我々は、特定のマーカス·ミュラー、シルビアミュンスターマン、バーバラLiebetrau、とマンディロッシャーで、DKFZウイルスの生産と開発部のチームに感謝しています。本研究では、部分的に教育研究（BMBF）とドイツKrebsforschungszentrum /Cancéropôleデュグランドエスト応用腫瘍ウイルスの共同プログラムの枠組みの中で、ヘルムホルツ協会の連邦省からの補助金によって支えられてきた。

バイオセーフティーレベル2実験室、組換えパルボウイルス（recPV）の生産に必要とされることに注意してください。 プロトコルは、主に2つの部分に分割されます。最初の部分（トランスフェクションを介してrecPVの生産）プロトコルの2番目の部分（感染症を介してrecPVsの生産）に接種としてrecPVs最小限の量を生成する必要があります。一度recPVs少量のプロトコルの最初の部分は省略することができ、生成され、組換えパルボウイルスは、アデノウイルスヘルパーを介してパルボウイルスキャプシドタンパク質（下記参照）をコードする遺伝子を提供する感染症を介して増幅することができます。 1。トランスフェクションを介したrecPVsの生産 1.1ウイルスDNAトランスフェクションこれは、いずれかのカチオン性脂質またはリン酸カルシウムに基づくプロトコルのこのセクション内の任意の確立されたDNAトランスフェクション法を使用することが可能です。我々は一般的にトランスフェクションHを使用Dトランスフェクション試薬。トランスフェクション効率を制御するために、我々は、発現プラスミド強化緑色蛍光タンパク質（ 例えば、pEGFPを-N1、Clontech社製）で追加のプレートをトランスフェクトすることをお勧めします。細胞集団の少なくとも50％がEGFP陽性トランスフェクション24時間後の結果時にトランスフェクション効率とウイルス産生のための最適と考えられている。 <ol><li>トランスフェクションの前に1日、10 cmのプレートでシード200万HEK293T細胞、トランスフェクションの日で50％コンフルエントの細胞を取得する。 10％ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、mlペニシリン100 Uおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）10mlの細胞を成長させる。 </li><li> 1.5 mlチューブでウイルス意思混合物（モル比1時02分01秒）を準備<ol class="lalpha"><li> recPVベクトル3μgのは、関心のある遺伝子（EI PHH-1-GFP 6）を保有する。 </li><li>ベクターpCMV / VP 5保有するパルボウイルスキャプシド遺伝子単位の6μgの</li><li> 8μgのOFアデノウイルス由来のヘルパープラスミドpXX6 7。 </li></ol></li><li> 850μL（20 ng /μlに最終濃度）の無血清培地を有するプラスミドミックスを希釈する。 </li><li> 42.5μlのトランスフェクションのHD（：μgのDNA 2.5:1の比率添加トランスフェクション）を追加します。媒体へのトランスフェクションを追加するときにチューブの側面に触れないでください。 </li><li> 5〜10秒間静かに渦。 </li><li>室温で30分間混合物をインキュベートします。 </li><li>細胞にトランスフェクション混合物の滴下を追加します。均等に全体に混合物を配布するために静かにプレートを横に振る。 </li></ol> 1.2ウイルス産生<ol><li>収穫前に72時間、92％湿度、5％CO 2で37℃でプレートをインキュベートします。この期間の間に子孫パルボウイルス粒子は、パルボウイルスプラスミドから形成される。 </li></ol> 1.3ウイルスの収穫<ol><li>組織培養フードには、それらの培地内で細胞をこすり、15にプレートから懸濁液を吸引し、転送mlのプラスチックチューブ。 </li><li>室温で5分間250×gでチューブを遠心します。 </li><li>上清の95％を削除します。 </li><li>ボルテックスチューブは穏やかに残りの上清（約0.5 ml）にペレットを再懸濁します。 </li><li> -80チューブを凍結℃にこの段階では生産を停止するか、またはプロトコルを続行することが可能です。 </li><li>懸濁液を解凍し、室温でそれを持って来る。 </li><li> 37℃温水で液体窒素浴融解℃で懸濁液を凍結ボルテックス15秒精力的にチューブとさらに2回の凍結融解サイクルを繰り返します。 </li><li> 4℃で15分間16,000 xgでチューブを遠心℃、 </li><li>新しいチューブに上清を収集します。この段階では、チューブは、粗製ウイルス抽出の準備を含んでいます。 </li><li>ウイルス滴定（下記参照）に進みます。 GFP遺伝子を運ぶrecPVについては、典型的な生産量は約1に対応する1から3×10 7のウイルス感染単位を与えるべきである-3×10 10ウイルスゲノムは、粒子を含有する。 </li></ol> 1.4ウイルスストレージ<ol><li>長期保存のために-80℃で原油ウイルス抽出物を含有するチューブを凍結℃にプロトコルの第二部に接種として粗ウイルスの抽出物を使用することが可能です。 </li></ol> 2。感染経由recPVsの生産感染症を介してrecPVの生産を開始する前に、標準プロトコル8に従ってパルボウイルスVP遺伝子（AD-VPヘルパー、5で説明）を運ぶアデノウイルス5を生産し、精製する。それはまた、興味のある遺伝子（ 例えば 、上述したようにトランスフェクションを介して生成）を運ぶrecPVsの最小量を持っていることが必要である。 以下では、175cm 2のフラスコ（T175）形式でrecPV生産を説明します。この方法で産生されたウイルス株のさらに増幅は10多層CellSTACK培養室（コーニング）で行うことができる提案プロトコルのマイナー調整を加えたものである。 2.1感染症<ol><li>感染症の日に60から80パーセントの細胞密集度を得るためのT175フラスコ内の感染症、プレート千万NB324K細胞の前に1日。コントロール（非感染細胞）と同じ数のセルを含む第2のフラスコを準備します。各T175は5％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、ML Penicilin当たり100U、100μg/ mlのストレプトマイシンを補充し、最終容量として最小必須培地（MEM）20 mlを持っている必要があります。 </li><li>翌朝は、以下から構成される2 mlのプラスチックチューブでウイルス混合物を準備します。 <ol class="lalpha"><li>感染多重度（MOI、感染単位/細胞）で広告-VP-ヘルパー5 = 10（1×10 8感染単位に相当する）。 </li><li> MOI = 0.5（5×10 6感染単位に相当）でrecPVs。 MEMで1.5ミリリットルに完了します。 </li></ol></li><li> T175フラスコのいずれかで、全体のウ​​イルスの混合物を適用します。 </li><li>インキュベート37℃で2時間フラスコ°C、92％湿度、5％CO 2静かに15分毎に揺れ。 </li><li> 37℃でさらに20〜24時間インキュベート°C、92％湿度、5％CO 2。 </li><li>新鮮な培地で文化的な培地を交換してください。 </li></ol> 2.2ウイルス産生 48時間92％湿度、5％CO 2で37℃でフラスコをインキュベートします。効率的なウイルス産生の指標として、細胞毒性の明確な兆候は36から48時間後に感染を開始し、ウイルス感染細胞を含むフラスコに観察する必要があります。 2.3ウイルスの収穫<ol><li>組織培養フード内で、50 mlの遠心チューブにフラスコから培地上清を吸引し、転送します。 </li><li> 1.5ミリリットルをPBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li> 0.25パーセントTrysin-EDTA 1.5 mlで細胞をトリプシン処理。除去培地に細胞懸濁液を追加します。 </li><li>部屋の温度で5分間5000×gで細胞と上清を遠心分離ature。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li>細胞ペレットを、ゆっくりとボルテックス細胞を再懸濁するためのチューブにTE緩衝液1ml（1 mMのトリス-HCl、0.1mMのEDTA、pHは8.7）を追加します。 </li><li> 37℃温水で液体窒素浴融解℃で細胞懸濁液を凍結15秒間激しくボルテックスチューブと凍結融解サイクルを3回繰り返します。 </li><li>細胞ゲノムと非パッケージ化ウイルスDNAを消化するために、37℃で30分間50 U / mlのベンゾナーゼヌクレアーゼ°Cで細胞懸濁液を扱います。 </li><li> 4℃で20分間5000×gでチューブを遠心℃、 </li><li>新しいチューブに上清を収集します。この段階で上澄み液は、粗製ウイルス抽出の準備を含んでいます。このプロトコルは、次の生産recPV-GFPの典型的な収量は1〜10×10 8ウイルス感染単位の範囲でなければなりません。 </li></ol> 2.4ウイルスストレージ<ol><li> 4℃で短期間保存用（最大2ヶ月）、ストアウイルス</li><li> LONのためにグラム長期保存（2ヶ月以上）、-80ストアウイルス℃、 </li></ol> 3。 RecPV精製<ol><li>粗ライセートからrecPVsの精製の ​​ために、我々はZolotukhin らによるとイオジキサノール不連続勾配を実行することをお勧めします。9。我々は効率的なウイルス精製用原油のウイルスエキス（5 T175フラスコでの生産から得られる）を5mlの最小値を使用することをお勧めします。 </li></ol> 4。組換えパルボウイルス滴定<ol><li>エルAndaloussi らに記載されrecPV滴定を行います。5 </li></ol> 5。品質コントロール<ol><li>エルAndaloussi らに記述されたプロトコルを使用しています。5 NB324Kインジケーター細胞にパルボウイルスのプラークアッセイを実施する望ましくない複製コンピテントウイルス（RCV）の存在を確認する。 </li></ol> 6。代表的な結果 recPVs productioの例nはアデノウイルスゲノムの要素の存在下または非存在下でトランスフェクションを介して図3に示します。細胞はPHH-1-GFP（recPVは、GFP遺伝子を有する）、またはPHH-1-ルシフェラーゼ（recPVは、 ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有する）と一緒のpCMV / VP（VPパルボウイルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を運ぶプラスミド）をトランスフェクトした、と（+ pXX6）の有無にかかわらず（-pXX6）プラスミドpXX6（アデノウイルスE2A、E4（ORF6）とVA RNA遺伝子を運ぶ）。粗細胞抽出物の等量エルAndaloussi らに報告されている細胞とGFP形質導入またはルシフェラーゼアッセイを行った。5 NB324Kに適用されました。 recPVs生産の明確な増加は、提案手法（ 図3A、B）後に得られる約5 TU /セルに、従来のプロトコルに従って生産が0.3 GFP达ユニット（TU）/セルから増加に伴ってpXX6の存在下で得られた。 recPV productiの大幅な増加（24倍程度）上でも、PHH-1-ルシフェラーゼ（ 図3C）の場合に観察された。これらの結果は、pXX6に含まれる遺伝物質は、パルボウイルスの産生を高めることができることを示しています。 感染経由recPVs生産の代表例を図4に示します。 NB324K細胞は、様々なrecPVs（図に示される）およびAd-VP-ヘルパー（PV VPキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を保有する）と共感染させた。アップシードセルあたり&gt; 70 TU（ 図4A）するには、Ad-VPヘルパーさらに強化recPV生産望ましくない複製コンピテントウイルス粒子（ 図4B）の発生を増加させずに。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig1.jpg" /> 図1。自律的なパルボウイルスに基づくベクター。 （A）トップ：導入遺伝子は、VP-コードする遺伝子の一部を置き換え、ウイルスプロモーターP38の制御下にある。 NS1 / 2の遺伝子が再されている慣らしとその発現は、ウイルスプロモーターP4によって制御されます。ベクターゲノムは複製と組換えゲノムのパッケージングに必要なシス作用性要素が含まれているパルボウイルスITRは、に挟まれています。底部：プラスミド（ 例えば 、CMV）のいずれか異種、または自家（ 例えば、P38）プロモーター（PX）の下にVP-遺伝子を担持する構造遺伝子の破壊を補償するために、組換えパルボウイルスの生産時にトランスに供給されている組換えゲノムインチITR、逆方向末端反復。図4から適応。recPVsの製造に使用される古典的なプロトコルの（B）の模式図。 HEK293T細胞は一過性ウイルスDNA（ベクターとヘルパープラスミド）をトランスフェクトされ、三日後、細胞を採取し、ウイルスが収穫されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig2.jpg" /> 図2。とrecPVsの生産広告-VPのに役立ちます。 recPVおよびAd-VPゲノムの（A）の回路図にマップされます。 recPVはVP領域の一部を置き換え、異種遺伝子を含んでいます。広告-VPは、パルボウイルスVP遺伝子を抱いている。本稿で説明されたプロトコルの（B）の回路図ビューでは、。 NB324K細胞はrecPVおよびAd-VPウイルスと共感染している。三日後に細胞を回収しており、recPV粒子が細胞溶解物から回収した。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig3.jpg" /> 図3。アデノウイルスベースのプラスミドpXX6によってrecPV生産の刺激 。 10cmディッシュに播種したHEK293T細胞は、recPVsを生成するためにPHH-1-GFP（AおよびB）またはPHH-1-ルシフェラーゼ（C）との組み合わせでのpCMV / VPでトランスフェクトした。同時に、細胞が示すように、アデノウイルス由来のヘルパープラスミドpXX6かどうか、と共トランスフェクトした。三日間、トランスフェクション後、細胞を3回の凍結融解サイクルにより回収し、溶解した。クラッドの等量eのウイルス抽出物をインジケータセルをNBKに適用され、伝達アッセイを行った。（）コンフルエントNB324K単層内でGFP陽性細胞を示す代表的な顕微鏡写真を示す。（B）GFPトランスダクションアッセイの定量は、シードのセルごとに伝達ユニット（TU）で表される（C）ルシフェラーゼ活性の定量化は、相対ルシフェラーゼ単位（RLU）で表されます。エルAndaloussi らで説明したようにルシフェラーゼアッセイを行った。5。列は、3からの平均値が標準偏差バーを複製する表しています。 + pXX6列の先頭の数は、（A、BおよびC）では、pXX6の対せず存在下で得られたrecPVウイルス価の倍の増加を、示しています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3518/3518fig4.jpg" /> 図4。組換え広告-VPヘルパーウイルスによるrecPV生産の刺激。 （A）NB324K細胞は、感染したその後、MOI 10で精製した広告-VPヘルパーウイルス（AD-Xユニット/細胞、アデノ-X迅速タイターキットを用いて滴定）とテッド、次の組換えパルボウイルスカイ-HH-1-EGFP 11（0.1のどちらかとsuperinfected TU /セル）またはH-1-GFP（0.5 TU /セル）5。一日感染後、培地を変更しました2日後、細胞を採取し、3回の凍結と融解を介して溶解した。粗細胞抽出物は、エル·Andaloussi らによると伝達アッセイによりウイルス力価を決定するために使用された5。 TU、伝達ユニットは、（B）AD-VPの不在の存在下で産生さウイルスバッチはNB324Kインジケーター細胞上のプラークアッセイにより複製コンピテントウイルス粒子（RCV）の、その内容について分析した。

<ol>
	<li>Cotmore, S. F., Tattersall, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvoviral+host+range+and+cell+entry+mechanisms.">Parvoviral host range and cell entry mechanisms.</a> Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).</li><li>Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncolytic+parvoviruses+as+cancer+therapeutics.">Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).</li><li>Hristov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+Its+Nonstructural+Protein+NS1,+Parvovirus+H-1+Induces+Apoptosis+via+Accumulation+of+Reactive+Oxygen+Species.">Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species.</a> J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).</li><li>Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vectors+based+on+autonomous+parvoviruses:+novel+tools+to+treat+cancer.">Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer.</a> J. Virol. 6, 193-193 (2004).</li><li>El-Andaloussi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+adenovirus-based+helper+system+to+support+production+of+recombinant+parvovirus.">Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus.</a> Cancer Gene Ther. 18, (2011).</li><li>Kestler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cis+requirements+for+the+efficient+production+of+recombinant+DNA+vectors+based+on+autonomous+parvoviruses.">cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses.</a> Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).</li><li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus.">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J. Virol. 72, 2224 (1998).</li><li>He, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+system+for+generating+recombinant+adenoviruses.">A simplified system for generating recombinant adenoviruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene. Ther. 6, 973 (1999).</li><li>Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+production+of+recombinant+AAV+by+transient+transfection+of+NB324K+cells+using+electroporation.">Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation.</a> J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).</li><li>Wrzesinski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+and+pseudotyped+parvoviruses+minimize+the+contamination+of+recombinant+stocks+with+replication-competent+viruses+and+identify+a+DNA+sequence+that+restricts+parvovirus+H-1+in+mouse+cells.">Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells.</a> J. Virol. 77, 3851 (2003).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

我々はrecPV生産はアデノウイルスゲノムの要素の存在によって増強することができることを示している。私達はでrecPVとの組み合わせでトランスフェクションを介してアデノウイルスゲノムの要素を提供することによって、およびAd-VP-ヘルパーと100以上の倍の共感染細胞による10以上の倍（0.3から5 TU /セルから）でrecPV収率を増加している従来のプロトコルとの比較。ここで説明するプロトコ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>シグマ</td><td> D5796 </td></tr><tr><td> MEM </td><td>シグマ</td><td> M4655 </td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td> PAA </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> L-グルタミン</td><td>ギブコ</td><td> 25030-024 </td></tr><tr><td>トランスフェクション</td><td>ロシュ社</td><td> 047097050001 </td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA </td><td>インビトロジェン</td><td> 25300062 </td></tr><tr><td>ベンゾナーゼヌクレアーゼ</td><td>シグマ</td><td>操作するもの</td></tr><tr><td>アデノ-X迅速タイターキット</td><td>クロンテック</td><td> 632250 </td></tr></tbody></table>

efficient recombinant parvovirus production with the help of adenovirus-derived systems

例えばラットH-1PVとMVMなどの齧歯類パルボウイルスは、（PV）、小さな正二十面体、一本鎖のDNAウイルスである。それらのゲノムは、それぞれ1非構造（NS1とNS2）とカプシド蛋白（VP1およびVP2）の発現を調節する2つのプロモーターP4とP38が含まれています。人間の2の非病原性でありながら、彼らは腫瘍溶解性とoncosuppressive能力のための抗癌剤として高い関心を集めている。 NS1は、ウイルスの細胞毒性3の主要なエフェクターである。さらに彼らの自然な抗腫瘍活性を高めるために、これらのベクトルからの誘導体は、治療遺伝子（ 例えば、細胞毒性ポリペプチド、サイトカイン、ケモカイン、腫瘍抑制遺伝子等）4とキャプシド蛋白質をコードする遺伝子を置換することによって生成されました。組換えパルボウイルス（recPVs）ベクターはウイルスDNAの増幅およびパッケージングするために必要なNS1 / 2コード配列とPVゲノムのテロメアを維持します。の生産recPVsはVPタンパク質（ 図1）4をコードする遺伝子を発現する第二のベクター（のpCMV-VP）で細胞を共トランスフェクトすることにより、プロデューサー細胞（一般にHEK293T）でのみ発生します。この方法で生成されたrecPVベクターは、複製欠損である。 recPVsは、それらが生成された元の親ウイルスに対する強化されたoncotoxic活性を有することがわかっていますが、それらの生産が主要な課題であると強く抗がん剤の臨床応用におけるこれらの薬剤の使用を妨げます。 我々は、使用中の他のプロトコルと比較してより10倍recPVsの生産を向上させたHEK293TにE2A、E4（ORF6）とVA RNA遺伝子（ 例えば pXX6プラスミド）を含むAD-5由来ベクターの導入は見つかりました。この知見に基づいて、我々はrecPVs生産などparvovirを強化するために必要なゲノムのアデノウイルスの要素を含む小説広告-VP-ヘルパーを構築した私達VP遺伝子ユニット5。広告-VP-ヘルパーの使用は、可能な限り（ 例えば NB324K）トランスフェクションが困難な細胞株を利用して、ウイルス感染の手順（のようなプラスミドトランスフェクションとは対照的に）に完全に依存するプロトコルを使用して、REC-PVの生産を可能にする（ 図2）。我々は非常に最終製品の5の品質に影響を与えることなく、生産時間とコストの両方を削減し、産生された組換えウイルスの量を向上させる手法を提案する。さらに、recPVの大規模生産は（浮遊細胞とバイオリアクター）で現在考えられる。

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Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

ここでは、使用中の他のプロトコルに比べて100倍以上の組換えパルボウイルスの生産効率を向上させる細胞の感染に基づいて、プロトコルを記述します。このプロトコルは、パルボウイルスのVP転写ユニット（AD-VP）を含む新規のアデノウイルス5ベースのヘルパーの使用に依存しています。

アデノウイルス由来のシステムの助けを借りて効率的な組換えパルボウイルスの生産

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

efficient-recombinant-parvovirus-production-with-help-adenovirus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.9K ビュー.  German Cancer Research Center (DKFZ). ここでは、使用中の他のプロトコルに比べて100倍以上の組換えパルボウイルスの生産効率を向上させる細胞の感染に基づいて、プロトコルを記述します。このプロトコルは、パルボウイルスのVP転写ユニット（AD-VP）を含む新規のアデノウイルス5ベースのヘルパーの使用に依存しています。

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Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

水系でのウイルス産生率を予測

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

免疫・感染学

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

B細胞の組換えレトロウイルスの生産と感染症

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

細胞の成熟せずに樹状細胞の効率的なトランスフェクションに最適化されたプロトコル

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently being tested in human clinical trials. Wild-type AAV is a non-pathogenic member of the parvoviridae family and inherently replication-deficient. The broad transduction profile, low immune response as well as the strong and persistent transgene expression achieved with these vectors has made them a popular and versatile tool for in vitro and in vivo gene delivery. rAAVs can be easily and cheaply produced in the laboratory and, based on their favourable safety profile, are generally given a low safety classification. Here, we describe a method for the production and titering of chimeric rAAVs containing the capsid proteins of both AAV1 and AAV2. The use of these so-called chimeric vectors combines the benefits of both parental serotypes such as high titres stocks (AAV1) and purification by affinity chromatography (AAV2). These AAV serotypes are the best studied of all AAV serotypes, and individually have a broad infectivity pattern. The chimeric vectors described here should have the infectious properties of AAV1 and AAV2 and can thus be expected to infect a large range of tissues, including neurons, skeletal muscle, pancreas, kidney among others. The method described here uses heparin column purification, a method believed to give a higher viral titer and cleaner viral preparation than other purification methods, such as centrifugation through a caesium chloride gradient. Additionally, we describe how these vectors can be quickly and easily titered to give accurate reading of the number of infectious particles produced.

Recombinant adeno-associated virus (rAAVs) vectors are becoming increasingly valuable for in vivo studies in animals. We describe how rAAVs can be produced in the laboratory and how these vectors can be titered to give an accurate reading of the number of infectious particles produced.

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生と力価測定

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field 4. The use of cell-based arenavirus minigenome systems together with the ability to generate recombinant infectious arenaviruses with predetermined mutations in their genomes has facilitated the investigation of the contribution of viral determinants to the different steps of the arenavirus life cycle, as well as virus-host interactions and mechanisms of arenavirus pathogenesis 1, 3, 11 . In addition, the development of trisegmented arenaviruses has permitted the use of the arenavirus genome to express additional foreign genes of interest, thus opening the possibility of arenavirus-based vaccine vector applications 5 . Likewise, the development of single-cycle infectious arenaviruses capable of expressing reporter genes provides a new experimental tool to improve the safety of research involving highly pathogenic human arenaviruses 16 . The generation of recombinant arenaviruses using plasmid-based reverse genetics techniques has so far relied on the use of rodent cell lines 7,19 , which poses some barriers for the development of Food and Drug Administration (FDA)-licensed vaccine or vaccine vectors. To overcome this obstacle, we describe here the efficient generation of recombinant arenaviruses in FDA-approved Vero cells.

Rescue of recombinant arenaviruses from cloned cDNAs, an approach referred to as reverse genetics, allows researchers to investigate the role of specific viral gene products, as well as the contribution of their different specific domains and residues, to many different aspects of the biology of arenavirus. Likewise, reverse genetics techniques in FDA-approved cell lines (Vero) for vaccine development provides novel possibilities for the generation of effective and safe vaccines to combat human pathogenic arenaviruses.

FDAの承認を受けたVero細胞におけるワクチン開発のための組換えアレナウイルスの生成

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.

We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.

実験的自己免疫性脳脊髄炎研究のためのシンプルで効率的な生産とマウスミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質の精製

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

使用してリンパ球血管外漏出の分析<em&gt;インビトロ</em&gt;ヒト血液脳関門のモデル

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared to IN from other retroviruses, PFV IN is more soluble and more amenable to experimental manipulation. Additionally, it is sensitive to clinically relevant human immunodeficiency virus (HIV-1) IN inhibitors, suggesting that the catalytic mechanism of PFV IN is similar to that of HIV-1 IN. IN catalyzes the covalent joining of viral complementary DNA (cDNA) to target DNA in a process called strand transfer. This strand transfer reaction introduces nicks to the target DNA. Analysis of integration reaction products can be confounded by the presence of nucleases that similarly nick DNA. A bacterial nuclease has been shown to co-purify with recombinant PFV IN expressed in Escherichia coli (E. coli). Here we describe a method to isolate PFV IN from the contaminating nuclease by heparin affinity chromatography. Fractions are easily screened for nuclease contamination with a supercoiled plasmid and agarose gel electrophoresis. PFV IN and the contaminating nuclease display alternative affinities for heparin sepharose allowing a nuclease-free preparation of recombinant PFV IN suitable for bulk biochemical or single molecule analysis of integration.

Recombinant prototype foamy virus integrase protein is often contaminated with a bacterial nuclease during purification. This method identifies nuclease contamination and removes it from the final preparation of the enzyme.

組換えプロトタイプ フォーミー ウイルス インテグラーゼの浄化中にヌクレアーゼの混入の検出と除去

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

Herpesvirus of turkeys (HVT) is an ideal viral vector for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases, such as avian influenza (AI), Newcastle disease (ND), and infectious bursal disease (IBD), using bacterial artificial chromosome (BAC) mutagenesis or conventional recombination methods. The clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 system has been successfully used in many settings for gene editing, including the manipulation of several large DNA virus genomes. We have developed a rapid and efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing pipeline to generate recombinant HVT. To maximize the potential use of this method, we present here detailed information about the methodology of generating recombinant HVT expressing the VP2 protein of IBDV. The VP2 expression cassette is inserted into the HVT genome via an NHEJ (nonhomologous end-joining)-dependent repair pathway. A green fluorescence protein (GFP) expression cassette is first attached to the insert for easy visualization and then removed via the Cre-LoxP system. This approach offers an efficient way to introduce other viral antigens into the HVT genome for the rapid development of recombinant vaccines.

Herpesvirus of turkeys (HVT) is widely used as a vector platform for the generation of recombinant vaccines against a number of avian diseases. This article describes a simple and rapid approach for the generation of recombinant HVT-vectored vaccines using an integrated NHEJ-CRISPR/Cas9 and Cre-Lox system.