高い純度を生成することを証明します。 したがって、本明細書に記載されたプロトコルは、ヒト脱落膜組織から白血球を分離するために、自動組織解離、細胞剥離液で酵素消化、および密度勾配媒体（1.077 + 0.001グラム/ ml）で白血球の分離と機械的に組織脱凝集を兼ね備えています。このプロトコルは、細胞生存率と共に、細胞表面抗原を維持することが証明されています。単離された白血球は、フローサイトメトリー、およびin vitroでの機能研究と免疫表現を含む、複数の用途に使用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers&#160;</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>(1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large and small Petri dishes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>(cell detachment solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 2 mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainers</td>
			<td>FALCON/Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI culture medium 1640&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>22400-089</td>
			<td>(1X) (10% FBS and 1% P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic chamber slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific Corporation</td>
			<td>HEPA Class 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ISOTEMP 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexelcom</td>
			<td>Cellometer Auto2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre-separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td>(Fc Block)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human cell surface antigen antibodies&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse/Fix buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>346202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>20% density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MAXQ 4450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSR-Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SpinChron DLX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface

妊娠は、生殖組織および母体·胎児のインターフェイス（基底脱落膜および壁側脱落膜）での白血球の浸潤を特徴とします。このインタフェースは、母体と胎児の組織との間の接触の解剖学的部位です。したがって、妊娠中の免疫学的な作用部位です。母体·胎児の界面における浸潤白血球は、移植、妊娠の維持、および配信のタイミングで中心的な役割を果たしています。したがって、これらの白血球の表現型および機能的特徴付けは、妊娠障害につながるメカニズムへの洞察を提供します。いくつかのプロトコルは、基底脱落膜および壁側脱落膜から浸潤白血球を単離するために記載されています。しかし、インキュベーションの試薬、酵素、および時間の一貫性の欠如は、それが困難なこれらの結果を比較することができます。本明細書に記載の穏やかな機械的および酵素的ディスの使用を組み合わせた斬新なアプローチであります白血球細胞外および細胞内マーカーの生存性および完全性を維持するociation技術は、母体·胎児の界面でのヒト組織から単離されました。別に免疫表現、細胞培養、および細胞選別から、このプロトコルの将来のアプリケーションは、多数かつ多様です。このプロトコルに続いて、単離された白血球をDNA インビトロ白血球機能（ すなわち 、食作用、細胞毒性、T細胞増殖、および可塑性など ） におけるメチル化、標的遺伝子の発現、および反応性酸素種の産生を決定することができます母体·胎児の界面で。また、記載されたプロトコルを使用して、この研究室では、母体·胎児の界面に新たな、希少白血球を記述することができました。

母体·胎児のインターフェイス（基底脱落膜および壁側脱落膜）でのヒト組織の切開は、図1に示されている。この手順では、基底脱落膜（ 図1A - D）を含む基底板の解剖を含んでいます。脱落膜の基底は、基底板（図1C）からの胎盤絨毛（胎児側）を除去することによって得られます。壁側脱落膜を穏やかに漿膜（ 図1E - F）...

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Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

ヒト母体·胎児のインターフェイスから白血球の単離

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.9K ビュー.  NICHD/NIH/DHHS. Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis. 

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Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV) via a rapid intracranial injection technique and how to purify a leukocyte-enriched population of infiltrating cells from whole brain. Briefly, mice are anesthetized with isoflurane in a closed chamber and are free-hand injected with a Hamilton syringe into the frontal cortex. Mice are then killed at various times after infection by isoflurane overdose and whole brains are extracted and homogenized in RPMI with a Tenbroeck tissue grinder. Brain homogenates are centrifuged through a continuous 30% Percoll gradient to remove the myelin and other cell debris. The cell suspension is then strained at 40 &mu;m, washed and centrifuged on a discontinuous Ficoll-Paque Plus gradient to select and purify the leukocytes. The leukocytes are then washed and resuspended in appropriate buffers for immunophenotyping by flow cytometry. Flow cytometry reveals a population of innate immune cells at the early stages of infection in C57BL/6 mice. At 24 hours post infection, multiple subsets of immune cells are present in the BILs, with an enriched population of Gr1+, CD11b+ and F4/80+cells. Therefore, this method is useful in characterizing the immune response to acute infection in the brain.

A rapid method to obtain infiltrating leukocytes from the murine brain is described. This method utilizes a continuous Percoll gradient and discontinuous Ficoll gradient to select and purify the leukocyte-enriched layer. Isolated leukocytes may then be characterized by flow cytometric measurements.

脳浸潤白血球の分離

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

免疫・感染学

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We describe a method for isolation and characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. Infection of susceptible mouse-strains with this parasite strain results in the induction of experimental cerebral malaria, a neurologic syndrome that recapitulates certain important aspects of Plasmodium falciparum-mediated severe malaria in humans 1,2 . Mature forms of blood-stage malaria express parasitic proteins on the surface of the infected erythrocyte, which allows them to bind to vascular endothelial cells. This process induces obstructions in blood flow, resulting in hypoxia and haemorrhages 3 and also stimulates the recruitment of inflammatory leukocytes to the site of parasite sequestration.
Unlike other infections, i.e neutrotopic viruses4-6, both malaria-parasitized red blood cells (pRBC) as well as associated inflammatory leukocytes remain sequestered within blood vessels rather than infiltrating the brain parenchyma. Thus to avoid contamination of sequestered leukocytes with non-inflammatory circulating cells, extensive intracardial perfusion of infected-mice prior to organ extraction and tissue processing is required in this procedure to remove the blood compartment. After perfusion, brains are harvested and dissected in small pieces. The tissue structure is further disrupted by enzymatic treatment with Collagenase D and DNAse I. The resulting brain homogenate is then centrifuged on a Percoll gradient that allows separation of brain-sequestered leukocytes (BSL) from myelin and other tissue debris. Isolated cells are then washed, counted using a hemocytometer and stained with fluorescent antibodies for subsequent analysis by flow cytometry.
This procedure allows comprehensive phenotypic characterization of inflammatory leukocytes migrating to the brain in response to various stimuli, including stroke as well as viral or parasitic infections. The method also provides a useful tool for assessment of novel anti-inflammatory treatments in pre-clinical animal models.

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

A method for isolation of adherent inflammatory leukocytes from brain blood vessels of Plasmodium berghei ANKA-infected mice is described. The method allows quantification as well as phenotypic characterization of isolated leukocytes after staining with fluorescent antibodies and subsequent analysis by flow cytometry.

脳から隔離された白血球の単離と解析<em&gt;マラリアベルゲイ</em&gt; ANKA感染マウス

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and neurodegenerative diseases but assessing changes in bioenergetic function in patients is challenging.&#160;Although diseases such as diabetes or atherosclerosis present clinically with specific organ impairment, the systemic components of the pathology, such as hyperglycemia or inflammation, can alter bioenergetic function in circulating leukocytes or platelets. This concept has been recognized for some time but its widespread application has been constrained by the large number of primary cells needed for bioenergetic analysis.&#160;This technical limitation has been overcome by combining the specificity of the magnetic bead isolation techniques, cell adhesion techniques, which allow cells to be attached without activation to microplates, and the sensitivity of new technologies designed for high throughput microplate respirometry.&#160;An example of this equipment is the extracellular flux analyzer. Such instrumentation typically uses oxygen and pH sensitive probes to measure rates of change in these parameters in adherent cells, which can then be related to metabolism. Here we detail the methods for the isolation and plating of monocytes, lymphocytes, neutrophils and platelets, without activation, from human blood and the analysis of mitochondrial bioenergetic function in these cells. In addition, we demonstrate how the oxidative burst in monocytes and neutrophils can also be measured in the same samples. Since these methods use only 8-20 ml human blood they have potential for monitoring reactive oxygen species generation and bioenergetics in a clinical setting.

Blood leukocytes and platelets can be used as a marker of overall bioenergetic health of an individual and so have the potential to monitor pathological processes and the impact of treatments. Here&#160;we describe a method to isolate and measure mitochondrial function and the oxidative burst in these cells.

ヒト白血球と血小板の単離と評価のためのプロトコル：生体エネルギーと酸化バースト

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.

This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.

酵素消化および勾配分離を使用したマウス皮膚から浸潤白血球の単離

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low numbers of DCs present per tissue. Yet, as the phenotype and function of DCs is modified by the tissue environment, it is necessary to analyze tissue resident DC populations, since blood derived DCs incompletely reflect the complexities of DCs in tissues. Here we present a protocol to isolate DCs from the human female reproductive tract (FRT) using hysterectomy specimens that allows both phenotypical and functional analyses. The protocol consists of tissue digestion to generate a single cell mixed cell suspension, followed by positive magnetic bead selection. Our tissue digestion protocol does not cleave surface markers, which allows phenotypical and functional analysis of DCs in the steady state, without overnight incubation or cell activation. This protocol can be adapted for the isolation of other immune cell types or isolation of DCs from other tissues.

We describe here a method to isolate and purify dendritic cells from different anatomical compartments in the human female reproductive tract for the evaluation of their phenotypical and functional characteristics. This method can be adapted to isolate other immune cells or dendritic cells from other mucosal tissues.

人間の女性の生殖器官から樹状細胞の表現型および機能研究の分離

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...