ルーマニアのブカレスト出身のニコラエ・シミオネスク細胞生物学・病理学研究所へようこそ。ここでは、ウイルス導入研究室で、Vogelstein教授が開発したAdEasyシステムに基づく最適化された方法論を用いて、アデノウイルス粒子産生の一部を示す。このアデノウイルスを産生する技術の主なステップは、1つは、BJ5183細菌中のpAdEasy-1プラスミドとGFPを含むpAdTrackの組換えである。
2つは、アデノウイルス粒子を包み込む。3つは、AD293細胞におけるアデノウイルスの増幅である。4つは、細胞ライセートおよび培養培地からのアデノウイルス粒子の精製。
5、アデノウイルスのウイルス滴定および機能試験。ここでは、方法論の重要なステップを提示します。細胞ライセートおよび培養培地からのアデノウイルス粒子の精製。
アデノウイルスの精製は、ウイルス産生細胞および培地の採取から始まる。AD293細胞を組換えプラスミドにトランスフェクトし、アデノウイルスをパッケージ化した。次いで、アデノウイルスを、連続した大きな培養によって増幅した。
ここで、25枚のT175プレートを得て、細胞ライセートと培養培地からアデノウイルスの精製を開始した。まず、トランスデューセ細胞で発現するGFPの緑色蛍光を確認した。細胞がまだ付着している場合は、培養皿をタップするか、長いスクレーパーを使用してそれらを取り外します。
細胞および培地が収集される。フラスコはPBSで洗浄され、ファルコンチューブにも採取されます。細胞は遠心分離によってペレット化される。
アデノウイルスをさらに精製するための培地と同様に、細胞ペレットを保管してください。このステップでは、同僚の助けは収穫プロセスを加速するために十分に高く評価される。GFPの発現により、細胞ペレットは緑色です。
ペレットは、細胞の破壊を促進する高トニックトリスバッファーに再懸濁されます。細胞のリシスには液体窒素を使用し、乾燥ガスは37度まで温めます。ウイルスが損傷を受けるため、3 サイクル以上実行しないでください。
細胞破壊の効率を高めるために、細胞を23ゲージの注射針を通して均質化する。細胞のリセートを9、600xgで12分間遠心分離する。新しいチューブに上清を渡し、ペレットを捨てます。
超遠心分離機によるさらなる処理のために氷の上に上清を保ちます。そこで、培養培地を処理して、細胞から放出されたアデノウイルスを単離する。このために、まず、必要量の硫酸アンモニウムを加え、培養液を回収したボトルに添加します。
ボトルは、結晶が完全に溶解するまで激しく揺れます。混合物を室温で2時間及び半分にインキュベートする。次いで沈殿物の懸濁液をファルコンチューブに分割する。
遠心分離機は1,600xgで15分間用いた。遠心分離後、上清は廃棄され、ペレットは10ミリモルトリスバッファーに再懸濁される。超遠心分離工程でアデノウイルスの精製を継続できない場合、沈殿物は、4度で数日間保持することができるが、硫酸アンモニウムを除去するために透析後にのみ維持することができる。
ここでは、透析のステップを発表しました。シリンジを使用して、以前に濡れたカセットに懸濁液を導入します。サンプルは、4度で一晩10ミリモルトリスバッファーに対して透析されます。
精製の最終ステップは、塩化セシウム不連続勾配上の超遠心分離工程で表される。勾配を形成するために、まず、塩化セシウムの高密度溶液の3ミリリットルをピペット化する。この層の上に、低密度塩化セシウムの3ミリリットルを静かに注ぎます。
細胞ライセートまたは培養培地からのアデノウイルス粒子懸濁液は、次いで、勾配の上に重ねられます。チューブはミネラルオイルで満たされ、SW41バケットに導入されています。平衡後、チューブは、超遠心分離機に導入されるローターに対称的にロードされます。
遠心分離機は35,000 RPM、4度を故障なく18時間実行します。超遠心分離後、チューブはバンドを収穫するために後ろに黒い紙を置いてスタンドに置かれます。透明な上相および細胞の破片は、漂白液と廃容器に捨てる。
完全なアデノウイルスを含む最も低いバンドはピペット先端で収穫され、生殖不能のエッペンドルフ管で集められる。透析後、スクロースはウイルス懸濁液に4%の最終濃度に添加され、ウイルスアリコートはマイナス80度で凍結し続ける。結果のセクションでは、得られたアデノウイルスを導入した細胞におけるGFP発現を示した。
導入から48時間後、GFPは蛍光顕微鏡で示されるようにトランスデューセされた細胞によって発現される。GFP発現細胞の割合は、フローサイトメトリーによって決定される。ヒトおよびウシの内皮細胞の約50%が、細胞当たり25の導入単位で導入され、GFP陽性である。
マウス肝細胞に対して同じ伝達収率が得られたのは、細胞当たり5つのトランスダクションユニットしか使用されなかったが、これは細胞感受性による死亡率の上昇と関連している。GFP発現に還元し、特定の受容体の発現が低いため間葉間質細胞の形質転換により得られた。結論的な発言。
これらの手間のかかる技術を最適化して、アデノウイルス粒子の取得に必要な時間、コスト、および労力を削減します。調製されたアデノウイルスは、様々な細胞型に感染し、目的の遺伝子の発現を誘導することができる。
