This work was supported by DFG grant EH 192/5-1 (A.E.), the EU (E-rare-2) project Transposmart (A.E.), the UWH Forschungsf&#246;rderung (E.S. and W.Z), and the PhD programme of the University Witten/Herdecke (P.B.). J.L. was supported by a stipend of the Chinese Scholarship council and T.B. and M.G by the Else Kr&#246;ner-Fresenius foundation (EKFS).

<ol>
	<li>Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+vectors+for+gene+delivery.">Adenovirus vectors for gene delivery.</a> Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).</li><li>Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus:+the+first+effective+in+vivo+gene+delivery+vector.">Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector.</a> Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).</li><li>Parks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+helper-dependent+adenovirus+vector+system:+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal.">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13565-13570 (1996).</li><li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production.">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol Ther. 8 (5), 846-852 (2003).</li><li>Morral, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+doses+of+a+helper-dependent+adenoviral+vector+yield+supraphysiological+levels+of+alpha1-antitrypsin+with+negligible+toxicity.">High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity.</a> Hum Gene Ther. 9 (18), 2709-2716 (1998).</li><li>Muruve, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+adenoviral+helper-dependent+vector+results+in+long-term+therapeutic+levels+of+human+coagulation+factor+IX+at+low+doses+in+vivo.">A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo.</a> Blood. 99 (11), 3923-3930 (2002).</li><li>Jager, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+construction+and+production+of+high-capacity+adenoviral+vectors.">A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors.</a> Nat Protoc. 4 (4), 547-564 (2009).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. 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著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。

ここで紹介するプロトコルは、以前に記載された手順4,12に基づいて、ヒトアデノウイルス5型に基づくHCAdVベクターの精製を可能にします。 pAdFTCプラスミド内HCAdVゲノムは、すべてのアデノウイルス遺伝子を欠いているだけ5&#39;-および3&#39;-のITRおよびパッケージングシグナルを運びます。この戦略では、HV AdNG163R-2 4は、 トランスで 、効率的なウイルス産生に必要なすべての遺伝子を提供します。またはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベースのベクター - これは明らかに第一および第二世代のADVSまたは広く使用されているレンチウイルス（LV）をoutcompetes最大35キロバイトの包装容量を提供しています。特にin vivoでのアプリケーションのためのHCAdVの第2の利点は、第一世代や第二世代のADVSとは対照的に、彼らは、細胞毒性のレベルが低下し、ウイルスタンパク質5-8の発現によって引き起こされる免疫原性の副作用が表示されているという事実です。 それにもかかわらず、ここで説明されたプロトコルは、より多くの時間であり、このようなLV-またはAAV-ベクトルと同様に第一世代や第二世代ADVSなど他のウイルスベクターよりも集中して作業。主な障害は、大規模な導入遺伝子のクローニングおよびウイルス産生プラスミドPADV-FTCの後に転送することです。ホーミングエンドヌクレアーゼの使用は、私はシャトルプラスミドpHM5から導入遺伝子の正確な、指示挿入を提供していますが、強く切断されたDNAこだわりの欠点を持っているSCE IとI-CEUを PI-。クローニング手順の間、プラスミド - とインサートDNAを調製する際にそのような理由から、多くのフェノール - クロロホルムのクリーンアップ手順が必要です。そのため、厳密に提供クローニングプロトコルを、次のことは、固くお勧めします。 HCAdVゲノムをクローニングNotI制限することによって、プラスミドpAdFTCから解放された後に酵素消化し ​​、その後プロデューサー細胞株にトランスフェクトしました。最初のトランスフェクション効率が十分なウイルスの増幅を達成するために重要であることに注意してください。重要なことは、プロトコルは、いくつかのステップを提供していますここからの手順は、後続のステップが失敗した場合に再起動することができます。前増幅中に溶解物の三分の一は、再び、その時点からの手順を開始するために、以上のウイルスが産生される必要がある場合には反復を短縮するために、バックアップとして保存することができます。 、大規模で複雑なまたはいくつかの導入遺伝子を運ぶHCAdVまたは特定のスタッファーDNAが予想よりも遅く増幅することができます。したがって、浮遊培養は、スピナーフラスコ内で成長させる前に、慎重に前増幅プロセスに従うことが重要です。前増幅が成功しない場合、手順は停止し、再び最初から開始されるべきです。前増幅は非効率的である場合、ウイルスの量は3Lのスピナーフラスコ中で増殖させた細胞に感染するのに十分に高くなるまで、追加の継代を必要とすることができます。スピナーフラスコ中の懸濁培養に代わるものとして、20 150から30ミリメートルの組織培養皿を最終継代のために使用することができます。しかし、これはより多くの時間であると集中して作業することができます。 <pそれは2つの画分にスピナーフラスコからの溶解物を分割し、これが劇的にウイルス力価を低下させないだろうとして、それらを別々にスピンすることは有益であるCsCl勾配遠心分離中にクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;。すぐに感染性HCAdVが正常に生成されたとして、それは、同時感染精製されたウイルス粒子とHVとスピナーフラスコから懸濁培養をすることによってウイルスストックを再増幅することは比較的容易です。 定量PCR測定のためのgDNAは、ここに記載のいずれかのプロトコルまたは培養細胞からのgDNAの単離のための任意の市販のキットを介して精製することができます。市販のキットを使用して、プロトコルは、一日に短縮することができるが、感染した細胞中に存在するHCAdVゲノムコピーの様々な部分が使用されるキットに応じて、精製の間に失われることがあります。したがってHCAdVゲノムは、ステップ7.4で提示された方法）と比較した場合、Q-PCR測定を以下にやや過小評価されます。 Obtai1最終ベクター調製物中のNED総感染力価は、1×10 10〜5×10 11の感染性粒子に1スピナーフラスコの範囲から派生します。この量は 、in vitro の実験で多数を実行するのに十分です。 インビボ実験でも、標的細胞に依存して、いくつかを行うことができます。例えば、全身投与後に十分な肝伝達を達成するために、1×10 9感染性粒子が必要とされています。 要約すると、広い細胞親和性と一緒にすべてのウイルス遺伝子を欠いHCAdVベクトルの改善された安全性プロファイルを有するキャプシド改変アデノウイルスを生成する可能性は、これらのHCAdVベクター系を遺伝子治療への応用のための非常に貴重なツールをレンダリングします。

遺伝子治療用途のためには、ウイルスタンパク質の発現、トランス遺伝子単独で、または着信ウイルスタンパク質により引き起こされる細胞傷害性および免疫原性の副作用を回避するために非常に重要です。アデノウイルスベクター（ADVが）が広く導入遺伝子発現1,2の影響を調査するために多種多様な細胞に外来DNAを導入するために使用されます。 AdVの最も先進的なバージョンは、3,4、すべてのウイルスコード配列を欠くし、それによって、低免疫原性および低毒性5-8と合わせ35キロバイトまでのパッケージング能力を提供する高容量アデノウイルスベクター（HCAdV）で表されます。その高い包装能力に彼らは、単一のベクター用量を使用して、大規模または複数の導入遺伝子の送達を可能に。したがって、彼らは、研究コミュニティのための貴重なツールを表します。 初段または容易に市販のキットを用いて製造することができる初期遺伝子E1及び/又はE3を欠いている第二世代のAdVとは対照的に、VECTOR HCAdVのゲノム構造とウイルス生産はより複雑です。 HCAdVゲノムを構成するためのシステムは、全てのウイルスコード配列を欠いHCAdVゲノムを有するプラスミドのpAdFTCとシャトルプラスミドpHM5 9-12に基づいています。最大14キロベース（KB）の任意の目的の遺伝子がマルチクローニングサイトは、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位を切断/認識によって隣接されたシャトルベクターpHM5にクローニングすることができるSCE IおよびI-CEU IをPI-そのため、目的のクローニングされた遺伝子は、連続したPI-SCE IとI-CEU私によって解除することができ、プラスミドpAdFTCに含まHCAdVのゲノム中に存在する同じ制限部位に後続導か挿入するためのダイジェスト。 pAdFTCではPI-SCE IとI-CEU私切断部位の間に位置する導入遺伝子の挿入部位は、スタッファーDNAと、そのような5 &#39;および3&#39;逆方向末端反復配列（ITR）としてゲノムパッケージングに必要な非コードアデノウイルス配列が隣接しています終了し5&#39;ITRの下流のパッケージングシグナルの両方で。追加のスタッファーDNAは、ウイルス産生の間に効率的なパッケージングを確保するために、27〜36キロバイトの範囲の最終HCAdVゲノムの最適なサイズを提供します。 pAdFTCには、最大45キロバイト（挿入された導入遺伝子のサイズに依存）を持つ大規模なプラスミドであり、比較的長いDNA認識部位とのホーミングエンドヌクレアーゼの使用が強い結合するDNAを示し、いくつかのクリーンアップ手順は、pHM5から導入遺伝子の転写時に必要ですので、 pAdFTCへ。剪断力を避ける慎重な取り扱いが推奨されます。 HCAdVのゲノムのITRは5&#39;ITRの上流に直接的に配置され、3&#39;ITR 12の下流にNot I制限酵素認識部位に隣接されます。したがって、HCAdV わけではありません、私はHCAdVのプロデューサー細胞株へのウイルスゲノムのその後のトランスフェクションのためにダイジェストによって解除することができます。なお、制限酵素の使用はありません私のrelのためのプラスミドpAdFTCからウイルスゲノムの容易さは、挿入された導入遺伝子ではなく、私のDNA認識部位を欠いていることを意味します。 HEK293細胞ベースのプロデューサー細胞（116細胞）を安定的にCreリコンビナーゼを発現します。ウイルス増幅のために116細胞は 、トランス3,4 で複製およびパッケージングに必要なすべてのADV遺伝子を提供するヘルパーウイルス（HV）と同時感染しています。 HVが116 セル 4内で発現Creリコンビナーゼによるウイルス増幅中に除去されるflox化パッキング信号と第一世代のAdVです。これは、完全なパッケージングシグナルを含む主にHCAdVゲノムがキャプシド化されることが保証されます。 HCAdVの前増幅は、組織培養皿内の表面上に成長させた116細胞における連続継代工程を行うことによって行われます。それぞれの継代後、ウイル​​ス粒子は、3つの連続した​​凍結融解工程を行うことにより、感染細胞から放出されます。細胞の数を増加させるあらゆる通路はに感染していると前の通路からの細胞溶解物の1/3。最後に、前増幅ステップが、大規模な増幅のためのスピナーフラスコ中の懸濁液中で増殖させたプロデューサー細胞を感染させるために使用されてから最終的に溶解物。ビリオンは、塩化セシウム密度勾配超遠心分離に4,12を行うことにより、懸濁細胞から精製されます。この手順で空の粒子と完全に組み立てられた粒子は、2つの別個の帯域に分割されています。さらにHCAdVを濃縮し、第2の非段階的な超遠心分離工程が実施される粒子。その後HCAdVを含む得られたバンドを回収し、生理的な緩衝液に対して透析します。最終ベクター調製物は、絶対的なウイルス粒子の感染性粒子およびHVの汚染レベルの数に関して特徴付けられます。絶対的なウイルス粒子は、ウイルス粒子を溶解し、260nmの吸光度を測定することにより、または定量的リアルタイムPCR（定量PCR）12を実行することによって決定することができます。 PURの感染ifiedウイルス粒子は、感染した細胞3時間後、感染中に存在HCAdVゲノムを測定するqPCRにより決定することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="896">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:312px;">I-CeuI</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:123px;">R0699S</td>
			<td style="width:315px;">restriction digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">PI-SceI</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0696S</td>
			<td>restriction digest</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">T4 Ligase</td>
			<td style="width:147px;">New Engand Biolabs</td>
			<td>M0202S</td>
			<td>ligation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">SwaI</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0604S</td>
			<td>restriction digest</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:312px;">NotI</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0189S</td>
			<td>restriction digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0290S</td>
			<td>dephosphorylation of digested plasmids</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Hygromycin B</td>
			<td style="width:147px;">PAN Biotech</td>
			<td style="width:123px;">P02-015</td>
			<td>selection of CRE expressing 116 cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM</td>
			<td style="width:147px;">PAN Biotech</td>
			<td>P04-03590&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Hek293T cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Minimal Essential Medium (MEM) Eagle</td>
			<td style="width:147px;">PAN Biotech</td>
			<td style="width:123px;">P04-08500</td>
			<td>116 cell culture medium&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffer saline (DPBS)</td>
			<td style="width:147px;">PAN Biotech</td>
			<td style="width:123px;">P04-36500</td>
			<td>washing of cells, resuspension of cells</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:312px;">250 ml storage bottle</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">CLS430281-24EA</td>
			<td>infection of 116 cells grown in suspension</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">500mL PP CentrifugeTubes</td>
			<td style="width:147px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">CLS431123-36EA</td>
			<td>sedimentation of cells from suspension culture</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Spinner flask</td>
			<td style="width:147px;">Bellco</td>
			<td style="width:123px;">1965-61030</td>
			<td>growth of 116 cells in suspension</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Ultra Clear Ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:147px;">Beckmann Coulter</td>
			<td style="width:123px;">344059</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:147px;">Beckmann Coulter</td>
			<td style="width:123px;">&#160;--</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">SW-41 rotor</td>
			<td style="width:147px;">Beckmann Coulter</td>
			<td style="width:123px;">&#160;--</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:312px;">Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane</td>
			<td style="width:147px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">132129</td>
			<td>dialysis tubing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ready-to-use dialysis cassettes&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Thermo</td>
			<td style="width:123px;">66383</td>
			<td>dialysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">one shot DH10B electrocompetent E. coli</td>
			<td style="width:147px;">invitrogen</td>
			<td>C4040-52</td>
			<td>transformation of ligation reactions</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">PureYield&#8482; Plasmid Midiprep System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A2495</td>
			<td>midiprep</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">peqGOLD Tissue DNA Mini Kit&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Peqlab</td>
			<td>12-3396-02</td>
			<td>isolation of genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SuperFect Transfection Reagent</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:123px;">301305</td>
			<td>tranfection of 116 cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">opti MEM (10 % FBS)&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Gibco</td>
			<td>31985-062</td>
			<td>transfection of 116 cells</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">iQ SYBR Green Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>&#160;170-8882</td>
			<td>q-PCR</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">CFX 96 C1000 touch&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Biorad</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">A156.1</td>
			<td>purification of DNA</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">Cesium chloride</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">8627.1</td>
			<td>density gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">sodium acetate 99%</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">6773.2</td>
			<td>DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">LB medium&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">X968.3</td>
			<td>bakterial growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">ethanol&#160; 99,8% pure</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td>9065.5&#160;</td>
			<td>DNA precipitation and washing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">SDS 99,5%</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td>2326.2</td>
			<td>lysis&#160; buffer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">EDTA</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td>lysis&#160; buffer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Tris-HCl 99%</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">9090.3</td>
			<td>dialysis buffer/ lysis&#160; buffer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">glycerol 99,5%</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">3783.1</td>
			<td>dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2 98,5%</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">KK36.2</td>
			<td>dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NaCl</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">3957.1</td>
			<td>optional dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">3904.2</td>
			<td>optional dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:312px;">sucrose</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:123px;">9286.1</td>
			<td>optional dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">Na2HPO4x2H2O</td>
			<td style="width:147px;">Carl Roth</td>
			<td>4984.2</td>
			<td>optional dialysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:312px;">1,5ml tubes</td>
			<td style="width:147px;">sarstedt</td>
			<td style="width:123px;">72,730,005</td>
			<td>storage of&#160; virus preparations at -80&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cloning and large-scale production of high-capacity adenoviral vectors based on the human adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

ここでHCAdV製剤のクローニング、増幅および精製のための代表的な例が示されています。酵素制限消化によってクローニング戦略（ 図1）とHCAdVゲノムのクローニングおよび放出のための代表的な例の概要は（ 図2）が設けられています。ダイジェスト私PI-SCE IとI-CEUによってpHM5からGOI-発現カセットおよびそれに続くフェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿のリリース後の典型的な制限パターン（ 図2A）に示されている（参照も1.2〜1.5ステップ）。典型的にpHM5プラスミドバックボーンとGOIの発現カセットに対応する第2のバンドに対応する約3 kbのバンドを観察することができます。 GOI発現カセットを含むバンドは、次いで、アガロースゲルから精製されます。精製されたGOI発現カセットを一緒に精製され、脱リン酸化pAdVFTCでアガロースゲル上で分析され、Wこと正確なサイズを確認するために、その後のライゲーション（ 図2B）のための分子の相対量を推定するために、SCE PI-IおよびI- CEUそれぞれI（ステップ1.7）で消化し ​​ました。連結後（ステップ1.8を参照）、フェノール-クロロホルム抽出、エタノール沈殿およびSWAが続く私はライゲーション産物は、細菌やクローンに変換され、ノーカットpAdFTCとその後のフェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿（ステップ1.9）を除去するためにダイジェストをアンピシリン上で選択されていますLB-寒天プレートを含みます。通常、クローン数百数十が得られ​​、5〜10個のクローンは、プラスミドDNAのミニ調製物のために調製されます。一緒に陰性対照としての空pAdFTCで正と負のクローンの分析のHinc II消化物の制限パターンは（も1.10ステップ参照）（ 図2C）が示されています。ここで陽性クローンは、5キロバイトバンドを示さないことは、空pAdFTCと負のクローン中に存在し、1.7kbの断片が表示されます。それは空pAdFTCと負のクローンには存在しません。このそれぞれのGOIは、これはthaのクローニングが成功したことを示します。ミディプレップにより精製された陽性クローンはその後pAdVFTC-GOI（ステップ2.2）からGOIを運ぶHCAdVゲノムを放出することはありません TIで消化し ​​ました。最後に、 無 Tiは消化し ​​ないDNA IST二回116細胞へのトランスフェクションに続くDNAの高純度を確保するために、フェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を用いて精製しました。 ノー TIのごく一部の分析は、アガロースゲル上でpAdVFTC-GOIを消化pAdFTCプラスミドバックボーンと（GOI発現カセットのサイズに応じて）〜までの36キロバイトの大帯域に対応〜9キロバイトのバンドを示しますHCAdVゲノム（ 図2D）に対応します。増幅および精製パイプラインの概要を模式的に（ 図3）に示されています。ベクタープリ増幅プロセスの監視の代表的な例は、（設けられています。 <stronG&gt;図4）。ウイルス溶解物の連続継代により増幅前処理中にウイルスゲノムの一般的な増幅曲線、HV（セクション2）でcoinfectingたびに、それは、定量PCR（セクション3）によりモニターした（ 図4A）が示されています。ベクターゲノムの数は、通常、最初の通路の間にdescreasesと強く以降の通路に増加することに注意してください。 10 6のベクターのコピー数- 15000個の細胞あたり10 7は、3リットルのスピナーフラスコ中で大規模生産のための116細胞を感染するのに十分です。 HCAdVベクターゲノム内GOIはGFP発現カセットを含んでいる場合、プリ増幅プロセス（セクション2）は、蛍光顕微鏡によってモニターすることができます。各通路の代表画像が（ 図4B）が示されています。 GFP陽性細胞の数は、通常、最初の通路の間に減少し、強く後半の通路に増加することに注意してください。 GFP陽性細胞の数は約100％に達すると、ベクターはsuffを増幅しiciently 3リットルのスピナーフラスコ中で大規模生産のために116細胞に感染します。 GFP発現カセットを含むHCAdVの大規模増幅プロセスは、組織培養皿にスピナーフラスコから移した培養培地および細胞の顕微鏡分析によりモニターしました。懸濁培養でHCAdVを産生する細胞の顕微鏡写真を（ステップ4.4および4.11を参照のこと）（ 図4C）が設けられています。細胞が先行する細胞増殖が十分であったことを示す塊に成長しているし、細胞が健康であることに注意してください。これらの細胞の蛍光顕微鏡〜100％を使用するときには、バイオリアクターで効率的なベクター生産の懸濁細胞の効率的な形質導入を示し、GFP陽性でした。ベクター粒子は、塩化セシウム超遠心分離によって培地と3リットルの懸濁培養細胞から精製しました。塩化セシウム密度勾配超遠心分離を使用してHCAdVベクター精製の ​​代表的な画像は、（ 図5）が示されています。後n個のCsCl段階勾配を使用して初期の遠心分離は、通常、2つのバンドが観察されます。下のバンドはベクター粒子（ステップ5.4- 5.5）（ 図5A）を含むDNAで構成されているのに対し、上のバンドは、部分的なキャプシドの空が含まれています。ベクター粒子を含むDNAは、続いて（ステップ5.6）を回収し、ベクター粒子を濃縮するための第二の超遠心分離工程のためにプールします。このステップは、通常、最終的には、その後の透析（ステップ5.7- 5.8）（ 図5B）のために採取されたベクター粒子を含むDNAの単一バンドになります。透析したベクター調製物は、絶対粒子、感染性粒子とHV汚染の数を測定することによって特徴づけられました。滴定法（セクション6および7）の模式的な概要は（ 図6）が設けられています。最終ベクター調製物の特性評価のための代表的な結果を（ 図7）が示されています。棒グラフは、典型的なベクター粒子の数を示していますこのプロトコルに記載された手順により得られました。ベクター粒子の絶対粒子数を光学密度（項6）によって決定した、感染性ベクター粒子およびHV汚染を定量PCR（セクション7）（ 図7A）により測定しました。経験は、ODの力価は、ウイルス粒子の数を過大評価することを、示しています。 ODにより測定された絶対ウイルス粒子は、Q-PCRにより測定された感染性ウイルス粒子よりも500倍高い20-することができます。両方のQ-PCR（セクション7）により測定したときに感染性ベクター粒子をusally絶対粒子の5〜10％の範囲です。ベクター調製物は、非常に良好な品質を有している場合、絶対粒子の20％以上が感染性です。 HVおよび感染HCAdV粒子（ステップ7.14）との間の典型的な比率は、通常、感染性粒子（ 図7B）の1〜5％の範囲です。 HVは、複製欠損であるので、これは許容可能です。それにもかかわらず、できるだけ少ないHV汚染など（感染性粒子の&lt;1％）になります好まれます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52894/52894fig1.jpg" /> pAdFTCにGOIをクローニングする図1のフローチャート。GOIはpHM5シャトルプラスミドのMCSにクローン化します。プラスミドpAdFTCとpHM5-GOIは、I-CEU IおよびPI-SCE Iで消化し ​​、フェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製されています。消化pAdFTCプラスミドを脱リン酸化されるのに対し、消化pHM5は、（も1.5ステップ参照）、目的の遺伝子を精製する調製用アガロースゲルにロードされています。その後、CIP処理したpAdFTCおよび導入遺伝子発現カセットとの連結反応をセットアップする（ステップ1.8を参照）、終了した後、フェノール - クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製されます。フェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿に続くライゲーション産物のその後のSWA私ダイジェストを挿入せずにpAdFTCを有するクローンの成長を防ぐことができます。ブラックトライ角度は、制限酵素認識部位を示します。灰色のボックスがAdV5は逆方向末端反復を示す（ITR）、Ψが付いている白い箱がAdV5パッケージングシグナルを示し、赤色の矢印はプロモーターを示し、緑色のボックスは、（目的の遺伝子、GOI）が発現する導入遺伝子を示し、青色のボックスは、ポリアデニル化シグナル、オレンジやブルーを示します矢印は、それぞれ、プラスミド骨格の抗生物質耐性遺伝子を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52894/52894fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52894/52894fig2.jpg" /> 図pAdVFTCからHCAdVゲノムのクローニング手順とリリースの2代表的な結果。 PI-SCE IとI-CEU私ダイジェスト（も1.2〜1.5ステップ参照）によってpHM5からGOI-発現カセットの（A）リリース。（B） </stroNG&gt; PI-SCE IとI-CEUそれぞれI（ステップ1.7）で消化し ​​、GOI-発現カセットおよび精製、脱リン酸化pAdVFTCを精製した。（C）とし、GOI（も1.10ステップ参照）なしpAdVFTCクローンの分析のHinc II消化。 （D）いいえ TIダイジェスト（ステップ2.2）によるpAdVFTC-GOIからGOIを運ぶHCAdVゲノムのリリースは、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52894/52894fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52894/52894fig3.jpg" /> 図3.高容量アデノウイルスベクターの増幅および精製するための模式図 （A）HCAdV DNAトランスフェクションおよびヘルパーウイルス（HV）感染：線形化HCAdVゲノムのトランスフェクションHCAdVプロデューサー細胞株にGOIを運ぶ（116細胞[4]）そして、SUHV AdNG163R-2とbsequent感染[4]。 &#160; （B）HCAdVの増幅：プレ増幅工程の後に直列に新しい組織培養皿に細胞溶解物を移送し、HVで共感染させることにより、大規模生産が3リットルの懸濁培養で実施される（C）HCAdV精製：について精製ウイルスを、塩化セシウム勾配を用いた超遠心分離によって単離されている（D）透析：精製HCAdV粒子が2 L貯蔵緩衝液に対して透析します。 HCAdV、高容量アデノウイルスベクター; ITR、アデノウイルス血清型5逆方向末端反復; Ψ、パッケージングシグナル; HV、ヘルパーウイルス; MOI、感染多重度は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52894/52894fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52894/52894fig4.jpg" /> &lt;BR /&gt; 増幅プロセスの定量PCRを用いてウイルスゲノムの増幅による前増幅工程の（A）モニタリング の 図4. 代表的な結果 （また、セクション3を参照）。（B）は GOIは、導入遺伝子としてGFPが含まれている場合は、予備増幅工程は、蛍光顕微鏡によってモニターすることができる。スピナーフラスコにおける大規模な増幅プロセスの（C）代表的な結果は、GFPをコードするために例示HCAdV。左側のパネルには、スピナーフラスコから感染した116細胞の顕微鏡写真を示します。培地および細胞のサンプルを60mm組織培養皿に移しました。増幅された細胞の塊が見えることに注意してください。右側のパネルには、蛍光顕微鏡を用いて同じ画像を表示します。細胞のほぼ100％がGFPを運ぶHCAdVで形質導入されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52894/52894fig4large.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてください。</a>この図の拡大版を表示します。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52894/52894fig5.jpg" /> CsCl勾配遠心分離後図5.代表的な結果ステップ勾配を実行した後、（A）（も5.5ステップ参照）。。（B）連続勾配の後（また、5.7ステップ参照） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52894/52894fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52894/52894fig6.jpg" /> 滴定法の6概略概要図。感染性粒子（A）の測定：マルチウェルプレート中の細胞は、精製されたウイルスの異なる体積で感染させ、細胞ペレットとして収集される（B）測定 O。F絶対粒子：Unifected細胞をトリプシン処理し、遠心分離によって収集されたマルチウェルを形成します。再懸 ​​濁精製ウイルスが追加され、ゲノムDNAを単離した後。ゲノムDNAの（C）の単離。（D）定量的PCR（Q-PCR）を行うウイルスゲノムコピー数を定量化するために。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52894/52894fig6large.jpg" target="_blank">これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください図。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/52894/52894fig7.jpg" /> 最終ベクター調製物の特性7.代表的な結果を図。 （A）異なる方法で決定提示プロトコルに従ってベクター調製物の粒子の絶対数：OD価は定量PCR（セクション7）により測定された光学密度（セクション6）、感染力価とHVの汚染によって測定された（B）qPCRs（セクション7）により測定した全感染HCAdV粒子とHVの汚染レベルとの比率。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52894/52894fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

ヒトアデノウイルス5型に基づく高容量アデノウイルスベクターのクローニングおよび大規模生産

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.3K ビュー.  University Witten/Herdecke. A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans. 

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Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.

Despite the outstanding mechanical and biochemical properties of spider silks, this material cannot be harvested in large quantities by conventional means. Here we describe an efficient strategy to spin artificial spider silk fibers, which is an important process for investigators studying spider silk production and their use as next-generation biomaterials.

実験室規模の合成クモの糸生産

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

生物工学

Multi-analyte Biochip (MAB) Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes (ASSISE) for Physiological Research

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) that can withstand prolonged storage in complex biological media 1-4. An all-solid-state ion-selective-electrode (ASSISE) is especially attractive for the aforementioned applications. The electrode should have the following favorable characteristics: easy construction, low maintenance, and (potential for) miniaturization, allowing for batch processing. A microfabricated ASSISE intended for quantifying H+, Ca2+, and CO32- ions was constructed. It consists of a noble-metal electrode layer (i.e. Pt), a transduction layer, and an ion-selective membrane (ISM) layer. The transduction layer functions to transduce the concentration-dependent chemical potential of the ion-selective membrane into a measurable electrical signal.
The lifetime of an ASSISE is found to depend on maintaining the potential at the conductive layer/membrane interface 5-7. To extend the ASSISE working lifetime and thereby maintain stable potentials at the interfacial layers, we utilized the conductive polymer (CP) poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) 7-9 in place of silver/silver chloride (Ag/AgCl) as the transducer layer. We constructed the ASSISE in a lab-on-a-chip format, which we called the multi-analyte biochip (MAB) (Figure 1).
Calibrations in test solutions demonstrated that the MAB can monitor pH (operational range pH 4-9), CO32- (measured range 0.01 mM - 1 mM), and Ca2+ (log-linear range 0.01 mM to 1 mM). The MAB for pH provides a near-Nernstian slope response after almost one month storage in algal medium. The carbonate biochips show a potentiometric profile similar to that of a conventional ion-selective electrode. Physiological measurements were employed to monitor biological activity of the model system, the microalga Chlorella vulgaris.
The MAB conveys an advantage in size, versatility, and multiplexed analyte sensing capability, making it applicable to many confined monitoring situations, on Earth or in space.
Biochip Design and Experimental Methods
The biochip is 10 x 11 mm in dimension and has 9 ASSISEs designated as working electrodes (WEs) and 5 Ag/AgCl reference electrodes (REs). Each working electrode (WE) is 240 &mu;m in diameter and is equally spaced at 1.4 mm from the REs, which are 480 &mu;m in diameter. These electrodes are connected to electrical contact pads with a dimension of 0.5 mm x 0.5 mm. The schematic is shown in Figure 2.
Cyclic voltammetry (CV) and galvanostatic deposition methods are used to electropolymerize the PEDOT films using a Bioanalytical Systems Inc. (BASI) C3 cell stand (Figure 3). The counter-ion for the PEDOT film is tailored to suit the analyte ion of interest. A PEDOT with poly(styrenesulfonate) counter ion (PEDOT/PSS) is utilized for H+ and CO32-, while one with sulphate (added to the solution as CaSO4) is utilized for Ca2+. The electrochemical properties of the PEDOT-coated WE is analyzed using CVs in redox-active solution (i.e. 2 mM potassium ferricyanide (K3Fe(CN)6)). Based on the CV profile, Randles-Sevcik analysis was used to determine the effective surface area 10. Spin-coating at 1,500 rpm is used to cast ~2 &mu;m thick ion-selective membranes (ISMs) on the MAB working electrodes (WEs).
The MAB is contained in a microfluidic flow-cell chamber filled with a 150 &mu;l volume of algal medium; the contact pads are electrically connected to the BASI system (Figure 4). The photosynthetic activity of Chlorella vulgaris is monitored in ambient light and dark conditions.

Multi-analyte Biochip MAB Based on All-solid-state Ion-selective Electrodes ASSISE for Physiological Research

All-solid-state ion-selective electrodes (ASSISEs) constructed from a conductive polymer (CP) transducer provide several months of functional lifetime in liquid media. Here, we describe the fabrication and calibration process of ASSISEs in a lab-on-a-chip format. The ASSISE is demonstrated to have maintained a near-Nernstian slope profile after prolonged storage in complex biological media.

生理学的研究のための全固体型イオン選択性電極（ASSISE）に基づき、多検体バイオチップ（MAB）

Lab-on-a-chip (LOC) applications in environmental, biomedical, agricultural, biological, and spaceflight research require an ion-selective electrode (ISE) ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

ポリ（εカプロラクトン）エレクトロ糸にヒト間葉系幹細胞の添付ファイルの最適化

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

スフェロイドにおける哺乳動物細胞の大規模拡張のための連続供給することによって栄養規制

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Evaluation of Keratinocyte Proliferation on Two- and Three-dimensional Type I Collagen Substrates

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. Both forms can be prepared with the same type I collagen. In general, the non-fibrous form promotes cell adhesion and proliferation. The fibril form (gels) provides more physiological conditions in many types of cells; therefore, gel culture is useful for examining physiological behaviors of cells, such as drug efficacy.
Researchers can select the appropriate form according to the purpose of its use. For example, in the case of keratinocytes, on-gel culture has been used as a wound healing model. FEPE1L-8, a keratinocyte cell line cultured on the non-fibrous form of type I collagen, promote cell adhesion. Notably, keratinocyte proliferation is slower on the fibril form than the non-fibrous form. Protocols for the preparation of type I collagen for cell culture are simple and have wide applications depending on the experimental needs.

Here, we present a protocol for the preparation of two different forms of culture substrates utilizing type I collagen. Depending on how collagen is handled, collagen molecules either maintain two-dimensional, non-fibrous form or reassemble into three-dimensional, fibril form. Cell proliferation on type I collagen is drastically affected by fibril formation.

ケラチン生成細胞増殖の 2 次元と 3 次元の評価タイプ I コラーゲン基板

Type I collagen, useful as a substrate for cell culture, exists in two forms: the two-dimensional, non-fibrous form and three-dimensional, fibril form. ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a key hemodynamic parameter related to cerebral oxygen supply. Resting state low frequency fluctuations based on oxygenation contrast have been shown to provide correlations between functionally connected regions. The presented protocol uses optical diffuse correlation spectroscopy (DCS) to assess blood flow-based resting state functional connectivity (RSFC) in the human brain. Results of CBF-based RSFC in human frontal cortex indicate that intra-regional RSFC is significantly higher in the left and right cortices compared to inter-regional RSFC in both cortices. This protocol should be of interest to researchers who employ multi-modal imaging techniques to study human brain function, especially in the pediatric population.

This protocol demonstrates how to measure resting state functional connectivity in the human prefrontal cortex using a custom-made diffuse correlation spectroscopy instrument. The report also discuss practical aspects of the experiment as well as detailed steps for analyzing the data.

脳血流ベースの安静状態機能性コネクティビティ(光学拡散相関分光法)

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

An Efficient Method for Adenovirus Production

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types and organs. However, recombinant adenoviral technology is laborious, time-consuming, and expensive. Here, we present an improved protocol using the pAdEasy system to obtain purified adenoviral particles that can induce a strong green fluorescent protein (GFP) expression in transduced cells. The advantages of this improved method are faster preparation and decreased production cost compared to the original method developed by Bert Vogelstein. The main steps of the adenoviral technology are: (1) the recombination of pAdTrack-GFP with the pAdEasy-1 plasmid in BJ5183 bacteria; (2) the packaging of the adenoviral particles; (3) the amplification of the adenovirus in AD293 cells; (4) the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium; and (5) the viral titration and functional testing of the adenovirus. The improvements to the original method consist of (i) the recombination in BJ5183-containing pAdEasy-1 by chemical transformation of bacteria; (ii) the selection of recombinant clones by &#8220;negative&#8221; and &#8220;positive&#8221; PCR; (iii) the transfection of AD293 cells using the K2 transfection system for adenoviral packaging; (iv) the precipitation with ammonium sulfate of the viral particles released by AD293 cells in cell culture medium; and (v) the purification of the virus by one-step cesium chloride discontinuous gradient ultracentrifugation. A strong expression of the gene of interest (in this case, GFP) was obtained in different types of transduced cells (such as hepatocytes, endothelial cells) from various sources (human, bovine, murine). Adenoviral-mediated gene transfer represents one of the main tools for developing modern gene therapies.

Here, we present a protocol for adenovirus production using the pAdEasy system. The technology includes the recombination of the pAdTrack and pAdEasy-1 plasmids, the adenovirus packaging and amplification, the purification of the adenoviral particles from cell lysate and culture medium, the viral titration, and the functional testing of the adenovirus.

アデノウイルス産生のための効率的な方法

Adenoviral transduction has the advantage of a strong and transient induction of the expression of the gene of interest into a broad variety of cell types ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Production of Membrane-Filtered Phase-Shift Decafluorobutane Nanodroplets from Preformed Microbubbles

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different techniques and varies in price, materials, and purpose. Many of these fabrication methods result in polydisperse populations with non-uniform activation thresholds. Additionally, controlling the droplet sizes typically requires stable perfluorocarbon liquids with high activation thresholds that are not practical in vivo. Producing uniform droplet sizes using low-boiling point gases would be beneficial for in vivo imaging and therapy experiments. This article describes a simple and economical method for the formation of size-filtered lipid-stabilized phase-shift nanodroplets with low-boiling point decafluorobutane (DFB). A common method of generating lipid microbubbles is described, in addition to a novel method of condensing them with high-pressure extrusion in a single step. This method is designed to save time, maximize efficiency, and generate larger volumes of microbubble and nanodroplet solutions for a wide variety of applications using common laboratory equipment found in many biological laboratories.

This protocol describes a method of generating large volumes of lipid encapsulated decafluorobutane microbubbles using probe-tip sonication and subsequently condensing them into phase-shift nanodroplets using high-pressure extrusion and mechanical filtration.

プレフォームマイクロバブルからの膜濾過相シフトデカフルオロブタンナノ液滴の製造

There are many methods that can be used for the production of vaporizable phase-shift droplets for imaging and therapy. Each method utilizes different ...

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the dynamic properties of the cytoskeleton. This protocol offers a technique for human primary fibroblast transfection, which can be difficult because of the specifics of primary cell cultivation conditions. Additionally, cytoskeleton dynamic property maintenance requires a low level of transfection to obtain a good signal-to-noise ratio without causing microtubule stabilization. It is important to take measures to protect the cells from light-induced stress and fluorescent dye fading. In the course of our work, we tested different transfection methods and protocols as well as different vectors to select the best combination of conditions suitable for human primary fibroblast studies. We analyzed the resulting time-lapse videos and calculated microtubule dynamics using ImageJ. The dynamics of microtubules' plus-ends in the different cell parts are not similar, so we divided the analysis into subgroups - the centrosome region, the lamella, and the tail of fibroblasts. Notably, this protocol can be used for in vitro analysis of cytoskeleton dynamics in patient samples, enabling the next step towards understanding the dynamics of the various disease development.

This protocol is dedicated to the microtubule plus-end visualization by EB3 protein transfection to study their dynamic properties in primary cell culture. The protocol was implemented on human primary skin fibroblasts obtained from Huntington's disease patients.

ヒト原発性皮膚線維芽細胞に基づくハンチントン病モデルにおける微小管プラスエンドダイナミクスの可視化

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...