当社のマルチパラメーターフローサイトメトリープロトコルは、がん生物学および治療において進行中の研究条件である腫瘍細胞における治療誘発老化の迅速かつ改善された検出を可能にします。当社のフローサイトメトリー老化アッセイは、既存の顕微鏡ベースのアッセイよりも迅速です。老化細胞を同定するために、1つではなく2つのマーカーを使用し、アッセイの信頼性を向上させます。
細胞を蛍光抗体と共染色して、目的の追加のターゲットを検出することができます。フローサイトメトリーソーティングは、下流分析のために老化細胞の集団を濃縮するために使用できます。このアッセイは、培養がん細胞株、または穏やかな解離後の腫瘍サンプル全体の老化細胞を検出できます。
この手法を試す前に、使用するフローサイトメーターの一般的な操作手順に精通していることが重要です。推奨フローサイトメーターの仕様については、本文を参照してください。薬物による老化誘導の前日に、0.25%トリプシンEDTAで癌細胞株培養物を回収する。
細胞を摂氏37度で5分間置き、トリプシンを活性化し、細胞単層を剥離します。単層が目に見えて剥離したら、等量の完全培養培地を加えてトリプシンを中和します。細胞懸濁液を滅菌円錐管に移す。
標準的な血球計算法を用いて細胞をカウントし、ミリリットル当たりの細胞を記録します。平板細胞は、標準的な6ウェルプラスチック培養プレートで1平方センチメートルあたり10〜3〜10倍で10〜3番目の細胞である。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします二酸化炭素と湿度。
翌日、エトポシドなどの目的の老化誘導剤で細胞を処理します。その後、老化の開始を可能にするために4日間インキュベートします。光学顕微鏡で細胞を毎日調べて、予想される形態変化を調べます。
老化の開始後、摂氏37度で5分間トリプシンEDTAを加えて細胞を収穫します。細胞が懸濁液に解離したら、等量の完全培地でトリプシンを中和します。細胞懸濁液の各ウェルを1.7ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
細胞を再度カウントし、サンプルごとに同数の細胞を新しいチューブセットに分注します。チューブを摂氏4度で1, 000 gで5分間遠心分離し、上清を取り除きます。まず、1ミリリットルあたり10〜6細胞の濃度で細胞ペレットにDMEM中の1マイクロモルのバフィロマイシンAの溶液を添加して培養細胞サンプルのリソソームpHを調整し、ピペットで混合する。
ローテーター上で摂氏37度で30分間低速でインキュベートします。次に、老化関連β-ガラクトシダーゼを染色するために、洗浄せずにDDAOGストック溶液を1ミリリットルあたり10マイクログラムでサンプルに加えます。直射日光から保護されたローテーターに60分間置きます。
前と同様に、チューブを遠心分離し、上清を除去し、PBS中の1ミリリットルの氷冷0.5%BSAでペレットを洗浄します。次に、300マイクロリットルの希釈カルセインバイオレット450 AM溶液を洗浄したセルペレットに加えます。暗闇の中で氷の上で15分間インキュベートします。
細胞サンプルをフローサイトメトリー機器対応チューブに移します。データ集録ソフトウェアで、紫チャンネルヒストグラムと遠赤チャンネル対緑チャンネルのドットプロットを開きます。低い吸気速度でサイトメーターのデータ取得を開始し、DDAOGで染色されたポジティブコントロールサンプルを吸気ポートに置きます。
サンプルデータの取得を開始します。各プロット内に90%以上のイベントが含まれるようにチャンネル電圧を調整します。すべての設定が最適になったら、サンプルごとに10, 000イベントを記録します。
DDAOGで染色された車両専用コントロールサンプルを吸気ポートに置きます。データ収集を開始し、サンプルあたり 10 、 000 イベントを記録します。自家蛍光(AF)およびDDAO-ガラクトシドシグナルの増加をポジティブコントロールと比較して探してください。
サンプルデータをfcsファイル形式で保存し、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを備えたワークステーションコンピュータにエクスポートします。サイトメトリーデータ解析ソフトウェアを使用して、取得したすべてのサンプルのfcsデータファイルをロードします。まず、生細胞をゲートするには、車両専用コントロールのサンプルデータをダブルクリックして、そのデータウィンドウを開きます。
データをバイオレット チャネル ヒストグラムとして視覚化します。CV 450によって染色された生細胞は、死細胞よりも明るい蛍光に基づいています。シングルゲートヒストグラムツールを使用してゲートを描画し、生細胞のみを含めます。
ゲートに実行可能という名前を付けます。次に、Viable ゲートをサンプルレイアウトウィンドウから他のセルサンプルにドラッグして、ゲートを均一に適用します。[レイアウト] ウィンドウを開きます。
レイアウトウィンドウで、すべてのサンプルをバイオレットチャンネルヒストグラムとして視覚化します。生細胞ゲーティングがサンプル間で適切であることを確認します。そうでない場合は、必要に応じて調整します。
次に、老化細胞をゲートするには、車両専用コントロールのゲートされた生残細胞データをダブルクリックして、そのデータウィンドウを開きます。次に、遠赤チャネルと緑チャネルのドットプロットとしてデータを視覚化します。[矩形ゲーティング] ツールを使用してゲートを描画し、右上の象限から DDAO 陽性セルと AF 陽性セルを 5% 未満含めます。
ゲートに「老化」という名前を付けます。次に、老化ゲートをサンプルレイアウトウィンドウからすべてのサンプルの実行可能なサブセットにドラッグして、ゲートを均一に適用します。レイアウトウィンドウに、すべての実行可能なセルゲートサブセットをドラッグアンドドロップします。
すべての生存サンプルを遠赤対緑のチャネルドットプロットとして視覚化し、結果を観察します。老化ゲートがすべてのプロットに表示され、車両のみのコントロールのゲートが5%未満の老化セルを示すことを確認します。これで分析は完了です。
データは、必要に応じてグラフ形式および表形式でエクスポートできるようになりました。エトポシドによって誘導された老化B16-F10メラノーマ細胞は、未処理細胞と比較して、老化関連β-ガラクトシダーゼの上昇によるX-galの切断により、形態の拡大と青色染色を示しました。エトポシド処理細胞を蛍光C12FDG(DDAOG)で染色したところ、X-galと同等の染色パターンと強度変動が示されました。
しかし、緑色のC12FDG発光と重なる細胞自家蛍光は、染色されていない老化細胞に蓄積することが示された。対照的に、自家蛍光は、DDAOGの遠赤色発光範囲では典型的には無視できる程度であった。散布図用のフローサイトメーターデータ収集セットアップ、市販のレインボー蛍光キャリブレーションミクロスフェアの5ピーク、および染色細胞からのシングルチャンネル蛍光データを以下に示します。
B16-F10メラノーマ細胞のDDADOGフローサイトメーター老化アッセイデータは、エトポシドによって誘導される治療誘発老化(TIS)が生細胞の35%で発生し、老化細胞除去剤ABT-263がTIS細胞をほぼ排除することを示しました。A549肺癌細胞では、生細胞の66%およびABT-263におけるブレオマイシン誘発TISの割合が15に減少した。ABT-263単独では、未処理の増殖細胞に対して毒性がなかった。
抗体共染色アッセイでは、PEチャネルデータのヒストグラムは、エトポシド処理細胞の42%が老化マーカーDPPP4陽性に対して陽性であることを示しました。さらに、2次元ドットプロットによる可視化では、エトポシド処理細胞の44%がDDAOGとDPP4でダブルポジティブであったのに対し、ビヒクルのみの細胞では4%であることが示されました。次にDDAOG染色細胞の固定を評価した。
固定されていない対照サンプルと比較して、固定サンプルは未処理細胞でわずかに高いバックグラウンドを示し、BLM処理細胞では老化としてスコアを付ける細胞の割合が高かった。この効果は、一晩、および摂氏4度で1週間保存された固定サンプルでも観察されました。フローサイトメトリーの分類および形態および増殖マーカーによる濃縮老化細胞集団の検証が示されている。
選別された老化細胞は、予想通り拡大形態を示し、アクチンを蛍光ファロイジンで染色することによって視覚化した。増殖マーカーKi67のシグナルの減少も免疫蛍光染色によって観察された。最後に、化学療法薬で治療された腫瘍の老化の定量化が評価されました。
組織におけるX-gal染色は比較的弱かったが、ドキソルビシンまたはペグ化リポソームドキソルビシンで治療された腫瘍、特にDDAO-ガラクトシドフローアッセイによって老化のスコアが陽性であった腫瘍では、青色染色が明らかであった。予想通り、生理食塩水のみの腫瘍はごくわずかな老化を示した。ここでは、他の生細胞アッセイと同様に、プロトコルステップは効率的かつ穏やかに実行する必要があります。
長時間の染色手順、または言及された時間を超えるインキュベーションは避けてください。老化細胞をフローサイトメトリーでソーティングすると、イムノアッセイのために培養液に戻すか、溶解し、トランスクリプトミクスやプロテオミクスなどのオミクス解析のために処理することができます。この技術により、私たちの研究室や他の人々は、DNA損傷、タンパク質発現、代謝の変化の定量化など、老化腫瘍細胞の新しい特徴を特定することができました。
