著者らは、研究施設のための支援と資金調達のための博士課程の学生デイブハートネルとボーンマス大学を承認したいと思います。

分子プローブおよびフローサイトメーターの作製<ol><li>超純濾過H 2 Oに必要な濃度のアリコートにジメチルスルホキシド（DMSO）中の5 mM溶液として供給されている核酸プローブのストック溶液を希釈</li><li> 25°Cの使用まで- -5°Cの間の暗いところでの核酸プローブを保管してください。 </li><li>フローサイトメーターおよびロード・ソフトウェア・パッケージ（FCM仕様のための材料/機器の表を参照）をオンにします。 </li><li>試料注入プローブ（SIP）の空の溶血チューブ（12×75 mm）を置いて、邪魔を除く、その後FCM洗浄プロセスを開始するためにフラッシュバックをクリックします。 注 ：SIPのためのいくつかのサンプルステージはマイクロ遠心チューブなどのチューブのいくつかのタイプを収容することができます。 FCM装置に用いられる分子プローブの希釈剤とシース液は分析グレード「タイプ1」、0.22μmのメンブレンフィルターのソースからです。 </li><li>場所15分と速いために、流体の速度（または&gt; 66マイクロリットル/分の流速） - SIPの超純フィルタリングの H 2 O 2 mlの新鮮な溶血管は、10の時間制限を設定します。 </li><li>新しいデータセルを選択し、バックグラウンドノイズを低減し、「実行」をクリックする蛍光および光散乱チャネルに関連したしきい値に置きます。 </li><li>秒あたりの総イベントは、製造業者の推薦の下にない場合は、高速で2分間の除染液2mlのサンプルを実行して、手順1.4＆1.5を繰り返します。 注 ：彼らはモデル間で変化させることができるよう、FCM起動クリーニングプロトコルについては、メーカーの推奨事項を確認してください。特定のしきい値のテストはまた、いくつかの機器は、ユーザは、光検出器から記録された電気信号を増強または減少する光電子増倍管（PMT）に電圧ゲインを適用することを可能にするようFCMモデルに沿ったものであることが必要です。このexperiで使用されるFCMモデルメントは、電圧のPMTを固定し、2.0ミクロンと電子ノイズよりも小さな粒子を除外80,000前方光散乱（FSC-H）のしきい値を使用しています。 </li></ol>文化と初期細胞数の調製<ol><li> 120 O℃で20分間、250mlビーカー中で藻類メディア（X50濃度）の超高純度フィルタH 2 Oおよび2ミリリットルのオートクレーブ98ミリリットル</li><li> SIPの下のチューブにサンプル2mlの高い定常状態密度代わりにM.aeruginosa（PCC 7806）の初期のモノカルチャーから。ボルテックスまたは超音波処理20により任意のコロニー形成を脱凝集し、光学顕微鏡を通して均等に分散した細胞を確認します。 注 ：超音波への過度の露出は、細胞溶解につながることができますし、注意して使用する必要があります。 （M.aeruginosaのような種に見られるような）超音波処理は、側方光散乱（SSC-H）の強度として出力をよりSEになることができるガスの小胞を折りたたむことができますので、nsitive。 </li><li> FCMソフトウェアの中では、前方光散乱（FSC-H）からのデータを記録し、軸に対数スケールで表示するには、「ログイン」をクリックして、プロットの仕様を設定するには、ヒストグラムプロットを選択します。 </li><li>別の出力では、このようなアクセサリ光合成色素フィコシアニン（FL4-H、675±12.5 nm）のM.aeruginosaで見つかった、などの自然蛍光を記録する（軸をログ）別のヒストグラムを選択します。 </li><li>フィコシアニンと得られる蛍光からの排出量をフィルタリングすることができる検出器を励起することができる光源を使用してください。 注 ：フィコシアニンは、600 nmでオーバー励起され、唯一の赤色光源21で検出されるのに対し、このようなクロロフィルなどの光合成色素は、一般的に使用される488nmの青色レーザーで励起することができます。ここでは、励起光源のためのフローサイトメーターのメーカーと発光検出器のスペクトルに確認してください両方488 nmおよび640 nmのレーザーを一緒に使用されました675±12.5 nmの光学フィルタ。 </li><li>標的生物（10ミクロン）のコアサイズと比較的遅い流速（14μL/分）に最も近い最高の解像度を選択した設定を記録するために。 注 ：最高の解像度のサンプルについては、1秒あたりのイベント勧告を製造しているに応じて実行する必要があります。 </li><li>データ取得は、ゲートに電子バックグラウンドノイズまたは細胞サンプルの破片によって引き起こされる光散乱および/または蛍光シグナルをしきい値を使用する前に。 </li><li>新しいデータセルを選択し、ログスケールのFSC-HおよびSSC-Hのパラメータを持つ密度プロットを作成して実行]をクリックします。 </li><li>サンプル密度が過剰イベント率につながる場合、希釈工程は、正確さと精度を高めるために取ることができます。 </li><li>密度プロットでは、バックグラウンドノイズやゴミ（FSC &lt;32万）によって製造される低レベルの散乱信号を除外するために、前のヒストグラムからソフトウェアゲートを適用します。逆にゲートより高い相対蛍光フィコシアニン細胞からの信号だけでは、これらのイベント（ - 1,950,000 FL4、56000）が挙げられます。 </li><li>ゲートされた領域に記録する細胞の数を使用し、1mlあたりどのように多くのセルを動作させるには、FCMを通過した試料の全容量で割り。 注 ：ここで使用されるFCMモデルは、試料体積を決定することを可能にするマイクロプロセッサ制御蠕動ポンプシステムを有しています。他のFCM装置を較正ビーズ懸濁液又は全試料容量を確認するためにH 2 O重量/体積の差の計算を必要とするかもしれません。 </li><li> M.aeruginosaのバッチ増殖サイクル（250,000細胞/ mlで）を開始するために新たに調製した培地に細胞の必要量を加えます。 注 ：種はそうバッチサイクルがライフサイクルの位相を決定するために、事前に記録されるべきであるそれらのインサイチュー環境パラメータおよび栄養素利用可能性に応じて成長速度が異なるであろう。 </li></ol> 3.のOptim分子プローブの細胞取り込みの化<ol><li> M.aeruginosa文化の収穫の半分は対数期から、ステップ2で調製し、「ライブ」コントロールとして使用します。 注 ：ストレート指数期に高密度培養物から希釈されたサンプルは、初期の遅れ/誘導期から接種した培養物のそれに比べて、死んだ細胞のターンオーバーを介して最適化の結果に影響を及ぼす可能性があります。 </li><li> 1時間、パラホルムアルデヒドまたは30分6,11,22のための4％ホルムアルデヒド、60°Cの時に、このような70％エタノール、加熱サンプルのような方法を使って、「死んだ」コントロールとして残りの半分を準備します。サンプルの微小環境の変化（ 例えば 、pH値）を確認してください。 注 ：M.aeruginosaで陽性、熱殺菌された、「死んだ」制御フィコシアニン信号での減少を通じ「ライブ」のサンプルとは区別されます。他の方法により死亡率を誘導することは、同じ出力を発生させません。VARます種のY。 </li><li>異なる比を使用して混合試料を設定する「ライブ」および「死んだ」サンプル（ 例えば 、0％、25％、50％、100％）。 </li><li>ボルテックスまたは超音波処理によって、コロニー形成を脱凝集し、pHを確認してください。 </li><li> 488 nmの緑色（FL1、530±15 nm）のからの蛍光を記録することができ、検出器と一緒にレーザーとオレンジ（FL2、585±20 nm）の核酸プローブとそれぞれの検出器をフィコシアニン信号を記録する640 nmのレーザーを選択します。 注 ：DNAに結合すると、オレンジ色の核酸プローブは、570 nmで547 nmおよび放射極大励起波長を有する一方で、緑の核酸プローブは、523 nmで504 nmおよび発光最大値のおおよその蛍光励起波長を有します。 488nmのアルゴンイオン固体レーザが両方の分子プローブを励起するために使用することができる、しかし、（547ナノメートルまで）緑色レーザは、より高いオレンジ色の蛍光を生成します。 </li><li>出発点として、ご紹介メーカーとの分子プローブは、50％の「ライブ」50％「死んだ「文化への濃度を推奨し、暗闇の中でインキュベートします。 </li><li>新しいデータセルを選択し、バックグラウンドノイズ（FSC-H 80,000）削減するしきい値とトリガーとSIPの下にサンプルを配置します。 </li><li> FSC-HおよびSSC-Hパラメータ、および3つのヒストグラムと密度プロットを作成します。フィコシアニンの排出量（FL4-H）と他のFSC-H、すべてのログスケールで検出するために、それぞれの分子プローブの光検出器チャンネル（FL1または2）、1つを使用して1つのヒストグラム。 </li><li>時点（1、5、10、15、30および60分）の数で、別のデータセルに記録し、最大60分間、暗闇の中で核酸プローブとM.aeruginosaのサンプルをインキュベートします。 注 ：特定の化学物質からの潜在的な反応のために製造して例えばpHチェックなどのパラメータを調整するとき（テスト核酸ためのバッファがリン酸または一価または歌姫の高いレベルを含めることはできませんプローブDNAとの結合が減少されるように）、陽イオンを貸し。 </li><li>それぞれの蛍光プローブチャネルヒストグラムに、セルサイズの生物標的に対して - のみFSC-Hヒストグラム（150万32万）を含むようにソフトウェアゲートを適用します。 注意 ：このプロトコルで使用される濃度はM.aeruginosa試料または核酸プローブの初期ストック溶液の体積を増加または減少のいずれかによって変更することができ0.05、0.1、0.5、1、5、10、50および100μMでした。 </li><li>蛍光プローブチャネルでは、ヒストグラムの最高ピークに別の包括的なソフトウェアゲートを適用（緑FL1-H 24万 - 165万、オレンジFL2-H 30,000 - 165,000）、続いてゲートそのポジティブプローブ蛍光密度プロットに。 </li><li>分子プローブの濃度（例えば、x〜0.1×10）、および/または温度およびpHレベルを必要に応じて調整し、100％の「ライブ」、100％の「死んだ &#39;とすべての混合培養試料で3.11 - を実行して、3.1を繰り返します。 </li> &lt;LI&gt;核酸で染色した細胞の合計割合を見つけるために、（合計の半分のFSC-Hまたは100％ &#39;死んだ「文化から取られた）「死んだ」細胞の元の細胞密度に正の分子プローブの蛍光シグナルの数を比較プローブ。 </li><li>非特異的な染色（一方向ANOVAまたはクラスカル・ウォリス検定で手段を使用を生じることなく、細胞の核酸プローブの取り込みの割合が最も高いのための最適なプロトコルを見つけるために、各濃度内の各時間帯のためにこれを行い、データは、ノンパラメトリックである場合）。 </li></ol> 4.分子プローブの蛍光差別<ol><li>真性または非特異的な細胞染色からの蛍光干渉/重複のテストのために50％の「ライブ」50％「死んだ」混合培養データを選択して、すべてのゲートを脱ぎます。 </li><li>フィコシアニンに、標的生物の細胞の大きさのために - FSC-Hヒストグラム（150万32万）にのみ含まれるようにソフトウェアゲートを適用しますチャネルヒストグラム。 </li><li>門「死んだ」とラベルされた最低のピークを追加した「ライブ」として最高フィコシアニンピークとラベル、。 </li><li>平均波長の両方を記録し、一度に一つ、「ライブ」、次に「死んだ」フィコシアニン（FL4）信号を使用して、それぞれの分子プローブの蛍光ヒストグラムチャネルにさらにゲートステップを実行します。 注記 ：この実験では死亡率を誘導するためのモードは、このプロトコルの下で明らかにフィコシアニン信号を減少させる熱処理によって行われました。 「死んだ」細胞の集団を産生する他の方法は、取得した実行で異なる出力をもたらすことができます。 </li><li>比プラスの分子プローブの蛍光（ &#39;死んだ&#39;）および固有/非固有の信号（「ライブ」）の平均波長は、プロトコルの感度を決定します。 注：「ライブ」と「死んだ」populの蛍光識別を改善するために、ationsは、細胞壁の透過性、得られる蛍光信号6を改善するために栄養枯渇細胞又はエチレンジアミン四酢酸（EDTA）で活性染色取り込みの炭素源を増加させます。スペクトル重複のためのいくつかのFCMモデルで限定補償はサンプル取得（PMT電圧が変化する）の間または後分析専用ソフトウェアからのユーザー操作ペアごとの補正によって行うことができます。 </li><li> 「死んだ」細胞の最高額が発生非特異的な染色せずに染色された最適化されたプロトコルを選択します。テストの数は、同様の結果を持っている場合は、良好な蛍光信号識別とともに、最低濃度およびインキュベーション時間でプロトコルを受け入れます。フォローサイトメーターはシャットダウン手順のための指示を製造しています。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。

15,19,22,23 -分子プローブを使用して出版物の増加した数は、信頼性が高く、有益なデータが5,6,8を得ることができることを示しています。まだのと同じ濃度およびインキュベーション時間6,10を持つすべての種にわたって有効であることができる細胞の生存率には完璧な汚れがありません。変更された蛍光発光を有するプローブであっても同じタイプが正しい濃...

細胞は常に生理的パラメータを変更し、その機能を変化させることにより環境に応答する複雑なシステムです。 3 -同質遺伝子の微生物集団の個体群動態自然の中で、実験の両方が比較的一定の環境条件下でさえ1を発生する、亜集団の発展によって影響されます。自然の微生物群集の多様性は、環境条件の非常に可変性に起因して生じます。これら時々確率過程はその後、人口の平均に非常に異なっている部分集団を生成します。最近の証拠は、これらの生理学的な亜集団は、環境条件に異なった反応をし、劇的に影響し、全体的な人口の3,4に影響を与えるシグナル化合物または阻害剤を産生することができることを明らかにしました。 集団内の異質性を定義するための方法を確立することは、国連への鍵ですなどなどアナベナなどの種は異質のような特殊化した細胞を開発し、環境変動に応じて、形態学的不均一性を示す人間の水の安全保障に大きく影響を与える。有毒アオコなど、様々な環境での微生物の生態をderstandingと迷惑シアノバクテリアの知識を構築する際に不可欠ですそして、akinetes 2。これとは対照的に、 アオコ細胞は、ストレス応答の間に明らかな形態学的な不均一性を表示しません。実行可​​能と非生存細胞との区別は、生理的分化の最も重要な側面であり、微生物の個体群動態をよりよく理解することができます。しかし、細菌の生存率そのものの概念の問題は難しいと特徴付けが乏しい1,5,6のまま。 フローサイトメトリー（FCM）は、個々の細胞を分析の信頼性が高く、迅速な方法です。単一細胞生理の理解を高めるためにFCMスルーでれっと、分子プローブは、代謝および生化学的プロセス7の数を区別するために使用されてきました。これは、携帯電話や人口レベルでの種の増加の知識につながったし、今度は水資源管理8,9を支援してきました。しかし、生物は、分子プローブ設計およびプロトコル実装6,10,11の数につながっている携帯壁や膜中の細孔やポンプ、に分子プローブの取り込みと排出の点で異なります。商業用および研究目的のために利用可能な分子プローブは、しばしば、非常に異なる細胞型にも適用可能である一般的なプロトコルを用いて供給されています。一つは、別の6に一つの細胞型のために開発されたプロトコルを転送するのに非常に慎重でなければならない、それは、したがって、効果的に使用する前に分子プローブを最適化するために不可欠な作業です。 緑とオレンジの核酸プローブは、最小限のベースとのダブルと一本鎖核酸の両方に結合し選択ivityとは、細胞の原形質膜の完全性を評価するために使用されます。緑色の核酸プローブは、また、細胞生存率の指標として機能することができるヨウ化プロピジウム系化合物12のような他の分子プローブに比べて著しく改善された細胞標識蛍光シグナルを有します。ここで用語「細胞生存率は、「DNA分解は、原形質膜完全性の喪失後に発生することを想定しています。核酸プローブは、3つの正電荷を有する非対称シアニン色素であり、真核生物の11,13および原核生物14,15の両方で、特徴づけられた濃度の下で、無傷の膜を有する細胞を入力することはできません。核酸に核酸プローブの結合は、それらの膜完全性が損なわれている細胞における内因性信号からの蛍光発光の&gt; 500倍の増加までをもたらすことができます。このような緑色の核酸プローブとして分子プローブは、単一の細胞生理学の良い指標となることができますが、必要性のトンがありますだけではアオコの実験では0.5μM15 - - 0.1μMから30分であり、濃度範囲- 19インキュベーション時間は7分まで変化させてきたように、O、目的の標的生物に各プローブを最適化します。 ここでは、緑のサイトメトリーアッセイと（これまでにシアノバクテリア種M.aeruginosa上でテストされていない）比較的新しいオレンジ色の核酸プローブを最適化するためのプロトコルを提示します。次の発展の方法は、他の種に移し、それによって微生物およびそれらの生態行動の理解を増加させる他の分子プローブでプロトコルを最適化するためのプラットフォームとして使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Cyanobacteria Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3061-500ML</td><td>BG-11 Freshwater concentrated solution (x50 dilution)</td></tr><tr><td>Decontamination Fluid</td><td>BD Biosciences</td><td>653155</td><td>Run for 2 min when outputs are more than 12 events per second on fast or a flow rate of 66 &amp;micro;l/min.&amp;nbsp; Followed by 2 min of sheath H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>by request</td><td>BD Accuri C6</td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Life Technologies</td><td>S7020</td><td>Nucleic acid stain &amp;ndash; 5 mM solution in DMSO</td></tr><tr><td>SYTOX Orange</td><td>Life Technologies</td><td>S11368</td><td>Nucleic acid stain &amp;ndash; 5 mM solution in DMSO</td></tr></tbody></table>

molecular probe optimization to determine cell mortality in a photosynthetic organism (microcystis aeruginosa) using flow cytometry

微生物分野での亜集団と実験室での研究は、形態学的および生理学的パラメータに高い不均一性を示すことが示されてきました。微生物が細胞分裂および代謝活性が低下していることにより休眠状態で存在することができるように微生物細胞のリアルタイムの状態を決定することは、生死のカテゴリーを超えました。微生物の検出および定量化の必要性を考えると、分子プローブを用いたフローサイトメトリー（FCM）は、集団全体の生存率を決定するのを助けるために迅速かつ正確な方法を提供します。膜の完全性を検出するためのモデルシアノバクテリアのMicrocystis aeruginosaのでSYTOX緑とSYTOXオレンジを使用することにより、我々は単一細胞死亡率の急速な適応のための譲渡方法を開発。 actioの同等のモードを有する類似の励起波長および発光波長を有する他の製品があるが、このジャーナル内で使用される分子プローブは、（それぞれ緑またはオレンジ核酸プローブと称しますnは、我々は、具体的に前面に参照）プローブを述べました。分子プローブを使用したプロトコルは濃度およびインキュベーション時間で、主に異なる、種間で変動します。 M.aeruginosaに出るこのプロトコルに続いて緑の核酸プローブは、10分後に1μMで30インキュベーションの分とオレンジの核酸プローブの後、0.5μMの濃度で最適化しました。両方のプローブで述べた最適未満の濃度は、膜の損傷による細胞の下に報告につながりました。逆に、両方のプローブで5μMの濃度と高いが「非生存」細胞数の過剰表現につながる、「ライブ」細胞が標的の蛍光を生成することにより非特異的な染色の種類を示しました。ポジティブコントロール（加熱殺菌）コントロールの生成の妥当性が議論の対象に残るものの、検証可能な死んだバイオマスを提供しました。我々はデ・緑とオレンジの核酸プローブを最適化するためのステップの論理的順序を実証することにより、効果的にシアノバクテリアの生理学的状態を分析するために使用できるプロトコルを作成する方法monstrate。

対数期におけるM.aeruginosaのバッチ培養からの前方光散乱（FSC）および側方光散乱（SSC）出力は、それぞれのセルの大きさ（直径）と内部粒度に関する情報（ 図1A）を提供します。 FSCはM.aeruginosaことには大きすぎるおよび/ ​​または小である細胞を識別することができます。この差別またはゲーティングはFSC出力（ 図1C）の特定...

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Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism Microcystis aeruginosa Using Flow Cytometry

微生物集団は、全体的な動作を決定することができる実質的な細胞の不均一性を、含まれています。フローサイトメトリーを介して、分子プローブ分析は、細胞の生理的状態を決定することができ、しかし、そのアプリケーションは、種間で変化します。本研究では、偽陽性の結果を過小評価または記録することなく、正確にシアノバクテリアの集団内の細胞の死亡率を決定するためのプロトコルを提供します。

光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（<em&gt;アオコ緑膿菌</em&gt;）フローサイトメトリーを使用して

Microbial subpopulations in field and laboratory studies have been shown to display high heterogeneity in morphological and physiological parameters. ...

molecular-probe-optimization-to-determine-cell-mortality

Research

JoVE Journal

Medicine

Molecular Probe Optimization to Determine Cell Mortality in a Photosynthetic Organism (Microcystis aeruginosa) Using Flow Cytometry

8.8K ビュー.  Bournemouth University. 微生物集団は、全体的な動作を決定することができる実質的な細胞の不均一性を、含まれています。フローサイトメトリーを介して、分子プローブ分析は、細胞の生理的状態を決定することができ、しかし、そのアプリケーションは、種間で変化します。本研究では、偽陽性の結果を過小評価または記録することなく、正確にシアノバクテリアの集団内?...

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Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

免疫・感染学

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

環境学

Characterizing Microbiome Dynamics &#8211; Flow Cytometry Based Workflows from Pure Cultures to Natural Communities

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical applications driven by microorganisms. Next generation sequencing methods are widely utilized to resolve microbiomes, but they are generally resource and time intensive and deliver mostly qualitative information. Flow cytometric microbiome analysis does not suffer from those disadvantages and can provide relative subcommunity abundances and absolute cell numbers at-line. Although it does not deliver direct phylogenetic information, it can enhance the analysis depth and resolution of sequencing approaches. In sharp contrast to medical applications in both research and routine settings, flow cytometry is still not widely used for microbiome analysis. Missing information on sample preparation and data analysis pipelines may create an entry barrier for the researchers facing microbiome analysis challenges that would often be textbook flow cytometry applications. Here, we present three comprehensive workflows for pure cultures, complex communities in clear medium and complex communities in challenging matrices, respectively. We describe individual sampling and fixation procedures and optimized staining protocols for the respective sample sets. We elaborate the cytometric analysis with a complex research centered and an application focused bench top device, describe the cell sorting procedure and suggest data analysis packages. We furthermore propose important experimental controls and apply the presented workflows to the respective sample sets.

Flow cytometric analysis has proven valuable for investigating pure cultures and monitoring microbial community dynamics. We present three comprehensive workflows, from sampling to data analysis, for pure cultures and complex communities in clear medium as well as in challenging matrices, respectively.

特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

The investigation of pure cultures and monitoring of microbial community dynamics is vital to understand and control natural ecosystems and technical ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge rapidly in tumor cells as a response to damage induced by various cancer treatments. Tumor cell senescence is generally considered undesirable, as senescent cells become resistant to death and block tumor remission while exacerbating tumor malignancy and treatment resistance. Therefore, the identification of senescent tumor cells is of ongoing interest to the cancer research community. Various senescence assays exist, many based on the activity of the well-known senescence marker, senescence-associated beta-galactosidase (SA-&#946;-Gal). 
Typically, the SA-&#946;-Gal assay is performed using a chromogenic substrate (X-Gal) on fixed cells, with the slow and subjective enumeration of "blue" senescent cells by light microscopy. Improved assays using cell-permeant, fluorescent SA-&#946;-Gal substrates, including C12-FDG (green) and DDAO-Galactoside (DDAOG; far-red), have enabled the analysis of living cells and allowed the use of high-throughput fluorescent analysis platforms, including flow cytometers. C12-FDG is a well-documented probe for SA-&#946;-Gal, but its green fluorescent emission overlaps with intrinsic cellular autofluorescence (AF) that arises during senescence due to the accumulation of lipofuscin aggregates. By utilizing the far-red SA-&#946;-Gal probe DDAOG, green cellular autofluorescence can be used as a secondary parameter to confirm senescence, adding reliability to the assay. The remaining fluorescence channels can be used for cell viability staining or optional fluorescent immunolabeling.
Using flow cytometry, we demonstrate the use of DDAOG and lipofuscin autofluorescence as a dual-parameter assay for the identification of senescent tumor cells. Quantitation of the percentage of viable senescent cells is performed. If desired, an optional immunolabeling step may be included to evaluate cell surface antigens of interest. Identified senescent cells can also be flow cytometrically sorted and collected for downstream analysis. Collected senescent cells can be immediately lysed (e.g., for immunoassays or 'omics analysis) or further cultured.

A protocol for fluorescent, flow cytometric quantification of senescent cancer cells induced by chemotherapy drugs in cell culture or in murine tumor models is presented. Optional procedures include co-immunostaining, sample fixation to facilitate large batch or time point analysis, and the enrichment of viable senescent cells by flow cytometric sorting.

フローサイトメトリーによる老化腫瘍細胞の同定と濃縮のための遠赤色蛍光老化関連β-ガラクトシダーゼプローブ

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

がん研究

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing need for the development of methodologies that improve the detection of antigens immobilized on the surface of spores together with their quantification. Flow cytometry-based analyses have been previously proposed as fast, reliable, and specific approaches for detecting labeled cells of B. subtilis. Herein, we propose the use of flow cytometry to evaluate the display efficiency of a fluorescent antibody (FA) on the surface of the spore and quantify the number of spores using counting beads. 
For this, we used ethidium bromide as a DNA marker and an allophycocyanin (APC)-labeled antibody, which was coupled to the spores, as a surface marker. The quantification of spores was performed using counting beads since this technique demonstrates high accuracy in the detection of cells. The labeled spores were analyzed using a flow cytometer, which confirmed the coupling. As a result, it was demonstrated that DNA labeling improved the accuracy of quantification by flow cytometry, for the detection of germinated spores. It was observed that ethidium bromide was not able to label dormant spores; however, this technique provides a more precise determination of the number of spores with fluorescent protein coupled to their surface, thus helping in the development of studies that focus on the use of spores as a biotechnological platform in different applications.

Improvement of Bacillus subtilis Spore Enumeration and Label Analysis in Flow Cytometry

This protocol focuses on the use of flow cytometry and counting beads to quantify bacterial spores labeled with ethidium bromide. The method is also efficient for analyzing the covalent coupling of proteins on the surface of intact spores.

フローサイトメトリーにおける 枯草菌 胞子の計数と標識解析の改善

The spores of Bacillus subtilis have already been proposed for different biotechnological and immunological applications; however, there is an increasing ...

生化学

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating cells. Cell cycle division is an integral part of growth and reproduction and deregulation of key cell cycle components have been implicated in the precipitating events of carcinogenesis 1,2. Molecular agents in anti-cancer therapies frequently target biological pathways responsible for the regulation and coordination of cell cycle division 3. Although cell cycle kinetics tend to vary according to cell type, the distribution of cells amongst the four stages of the cell cycle is rather consistent within a particular cell line due to the consistent pattern of mitogen and growth factor expression. Genotoxic events and other cellular stressors can result in a temporary block of cell cycle progression, resulting in arrest or a temporary pause in a particular cell cycle phase to allow for instigation of the appropriate response mechanism. 
The ability to experimentally observe the behavior of a cell population with reference to their cell cycle progression stage is an important advance in cell biology. Common procedures such as mitotic shake off, differential centrifugation or flow cytometry-based sorting are used to isolate cells at specific stages of the cell cycle 4-6. These fractionated, cell cycle phase-enriched populations are then subjected to experimental treatments. Yield, purity and viability of the separated fractions can often be compromised using these physical separation methods. As well, the time lapse between separation of the cell populations and the start of experimental treatment, whereby the fractionated cells can progress from the selected cell cycle stage, can pose significant challenges in the successful implementation and interpretation of these experiments.
Other approaches to study cell cycle stages include the use of chemicals to synchronize cells. Treatment of cells with chemical inhibitors of key metabolic processes for each cell cycle stage are useful in blocking the progression of the cell cycle to the next stage. For example, the ribonucleotide reductase inhibitor hydroxyurea halts cells at the G1/S juncture by limiting the supply of deoxynucleotides, the building blocks of DNA. Other notable chemicals include treatment with aphidicolin, a polymerase alpha inhibitor for G1 arrest, treatment with colchicine and nocodazole, both of which interfere with mitotic spindle formation to halt cells in M phase and finally, treatment with the DNA chain terminator 5-fluorodeoxyridine to initiate S phase arrest 7-9. Treatment with these chemicals is an effective means of synchronizing an entire population of cells at a particular phase. With removal of the chemical, cells rejoin the cell cycle in unison. Treatment of the test agent following release from the cell cycle blocking chemical ensures that the drug response elicited is from a uniform, cell cycle stage-specific population. However, since many of the chemical synchronizers are known genotoxic compounds, teasing apart the participation of various response pathways (to the synchronizers vs. the test agents) is challenging. 
Here we describe a metabolic labeling method for following a subpopulation of actively cycling cells through their progression from the DNA replication phase, through to the division and separation of their daughter cells. Coupled with flow cytometry quantification, this protocol enables for measurement of kinetic progression of the cell cycle in the absence of either mechanically- or chemically- induced cellular stresses commonly associated with other cell cycle synchronization methodologies 10. In the following sections we will discuss the methodology, as well as some of its applications in biomedical research.

Tracking subtle changes in the progression and kinetics of cell cycle stages can be accomplished by use of a combination of metabolic labeling of nucleic acids with BrdU and total genomic DNA staining via Propidium Iodide. This method avoids the need of chemical synchronization of cycling cells, thereby preventing the introduction of non-specific DNA damage, which in turn affects cell cycle progression.

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

生物学

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the modification of proteins, lipids, and DNA, which finally may lead to alteration in cellular function and cell death. Therefore, it is beneficial for cells to increase their antioxidant defense in response to detrimental insults, either by activating an antioxidant pathway like Keap1/Nrf2 or by improving redox scavengers (vitamins A, C, and E, &#946;-carotene, and polyphenols, among others). Inflammation and oxidative stress are involved in the pathogenesis and progression of retinopathies, such as diabetic retinopathy (DR) and retinopathy of prematurity (ROP). Since M&#252;ller glial cells (MGCs) play a key role in the homeostasis of neural retinal tissue, they are considered an ideal model to study these cellular protective mechanisms. In this sense, quantifying ROS levels with a reproducible and simple method is essential to assess the contribution of pathways or molecules that participate in the antioxidant cell defense mechanism. In this article, we provide a complete description of the procedures required for the measurement of ROS with DCFH-DA probe and flow cytometry in MGCs. Key steps for flow cytometry data processing with the software are provided here, so the readers will be able to measure ROS levels (geometric means of FITC) and analyze fluorescence histograms. These tools are highly helpful to evaluate not only the increase in ROS after a cellular insult but also to study the antioxidant effect of certain molecules that can provide a protective effect on the cells.

Here, we propose a systematized, accessible, and reproducible protocol to detect cellular reactive oxygen species (ROS) using 2&#8242;,7&#8242;-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA) in M&#252;ller glial cells (MGCs). This method quantifies total cellular ROS levels with a flow cytometer. This protocol is very easy to use, suitable, and reproducible.

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

神経科学

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Source: McBride, J. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54779">Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the lytic activity of natural killer cells against fluorescently-stained target cells. The method enables NK cell-induced cytotoxicity measurement by staining dead cells and using a flow cytometer to quantify live and dead target cells.

光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（

要約

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の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム

フローサイトメトリーによる水生バイオフィルムの特性

特徴マイクロバイダイナミクス-フローサイトメトリーベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

フローサイトメトリーによる老化腫瘍細胞の同定と濃縮のための遠赤色蛍光老化関連β-ガラクトシダーゼプローブ

フローサイトメトリーにおける枯草菌胞子の計数と標識解析の改善

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Flow Cytometric Analysis 用サンプル調製

光合成生物における細胞死を決定するための分子プローブの最適化（

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の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

特徴マイクロバイ ダイナミクス-フローサイトメトリー ベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

フローサイトメトリーによる老化腫瘍細胞の同定と濃縮のための遠赤色蛍光老化関連β-ガラクトシダーゼプローブ

フローサイトメトリーにおける 枯草菌 胞子の計数と標識解析の改善

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Flow Cytometric Analysis 用サンプル調製

フローサイトメトリーによる水生バイオフィルムの特性

特徴マイクロバイダイナミクス-フローサイトメトリーベースの自然なコミュニティに純粋培養からワークフロー

フローサイトメトリーにおける枯草菌胞子の計数と標識解析の改善