我々はFACS分析の支援についてはUBCで医学研究センターのアンディ·ジョンソンに感謝します。ウォン研究所のがん研究の資金は、カナダの癌協会総合研究所（オペレーティング·グラント＃019250）でと薬学、UBCの学部の研究再投資資金から提供されています。 JMYWは、カナダリサーチチェアと保健研究キャリア開発プログラムのマイケル·スミス財団によってサポートされています。

1。細胞調製<img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig0.jpg" alt="図0" /> <ol><li>約60％コンフルエントの密度を達成するために細胞をプレート。細胞は、収集時に対数増殖期にある必要があります。 MCF7細胞では、これは適切なメディアで5×10 5細胞/ 10 cmのプレートに播種することによって達成される。 HT29とLS180細胞を6×10 5細胞/ 6 cmのプレートで播種されています。我々は、DMEM培地、10％FBSおよび1xペニシリン/ストレプトマイシンを補充した使用されます。で正しい陽性および陰性コントロールのための種子プレートに必ずテストサンプルに加えて。彼らは次のとおりです。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td>私は</td><td>陽性対照</td><td>のみBrdUの</td></tr><tr><td> 2 </td><td>陽性対照</td><td> PIのみ</td></tr><tr><td> 3 </td><td>負の制御</td><td>たBrdU陰性、PI陰性</td></tr></tbody></table> （このような、このプロトコルで説明されている一つとして、複数の時点で予備実験は、将来のコレクションを実施するために、その間の時間枠を絞り込むために使用することができることに留意する必要があります。） <ol start="2"><li>メッキ細胞を37℃でインキュベートし、5％24〜48時間のためにCO 2、それによって細胞が回復し、添付することができます。 </li><li>ブロモデオキシウリジン（BrdU）で標識細胞をパルスするには、DMEMは、wiを置き換えられます。10μMのBrdUを含む番目の新鮮な培地。細胞は、°C、5％CO 2は、DNAへのBrdUの取り込みを可能にするために37℃で1時間インキュベートされています。ネガティブコントロールとして動作するように未処理の一皿を残すようにしてください。 </li><li>パルス標識培地を除去し、細胞を1X PBSで簡単に洗浄する。 </li><li>新鮮な増殖培地に追加され（マイナスBrdU）の、細胞を収穫するための適切なタイムポイントに達するまで37℃、5％CO 2でインキュベートし続けることが許可されています。 </li></ol> 2。収穫と固定<ol><li>ステップ1.3から未処理の細胞は、ゼロタイムポイントと見なされます。このサンプルは、BrdUの治療直後に収集された1時間タイムポイントと一緒に収穫することができます。 </li><li>細胞を回収するには、メディアが削除され、プレートは、1×PBSで1回リンスしています。 </li><li>細胞は5分で燮は1500 rpmで遠心分離することによって、トリプシン処理し、培養培地中で収集され、その後、ペレット化されているernatantは破棄されます。 </li><li> 5ミリリットルの氷冷1X PBSで1から10×10 6細胞を洗浄します。 5分の上清を1500rpmで遠心分離は破棄されます。 </li><li>細胞ペレットを氷冷PBS / 1％FBSを100μlに再懸濁されています。細胞の凝集を防止するのにPBSエイズの1％FBSを添加する。 </li><li> -20°C、細胞を固定するために70％エタノール5mlにドロップでこれらの細胞のドロップを追加します。 </li><li> 4℃で一晩で30分間またはストア氷上でインキュベートします。これは、様々の時点からのサンプルの収集を停止するときの理想的なステップです。サンプルは、それらのプロトコルの残りの部分を同時に処理できるようになり、数日間エタノールにしておくことができます。 </li></ol> 3。 BrdUとPI染色<ol><li> 1500 rpmで5分間遠心分離により細胞をペレット化する。 </li><li>固定液を除去するが、ボルテックスによりペレットを緩めに〜50μlを残す。 </li><li> DNAを変性させ、徐々に2NのHCl /トリトンX-100の1ミリリットルを追加するボルテックスしながら滴下した。室温で30分間サンプルをインキュベートします。 </li><li> 1500rpmで5分間サンプルを遠心分離により細胞をペレット化する。吸引し、上清を捨てる。 </li><li>変性ステップを中和するために、0.1Mナトリウム四ホウ酸、pHが8.5の1 mlに細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> 1500rpmで5分間遠心します。吸引し、上清を捨てる。 </li><li> BrdU染色ミックス75μL（50μlの0.5％のトウィーン20/1％BSA / PBS +20μlのFITC標識抗BrdU + 5μlの10 mg / mlのRNaseの）に細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>光から保護された45分間室温でインキュベートします。 </li><li>細胞をペレット化する、1500 rpmで5分間サンプルを遠心します。吸引し、上清を捨てる。 </li><li> 5μg/ mlのヨウ化プロピジウムを含む1mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁します。 </li></ol> 4。フローサイトメトリー<ol><li>細胞は、488 nmのレーザーとを備えたフローサイトメトリーを分析する適切なフィルタが必要です。そのようなCellQuestなどの分析ソフトウェアは、以下に概説するプロットを作成する必要があります。 </li><li>フローサイトメーターを介してサンプルを実行すると、細胞の適切な粒度分布（ 図1A）を確保するために前方散乱（SSC-H）対側方散乱（FSC-H）プロットを作成します。これらのパラメータの両方が線形スケールでプロットされています。 </li><li>同時にFL3-H（染色PI）対FL2-W（ 図1B）のプロットを表示します。このプロットは、細胞周期の正常な分布パターン内にある細胞の割合を分離するためにゲート（R3）を作成するために使用されます。一般に、この分布パターンは、それぞれ、細胞周期のG1およびG2の段階を表すPI染色の2Nと4N DNA含量からの細胞のつのクラスタによって特徴づけられる。これらの2つのクラスタ間に位置するセルの文字列は、細胞周期のS期に発生する進行中のDNA複製の代表です。 </li><li>プロットdisplayiを作成します。NG、y軸とx軸（ 図1C）のPI（線形プロット）のFL1-Hのステップ4.3（FITC、ログプロット）からゲート細胞（R3）。このプロットは分析用のデータを収集するだけでなく、1.1で概説したさまざまなコントロールを使用して残りのパラメータを設定するために使用されます。 </li><li>メーターの上にPIのみ染色したサンプルを配置します。 x軸上の〜200℃でG1を配置するゲインを調整します。これは、染色、PIのヒストグラムプロットで視覚化することは容易になります。 </li><li>第2の制御フローサイトメーターでのBrdUのみサンプルを実行するが含まれます。細胞の2集団（BrdU陽性対陰性のBrdU）がプロットに表示されるようにゲインを調整します。理想的には、BrdUを陰性細胞はちょうど10 -1の下に表示されるように配置されています。 </li><li>最後のコントロールでは、BrdUを/ PI陰性サンプルです。細胞は上部または右側の象限のいずれにも表示されないことを確認するには、この負の制御を実行します。 </li><li>さまざまなプロットのパラメータが設定されていたら、フローサイトメーターは、校正およびBrdUおよびPI染色した細胞を処理するための準備ができています。正しいPI画分（4.3ステップを参照してください）​​のゲートである10,000個の細胞の最小値は、コレクションごとに読み取る必要があります。 </li><li>収集したデータを分析するには、そのようなFlowJoまたはFacsDivaなどのソフトウェアが利用されています。上記の各プロットは、これらのプログラムで再現し、定量的かつ統計的な分析が行うことができます。 </li><li>分析のエンドポイントはいくつかの連続した​​手順を実行します。 PI対FL2-Wプロットから正PIとしてゲート細胞とFITC対PIのプロットを作成すると、1つは、サイクリング人口を区別することができます。第2のゲートは、BrdU陽性集団を単離することにより、このプロットから作成されます。 x軸上のPIヒストグラムプロット上で、この独特の人口を表現すると、1つは、細胞周期の進行の経時変化を追跡することができます。これは時間の関数としてG1またはG2コンテンツのBrdU陽性細胞数をプロットすることにより、さらに視覚化することができます。 </li></ol> 5。代表的な結果通常、ヨウ化プロピジウムで染色したサイクリング細胞はそれぞれ、2Nと4N DNA含量を含有する細胞（ 図2）に対応するG1とG2で明瞭なピークを持っています。 BrdUでパルスラベリングは積極的にDNA（すなわちS期）を合成している細胞の亜集団の選択的標識が可能になります。まもなくBrdUの試薬 ​​を除去した後、すべての標識細胞は、S相（ 図3）にあります。短パルスいずれかにラベル付けを制限することによって、彼らは、細胞周期の後続のフェーズを通過する数々の時間点を通して細胞のこの今の異なるサブ母集団に従うことができます。これは、G1とG2のピークの明確な欠如として、図3の1時間の時点で視覚化することができます。 追加情報はBrdU標識ステップから派生させることができます。積極的に分裂する細胞の割合は、ESTは、測定することができますが、だけでなく、2つのサンプル間の細胞周期ステージの分布のimateも同様に決定することができます。彼らはG2にサイクル、進歩を続けているBrdUの試薬の除去後に等間隔で細胞を集めることによって、細胞を追跡することができ、最終的に最終的にG1とBrdU陽性娘細胞として浮上し、元の細胞の細胞分裂に至るまで移動するDNA含有量（ 図4）。細胞周期の位相の定量化と運動解析の例を図5に記載されています。 <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig1.jpg" alt="図1" /> 図1代表的なMCF7細胞集団の（A）前方散乱対側の散布図。代表的なMCF7細胞集団の（B）PI対幅（FL-W）をプロット。ゲーティングは最終的な分析（R3）でセルのダブレットを除外することが示されている。彼らはレーザービームとtheref通過に時間がかかるように細胞ダブレットは、単一のセルよりも大きいパルス幅を持っています。鉱石は、分析から除外することができます。代表的なMCF7細胞集団の（C）PIに対するFITC（BrdU）のプロット。ゲーティングは、FITC（BrdU）の陽性細胞（R4）を含むように示されています。 <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig2.jpg" alt="図2" /> 図2通常の細胞をサイクリングの総人口の代表的なヒストグラムプロット。 <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig3.jpg" alt="図3" /> 図3 FITC（BrdU）の陽性細胞のゲーティングした後、BrdUのパルスを除去した後1時間を収集された細胞のヒストグラムプロット。ラベルの除去後早期のタイムポイントでのBrdU陽性細胞は、DNA合成中の細胞の正常なラベルを確認し、細胞周期のS期にある細胞を用いた一貫性のあるDNAのコンテンツを表示するサンプルに対応するPIプロファイルを示しています。 <img src="/files/ftp_upload/4045/4045fig4.jpg" a<html> LT = &quot;図4&quot; /&gt; 図4の癌細胞株、大腸癌HT29（A）及びLS180（B）、ならびに乳癌MCF7（C）との間の細胞周期進行動態の比較。細胞は、BrdUのパルスを除去した後、8時間ごとに時間を収集した。この実験では、大腸の細胞株LS180における細胞周期のG2期を通して加速、細胞周期の進行の明確なプロファイルを観察した。大腸癌細胞の2つのプロファイル間で速度を比較すると、G1ピークの出現はこのピークを欠いているHT-29細胞株に対応する時点と比較して、LS180細胞でT = 4H後のBrdUで明らかである。 2大腸の細胞株、MCF7細胞のいずれかと比較して大幅に減少率でサイクリングされています。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig4large.jpg">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <html>再度5 &quot;/&gt; 図5：BrdU標識癌細胞の（A）定量的細胞周期の位相解析。ディーン/ジェット/フォックスアルゴリズムは、HT29、LS180およびMCF7（緑色で示す）に適用した。各サンプルから得られた細胞周期の位相分布は、各フェーズの％合計BrdU陽性細胞として表現さ​​れます。各細胞株のための唯一の選択の時点では、無効な結果が得られた以前の時点のいくつかの分析として、表示​​されます。これらの以前の時点では、すべてのBrdU陽性細胞はS期にあり、したがって、アルゴリズムがアプリケーションに必要な個別のG1とG2のピークを、欠けている。 （B）癌細胞のヒストグラムは、細胞周期のG2 / M期を通して進行の動態を示す。 G2 / M期を通じて進行はHT29およびMCF7続いLS180細胞のために最も速くなります。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045fig5large.jpg">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <html> JPG &quot;ALT =&quot;図S1 &quot;/&gt; 図S1。フローサイトメトリーを制御します。 MCF7細胞は、細胞がPIでもBrdUの染色でもない（A）ネガティブコントロールとして表示されます。 （B）PIのみ染色した。 （C）のBrdU-FITC標識したサンプルは、。 <img src="/files/ftp_upload/4045/4045figS2.jpg" alt="S2は、図" /> PIに対するFITC（BrdU）の蛍光発光スペクトルの関係を示すS2。模式図を示します。蛍光チャネル1（FL1、FITC）と蛍光チャネル3（FL3、PI用）スペクトル収集ウィンドウは、対応するボックスに表示されます。 FL1とFL3検出の間には、蛍光体のスペクトルの重複はありません。 PIとFITC-BrdUのから実験データの共標識された細胞は、それぞれFL1/FL3チャネルで収集されたとき明らかに、蛍光補正は必要ありません。蛍光スペクトルは、BD Biosciences社のWebサイトから得られた。ターゲット= &quot;_blank&quot;&gt; http://www.bdbiosciences.com/research/multicolor/spectrum_viewer。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4045/4045figS2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+B1+expression+in+HeLa+S3+cells+studied+by+flow+cytometry.">Cyclin B1 expression in HeLa S3 cells studied by flow cytometry.</a> Exp. Cell Res. 211, 275-281 (1994).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

BrdUの取り込みをフローサイトメトリーを組み合わせることにより、我々は細胞周期動態を検討するために必要なツールを持っています。チミジンのアナログとして機能するBrdUの独特のプロパティは、サイクリング細胞のDNA含量の定量を可能にするものです。細胞周期の合成フェーズで成長娘DNA鎖へのBrdUの取り込みは1つがG2での成長期に、最終的に細胞分裂に、S期におけるDNAの複製を介し?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ブロモデオキシウリジン</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 55089 </td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>シグマ</td><td> 287075 </td><td> 1mg/ml株式</td></tr><tr><td> FITC標識抗BrdU </td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 347583 </td><td></td></tr><tr><td>四ホウ酸ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td> S80172 </td><td> 0.1M、pH 8.5の</td></tr><tr><td> FACSキャリバー</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring cell cycle progression kinetics with metabolic labeling and flow cytometry

細胞周期のさまざまな段階を経て開始とその後の進行の正確な制御は、細胞の増殖に極めて重要である。細胞周期の分裂は、成長と重要な細胞周期成分の再現性と規制緩和が発癌1,2の沈殿イベントに関与しているの不可欠な部分です。抗がん治療における分子のエージェントが頻繁に細胞周期の分裂3の規制と調整を担当生物学的経路を対象としています。細胞周期動態は細胞の種類に応じて変化する傾向があるが、細胞周期の4つの段階の中の細胞の分布は、マイトジェン、成長因子の発現の一貫したパ​​ターンに起因する特定の細胞株内ではなく、一貫性があります。遺伝毒性のイベントや他の細胞ストレスがinstiを可能にするために逮捕されたり、特定の細胞周期フェーズの一時的なポーズ、その結果、細胞周期の進行を一時的にブロックになることが適切な応答機構のgation。 実験的にそれらの細胞周期の進行の段階への参照を使用して、細胞集団の振る舞い​​を観察する能力は、細胞生物学における重要な前進である。そのような細胞分裂などの一般的な手順は、細胞周期4-6の特定の段階で細胞を単離するために使用され、分画遠心法またはフローサイトメトリーベースのソートを振り払う。これらを分画し、細胞周期相濃縮集団はその後、実験的な治療に供される。区切られた画分の収量、純度、生存率は、しばしば、これらの物理的な分離メソッドを使用して、妥協することができます。同様に、細胞集団の分離分画した細胞が選択された細胞周期の段階から進行することができる実験的な治療の開始の間の時間経過は、実装を成功させると、これらの実験の解釈に重要な課題を提起することができます。 STに他のアプローチUDY細胞周期の段階は、細胞を同期させる化学物質の使用が含まれています。各細胞周期ステージのための鍵となる代謝プロセスの化学的阻害剤による細胞の処理は、次の段階に細胞周期の進行を阻止するのに有用である。デオキシヌクレオチド、DNAのビルディングブロックの供給を制限することにより、G1 / S時点で、例えば、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤ヒドロキシウレアを停止した細胞。他の顕著な化学物質がアフィジコリンによる治療を含む、有糸分裂紡錘体の形成を妨げるどちらもG1停止のためのポリメラーゼα阻害剤、コルヒチンとノコダゾールによる治療は、M期​​で細胞を停止し、最終的に、DNA鎖ターミネーター5 fluorodeoxyridineによる治療が開始するS期停止7-9これらの化学物質による治療は、特定の段階で細胞の全人口を同期させる有効な手段である。化学物質の除去と、細胞が一斉に細胞周期に復帰。テストエージェントは、次のリリースの治療細胞周期阻止化学物質から誘発される薬物反応が均一で、細胞周期ステージ特定の集団からのものであることを保証します。しかし、化学シンクロナイザの多くのため、挑戦している様々な応答経路（テストエージェント対シンクロナイザまで）の参加を離れてからかう、遺伝毒性の化合物が知られている。 ここでは、彼らの娘細胞の分裂と分離に至るまで、積極的にDNA複製の段階からその進行を介して細胞を自転車の集団を以下の代謝標識法を説明します。フローサイトメトリーの定量化と相まって、このプロトコルのいずれかを機械的または化学的に誘導され、携帯は一般的に他の10の細胞周期の同期化の方法論に関連付けられているストレスの存在下で細胞周期の進行運動を測定するために有効になります。以下のセクションでは、方法論だけでなく、生物医学研究への応用のいくつかを説明します。

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Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

細胞周期ステージの進行と動態の追跡微妙な変化は、BrdUとヨウ化プロピジウムを経由して全ゲノムDNAを染色した核酸の代謝標識の組み合わせの使用によって達成することができます。このメソッドは、それによって順番に細胞周期の進行に影響を及ぼす非特異的DNA損傷の導入を防止し、サイクリング細胞の化学物質の同期の必要がなくなります。

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

measuring-cell-cycle-progression-kinetics-with-metabolic-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K ビュー.  University of British Columbia. 細胞周期ステージの進行と動態の追跡微妙な変化は、BrdUとヨウ化プロピジウムを経由して全ゲノムDNAを染色した核酸の代謝標識の組み合わせの使用によって達成することができます。このメソッドは、それによって順番に細胞周期の進行に影響を及ぼす非特異的DNA損傷の導入を防止し、サイクリング細胞の化学物質の同期の必要がなくなります。

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Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

FMラベリングを用いた神経細胞の測定エキソサイトーシス

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

生物学

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane biogenesis occurs rapidly and in an inducible manner. We have found that phagocytosis of latex beads is practical for these purposes as cells rapidly synthesize membrane lipids to replenish membrane pools lost as  wrapping material  during particle engulfment. Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-Glo  Luciferase Assay System from Promega.

Here, we describe procedures for studying changes in phagocytosis-induced gene expression with a luciferase-based reporter gene approach using the Dual-GloTM Luciferase Assay System from Promega.

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

To study the coordination of different lipid synthesis pathways during membrane biogenesis it is useful to work with an experimental system where membrane ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae zygotes result from the fusion of haploid cells of distinct mating type (MATa, MATalpha) and give rise to corresponding stable diploids that successively generate as many as 20 diploid progeny as a result of their strikingly asymmetric mitotic divisions 2. Zygote formation is orchestrated by a complex sequence of events: In this process, soluble mating factors bind to cognate receptors, triggering receptor-mediated signaling cascades that facilitate interruption of the cell cycle and culminate in cell-cell fusion. Zygotes may be considered a model for progenitor or stem cell function.
Although much has been learned about the formation of zygotes and although zygotes have been used to investigate cell-molecular questions of general significance, almost all studies have made use of mating mixtures in which zygotes are intermixed with a majority population of haploid cells 3-8. Many aspects of the biochemistry of zygote formation and the continuing life of the zygote therefore remain uninvestigated.
Reports of purification of yeast zygotes describe protocols based on their sedimentation properties 9; however, this sedimentation-based procedure did not yield nearly 90% purity in our hands. Moreover, it has the disadvantage that cells are exposed to hypertonic sorbitol. We therefore have developed a versatile purification procedure. For this purpose, pairs of haploid cells expressing red or green fluorescent proteins were co-incubated to allow zygote formation, harvested at various times, and the resulting zygotes were purified using a flow cytometry-based sorting protocol. This technique provides a convenient visual assessment of purity and maturation. The average purity of the fraction is approximately 90%. According to the timing of harvest, zygotes of varying degrees of maturity can be recovered. The purified samples provide a convenient point of departure for "-omic" studies, for recovery of initial progeny, and for systematic investigation of this progenitor cell.

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

To purify zygotes of S. cerevisiae, haploid cells of opposite mating type were engineered to express red or green fluorescent proteins, co-incubated to allow zygote formation, and fractionated using a flow cytometry-based protocol. The highly-enriched fraction enables subsequent "-omic" studies, recovery of initial progeny, and systematic investigation of zygote morphogenesis.

のフローサイトメトリーベースの精製<em&gt; S.セレビ</em&gt;受精卵

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

細胞内Ca測定<sup&gt; 2 +</sup4つの方法を使用して人間の精子で&gt;変更：従来の蛍光測定、停止フロー蛍光法、フローサイトメトリーおよび単一細胞イメージング

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, a Ras of complex proteins domain (ROC), a C-terminal of ROC domain (COR), and leucine-rich and ankyrin-like repeats at the N-terminus. The precise cellular roles of LRRK1 and LRRK2 have yet to be elucidated, however LRRK1 has been implicated in tyrosine kinase receptor signaling1,2, while LRRK2 is implicated in the pathogenesis of Parkinson's disease3,4. In this report, we present a protocol to label the LRRK1 and LRRK2 proteins in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure the overall phosphorylation levels of these 2 proteins in cells. In brief, affinity tagged LRRK proteins are expressed in HEK293T cells which are exposed to medium containing 32P-orthophosphate. The 32P-orthophosphate is assimilated by the cells after only a few hours of incubation and all molecules in the cell containing phosphates are thereby radioactively labeled. Via the affinity tag (3xflag) the LRRK proteins are isolated from other cellular components by immunoprecipitation. Immunoprecipitates are then separated via SDS-PAGE, blotted to PVDF membranes and analysis of the incorporated phosphates is performed by autoradiography (32P signal) and western detection (protein signal) of the proteins on the blots. The protocol can readily be adapted to monitor phosphorylation of any other protein that can be expressed in cells and isolated by immunoprecipitation.

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are multidomain proteins which encode both GTPase and kinase domains and which are phosphorylated in cells. Here, we present a protocol to label LRRK1 and LRRK2 in cells with 32P orthophosphate, thereby providing a means to measure their overall cellular phophorylation levels.

ロイシンリッチの代謝標識は、放射性リン酸キナーゼ1および2を繰り返します

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;サスペンション細胞培養

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LEDサーモフロー - フローサイトメトリーで光遺伝学を組み合わせます

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...