この作品は、児童の健康と人間開発のユニス·ケネディ·シュライバー国立研究所、NIH / DHHSによってサポートされていました。この作品はまた、妊産婦、周産期や小児保健におけるウェイン州立大学周産期イニシアティブにより、部分的には、サポートされていました。 私たちは感謝して、原稿の彼女の重要な測定値のためのモーリーンMcGerty（ウェイン州立大学）を認めます。

このプロトコルは、フローサイトメトリーによる免疫表現の準備のために基底脱落膜および壁側脱落膜からの白血球の分離に適しています。さらに、単離された細胞は、細胞選別、細胞培養、RNAの単離、及び細胞診のために使用することができます。このプロトコルに記載されたサンプルを使用して作業する前に、人間の倫理的な承認は、現地研究倫理委員会及び治験審査会から取得する必要があります。研究目的のためのヒトサンプルの収集と利用が児童の健康と人間開発のユニス·ケネディ·シュライバー国立研究所（NICHD）、国立衛生研究所（NIH）、保健社会福祉省（DHHSの制度審査委員会によって承認されました、ベセスダ、MD、USA）とウェイン州立大学（デトロイト、MI、USA）。書面によるインフォームドコンセントは、従来の組織サンプルの集合をすべての妊婦から得ました。 注：動物血液で作業しながら、細胞、または危険組織単位剤、このプロトコルで述べたように、それは適切なバイオセーフティと実験室の安全措置に従うことが必須です。 ヒト脱落膜組織の1解剖注：基礎プレートは、ベースの下や胎盤に取り付けられており、母体の表面を表します。 chorioamniotic膜は、羊膜と絨毛膜を含みます。基底板は、基底脱落膜を含み、絨毛膜は、壁側脱落膜（ 図1）を含みます。 <ol><li>脱落膜基底<ol><li>胎盤（ 図1Aおよび図1B）のいずれかの子葉から底板の部分を解剖。 </li><li>上向きに胎盤絨毛で滅菌まな板の上に置きます。胎盤絨毛を示す側面は通常、外観の毛むくじゃらの組織と流血の赤です。基底板は、滑らかで、色は淡い赤色です。 </li><li> VILLを削除するには、シャープ、細かい点ハサミやピンセットを使用してOUの組織および血管。プロセス（ 図1C）中に1×PBS（無料- -およびMg 2+のCa 2+）に浸した組織を保ちます。これらの作品の3の2を収集し、血液（ 図1D）を除去するために、1×PBSでそれらを徹底的にすすぎます。 </li></ol></li><li>脱落膜Parietalis <ol><li> chorioamniotic膜（約10cm×10センチ、 図1E）の作品を分析。絨毛膜を上に向けて、ボードの上に置きます。絨毛側は血まみれの血栓が含まれており、通常は色が黄色がかった光です。 </li><li>できるだけ血の塊（ 図1E）の多くを除去するために、細かい点鉗子を使用してください。 1×PBSを明確に実行されるまで、膜から余分な血液をきれいにするために、滅菌1×PBS中で膜を洗浄します。 </li><li>優しく膜から脱落膜層をこすり取るために使い捨ての滅菌細胞スクレーパーを使用してください。 MEMに滅菌1X PBSを適用しますブレーンこのプロセス（ 図1F）が完成しています。脱落膜組織を収集し、滅菌1×PBS（ 図1G）で50mlのプラスチックチューブに配置します。 </li></ol></li></ol> 2.機械的脱凝集および酵素消化<ol><li> 50ミリリットルのプラスチックチューブに滅菌1×PBSで（ステップ1.2.3から）（ステップ1.1.3から）基底脱落膜または壁側脱落膜から解剖組織を洗ってください。室温で5分間、300×gで遠心分離することによって、組織のペレットを収集します。 </li><li>ペレットを乱すことなく、慎重に組織ペレットの上方に位置し、上清を吸引除去します。 注：彼らは赤血球が含まれているため、この時点では、ペレットは非常に緩んでいます。ペレットの体積が約3未満またはmlである場合、細胞剥離溶液を6mlの37℃に予め温めでペレットを再懸濁します。ペレットを3mlの体積よりも大きい場合（約2回目の追加以上の細胞剥離溶液を添加組織サンプルの電子量）。 </li><li> C管に均質化した組織（基底脱落膜+細胞剥離液や壁側脱落膜+細胞剥離液）を転送します。 </li><li>自動解離でCチューブを配置し、対応するプログラムを実行します。 注：基底脱落膜のためのプログラムは、1回あたり668合計ラウンドで17秒間実行されます。壁側脱落膜のためのプログラムは、1回あたり235合計ラウンドで37秒間実行されます。これらのプログラムは、基底脱落膜または良好な収率および細胞生存率と壁側脱落膜から白血球を分離するためにカスタマイズされています。 </li><li>組織の機械的解離に続いて、例えば、ACCUTASEとして市販されている細胞剥離液で組織を消化します。穏やかに攪拌しながら37℃で45分間（タンパク質分解およびコラーゲン分解酵素が含まれていますカクテル）。 </li></ol>白血球の3分離<ol><li>インキュベーション後、DIGEに1×10mlのPBSを追加stion混合し、50mlのプラスチックチューブに100μmのセルストレーナーを介して渡します。消化混合物の粘着性に応じて、1つは、1つの混合物のためのいくつかの細胞ストレーナーを使用する必要があります。 </li><li>室温で5分間、300×gで1×PBSでチューブと遠心分離機を記入してください。慎重に細胞ペレットの上に1×PBSを除去し、氷冷FACS緩衝液5mLでペレットを再懸濁。 注：6.1に進み、一緒に多形及び単核白血球を研究するために、単核白血球を研究するために、3.3に進みます。 </li><li> 15ミリリットルのプラスチックチューブに20％、5mlの密度勾配媒体（1.077 + 0.001グラム/ ml）を加え、ゆっくり密度勾配媒体の上に細胞懸濁液をオーバーレイ。サンプルの積層が、それは、細胞懸濁液を密度勾配媒体を混合しないことが重要です。 </li><li>ブレーキなしで4℃で30分間、500×gで、スイングアウトローターで遠心します。これは、細胞とlの混合を避けるためにブレーキをオフにすることが非常に重要ですグラデーションをosing。白血球は、密度勾配媒体およびFACS緩衝液との間のインターフェイスに記載されています。 </li><li>ピペットを用いて、非常に慎重にFACS緩衝液と細胞の破片が含まれている上位層を削除します。界面でのバンドは脱落膜単核細胞および多形核白血球の一部が含まれています。 </li><li>全く新しい15ミリリットルのプラスチックチューブに界面でのセルを転送します。 FACS緩衝液の少なくとも3倍以上のボリュームを追加します。 </li><li>細胞をペレット化するため5分間、300×gで遠心分離します。上清を吸引除去し、FACS緩衝液で細胞を洗浄します。 RTで5分間、300×gで遠心分離して別の細胞をペレット化。 注：ステップ6を参照して、免疫表現を実行するには、ステップ5を参照して、細胞選別を実行するには、ステップ4を参照して、細胞培養を行うことができます。 </li></ol> 4.アプリケーション - 細胞培養<ol><li> USI生存細胞をカウントし、RPMI培地1640 1mlにステップ3.7からの細胞を再懸濁自動セルカウンターまたは血球計およびトリパンブルー溶液0.4％をngの。 </li><li> 1×10 6細胞/ mlの細胞濃度を作るためにRPMI培地の量を加えます。細胞は、今の文化のための準備が整いました。 </li></ol> 5.アプリケーション - 初代細胞培養のためのマクロファージの単離<ol><li>磁気CD14マイクロビーズ（10 7細胞あたり20μlのビーズ）と、ステップ3.7からの細胞を標識する、CD14 +細胞を単離するために、15 4℃で分、磁場を印加することにより、細胞の他のタイプとは別のCD14 +細胞をインキュベートします。 MACSバッファーと磁場の除去により2回洗浄した後、MACS緩衝液で磁気的に保持さCD14 +細胞を溶出させます。 </li><li> RPMI培地1640中で遠心分離、再懸濁細胞ペレット次の細胞（ 図2）をメッキするための準備ができています。 </li></ol> 6.アプリケーション - 免疫表現<ol><li> immunophenotために細胞を使用するには、yping、1×1mlのPBSにステップ3.7から細胞を再懸濁します。自動セルカウンターまたは血球計およびトリパンブルー溶液0.4％を使用して生細胞を数えます。 </li><li>固定可能な生存力色素（ 図3）を用いて細胞を標識。 FACS緩衝液で2回細胞を洗浄し、染色緩衝液中で細胞を再懸濁します。 4℃で15分間のFcRブロッカーでインキュベートします。 </li><li>蛍光色素に結合させ、細胞外の抗体を追加します。例えば、このプロトコルでは、抗CD3、抗CD19、抗CD14、抗CD15、および抗CD56抗体（ 表1）を使用します。暗所で4℃で30分間インキュベートします。 </li><li> 1×PBSで2回洗浄した後、細胞を、フローサイトメーターを使用して、染色緩衝液500μl中で分析されます。脱落膜組織に見られる白血球亜集団を分析するために使用されるゲーティング戦略の表現は、 図4に示されています。 </li></ol>

The authors disclose no conflicts of interest.

ヒト母体·胎児の界面に浸潤白血球の機能および表現型特性の特徴は、妊娠障害につながる免疫機構の理解に不可欠です。いくつかの技術が妊娠10,14,25,28,37,42,43を通してヒト母体胎児のインターフェイスから白血球を単離するために記載されています。しかし、これらの技術のそれぞれが別個のものである、異なる酵素を使用するか、またはそれらの組み合わせを酵素、異なる解離時?...

妊娠は、3つの異なる免疫学的位相によって特徴付けられる：1）注入およびプロ炎症反応に関連した初期の胎盤形成（ すなわち 、注入は「開いた傷を&#39;似ています）。 2）妊娠中期および免疫恒常性は母体·胎児の界面で主に抗炎症状態を経て達成され、妊娠の第三期のほとんど。 3）分娩、プロ炎症状態1-7。免疫細胞は、妊娠6-9を通して彼らの豊かさと局在変化母体胎児の界面での炎症反応の調節に重要な役割を果たしています。 ヒトでは、母体胎児のインターフェイスは、母体（脱落膜）と胎児（絨毛膜または栄養膜）の組織との間の直接の接触面積を表しています。このインタフェースは含まれています：1）脱落膜は、線が子宮腔胎盤で覆われていないことをparietalisと並置されています平滑絨毛膜に、 2）それは間質性栄養膜10（ 図1）に侵略された胎盤の基底板に位置する基底脱落膜、。接触のこれらの領域の親密は、母体の免疫システム11-13胎児抗原暴露するための条件を作成します。驚くことではないが、白血球は、典型的な間質型細胞と腺細胞8,14,16に加えて、脱落膜細胞8,9,14,15の30〜40％までを含みます。母体·胎児の界面での白血球の役割は、栄養膜浸潤17の制限、らせん動脈のリモデリング18,19、母体の寛容12,20の維持、及び労働21-26の開始を含む複数のプロセスを包含する。適応免疫系の先天性四肢両方の白血球、 すなわち 、T細胞、マクロファージ、好中球、B細胞、樹状細胞、およびNK細胞は、脱落膜組織において同定されており、それらの割合および活性化状態は、妊娠6-10,12,14,24,27-30を通して空間的および時間的に変化することが示されています。白血球集団および/ ​​または機能の摂動は、自然流産31、子癇前症32、子宮内発育制限32,33、および早産7,24に関連しています。したがって、ヒト母体·胎児の界面における表現型の特徴と、白血球の機能の研究では、妊娠障害に調節不全の免疫学的経路の解明を容易にします。 白血球の表現型および機能的特性を決定するために使用される最も強力なツールの一つは、フローサイトメトリーを同時に複数のパラメータ34-36の定量分析を可能にする技術が流れています。フローサイトメトリーにより白血球を分析するために、単一細胞懸濁液中の白血球の分離が必要とされます。したがって、この方法は、レイを浸透分離します母体·胎児のインターフェイスからkocytesは、​​それらの表現型および機能的特性を研究するために必要とされています。 いくつかの方法は、ヒト母体胎児界面10,14,25,27,37-39から白血球を分離するために記載されています。いくつかは、機械的解離10,25,27,38を適用しているが、他の人は組織解離用の酵素消化37,40を使用しています。機械的な分解がより低い収率と低生存率41を生成し、酵素的解離は、生存能力及び細胞表面マーカーの保持42に影響を与える可能性があるため、本明細書に記載の方法は、細胞の生存率を損なうことなく、単離された白血球の収量を増加させるために、酵素前処理して穏やかな機械的解離を組み合わせます。方法の同様の組み合わせは、母体胎児界面39における脱落膜組織からの白血球の分離に有効であることが実証されています。したがって、本明細書に記載されたプロトコルは、メカを伴いますメス、かみそりの刃、または手術用はさみ10,28に対向して、従来のミンチに比べ、時間と労力を節約しながら一貫性を増加させ、自動組織解離とnical分解。組織解離のために選択された酵素は、のAccutaseました。一般的に使用されるコラゲナーゼ43とは異なり、44ディスパーゼ、トリプシン45は 、のAccutase（細胞剥離液）は、一般的なタンパク質分解的かつ効率的なまだ穏やかな解離46,47に貢献するコラーゲン分解活性の両方を兼ね備えています。解離後、白血球は、密度勾配遠心分離により脱落膜細胞の全集団から濃縮​​されます。様々な密度勾配媒体は、以前パーコール（コロイダルシリカ粒子の懸濁液）48とフィコール（高合成分子量のショ糖の重合体）49をしている最も一般的なものは、利用されてきました。ショ糖ポリマーによる分離の優れた効率はprevioされていますusly 50に示し、本明細書にさらに記載されるプロトコルは、この密度勾配媒体は、単核白血球の十分に高い純度を生成することを証明します。 したがって、本明細書に記載されたプロトコルは、ヒト脱落膜組織から白血球を分離するために、自動組織解離、細胞剥離液で酵素消化、および密度勾配媒体（1.077 + 0.001グラム/ ml）で白血球の分離と機械的に組織脱凝集を兼ね備えています。このプロトコルは、細胞生存率と共に、細胞表面抗原を維持することが証明されています。単離された白血球は、フローサイトメトリー、およびin vitroでの機能研究と免疫表現を含む、複数の用途に使用することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers&#160;</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>(1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large and small Petri dishes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>(cell detachment solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 2 mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainers</td>
			<td>FALCON/Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI culture medium 1640&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>22400-089</td>
			<td>(1X) (10% FBS and 1% P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic chamber slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific Corporation</td>
			<td>HEPA Class 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ISOTEMP 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexelcom</td>
			<td>Cellometer Auto2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre-separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td>(Fc Block)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human cell surface antigen antibodies&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse/Fix buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>346202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>20% density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MAXQ 4450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSR-Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SpinChron DLX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface

妊娠は、生殖組織および母体·胎児のインターフェイス（基底脱落膜および壁側脱落膜）での白血球の浸潤を特徴とします。このインタフェースは、母体と胎児の組織との間の接触の解剖学的部位です。したがって、妊娠中の免疫学的な作用部位です。母体·胎児の界面における浸潤白血球は、移植、妊娠の維持、および配信のタイミングで中心的な役割を果たしています。したがって、これらの白血球の表現型および機能的特徴付けは、妊娠障害につながるメカニズムへの洞察を提供します。いくつかのプロトコルは、基底脱落膜および壁側脱落膜から浸潤白血球を単離するために記載されています。しかし、インキュベーションの試薬、酵素、および時間の一貫性の欠如は、それが困難なこれらの結果を比較することができます。本明細書に記載の穏やかな機械的および酵素的ディスの使用を組み合わせた斬新なアプローチであります白血球細胞外および細胞内マーカーの生存性および完全性を維持するociation技術は、母体·胎児の界面でのヒト組織から単離されました。別に免疫表現、細胞培養、および細胞選別から、このプロトコルの将来のアプリケーションは、多数かつ多様です。このプロトコルに続いて、単離された白血球をDNA インビトロ白血球機能（ すなわち 、食作用、細胞毒性、T細胞増殖、および可塑性など ） におけるメチル化、標的遺伝子の発現、および反応性酸素種の産生を決定することができます母体·胎児の界面で。また、記載されたプロトコルを使用して、この研究室では、母体·胎児の界面に新たな、希少白血球を記述することができました。

母体·胎児のインターフェイス（基底脱落膜および壁側脱落膜）でのヒト組織の切開は、図1に示されている。この手順では、基底脱落膜（ 図1A - D）を含む基底板の解剖を含んでいます。脱落膜の基底は、基底板（図1C）からの胎盤絨毛（胎児側）を除去することによって得られます。壁側脱落膜を穏やかに漿膜（ 図1E - F）...

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Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

ヒト母体·胎児のインターフェイスから白血球の単離

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.8K ビュー.  NICHD/NIH/DHHS. Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis. 