The authors thank G&#252;nter Oberd&#246;rster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

従来の組織学的染色、金属酸化物ナノ粒子の同定および分析を受けた組織サンプルはEDFM、HSIマッピング、及び画像解析技術の組み合わせによって達成することができるために。 、それはサンプルが最適な可視化のために5〜10ミクロンの厚さに区分されることが重要であり、組織学または免疫組織化学のための試料調製における柔軟性（汚れの種類例えば 、固定または凍結組織を用いた）がありますが。ここで使用されるサンプルは、ヘマトキシリン​​およびエオシンで染色し、カバーガラスを、ガラス顕微鏡スライド上に取り付けられた、ホルマリン固定およびパラフィン包埋の前6μmの厚さにロータリーミクロトームで切片にしました。 ex vivoでの皮膚浸透毒性コラボレーションからブタの皮膚組織をこの研究に使用しました。組織は、水性懸濁液中の金属酸化物ナノ粒子（アルミナ、シリカ、セリア）に曝露しました。関心領域（複数可）の検出（高コントラストelemeNTS）EDFMとその後のHSIマッピングおよび分析を容易に重要な最初のステップです。陽性および陰性対照サンプルを画像化し、参照用スペクトルライブラリを作成するために最初に分析しなければなりません。陽性対照から収集されたスペクトルは、正の対照スペクトルライブラリに輸出されています。その後、負の対照画像からすべてのスペクトルは、特異性を改善するために、陽性対照のスペクトルライブラリから減算される（偽陽性を減少させます）。得られた濾過したスペクトルのライブラリーは、目的の物質の分析に役立つRSLと見なされます。すべての組織サンプルは、同じ撮像処理を受け、RSLに対してマッピングされます。結果の画像は、黒の背景の上に興味の要素を持つ領域のみが含まれます。この画像は、視野当たりのマッピングされた粒子の面積を求めるために、その閾値と粒子解析関数を使用してImageJを用いて分析することができます。 ImageJのから得られた数値データをエクスポートすることができますさらなる分析のためにスプレッドシートにエド。 それは、生物学的サンプルは、互いに本質的に異なっており、および染色方法はEDFMとHSIを介して可視化に影響を与えることができるように、露出設定は、サンプルの特定のタイプに最適な高コントラスト画像を生成するものに応じて決定されるべきであることを考慮することが重要です。偽陽性の低減は、スペクトルライブラリーのろ過によって達成することができるが、この汚染に対応するスペクトルが潜在的に陽性対照のスペクトルライブラリから濾過することができるように、それは、興味の要素による汚染を回避している信頼性のネガティブコントロールを得ることが重要です、偽陰性率が増加します。 SPを生成蓄積した粒子数の多いエリア：また、ハイパースペクトルイメージングソフトウェアで検出可能であるスペクトル強度の範囲は、特定のソフトウェア（この研究のために、それは16,000単位である）の上限を超えることはできません強度限界を超えるectral強度が偽陰性の数を増加させる危険性に起因し、スペクトルライブラリの外に残っています。 HSIシステムは、従来の方法に比べて多くの利点を与える一方で、考慮すべきいくつかの欠点と制限があります。一つは、収集した光大量のデータが実質的な計算能力を必要とするかもしれないということです。もう一つは、基準スペクトルのライブラリが作成されているときHSIは、特に初期段階で、時間がかかることができるということです。また、撮像時間は、単純な暗視野像よりも、それが遅くなって、画像キャプチャごとに数分かかることがあります。しかしながら、それは依然として電子顕微鏡でサンプル調製および可視化を行うよりも高速です。さらに、複雑なシステムは、高度に専門的なコントロールの開発を必要とする複数の特性スペクトル、をもたらし、26難しい標準化、ユニバーサルリファレンスライブラリの確立を行うことができます。最後に、ハイテク個々の原子を解決することができ、このような原子間力顕微鏡や透過型電子顕微鏡などのプローブ - 又は電子顕微鏡技術は、より低い解像度でnique結果。この技術の分解能が原因で、ナノメートルレベルまたは正確にサブミクロンレベルでの材料を配置するための粒子サイズを測定するための高精度なツールであることから、それを防止するその光の性質が、これらに限定されます。技術は、特定の組織区画または細胞小器官内（例えば、細胞核など）1μm以上の粒子を特定することができるかもしれないが、小さい細胞小器官または特徴は、この方法で正確に視覚化するために挑戦しています。また、その空間分解能与えられたノートの、この方法は、単一のナノ粒子と凝集体11を区別することはできません。 その他の考慮事項は次のとおりです（例えば貴金属など）特定の材料は、非常に高い反射率と異なるスペクトルのプロファイルを持つ、ANALYにそれらを容易にすることができますZEこのツールを使用して、スペクトルマップ。このような半金属のこの研究で調査酸化物と炭素系ナノ材料24、27、などの他のものは、それらの元素組成、形状により困難であること、およびマトリックスに依存することができます。マーサーによってら二つのマウス吸入試験では、本研究で用いたものと同様のシステムは、肺内および周囲組織との著しく高いコントラストに基づいて、二次臓器にカーボンナノチューブを配置するために使用しました。炭素繊維のユニークな形状は、識別のための十分な特性だったのでしかし、ハイパースペクトルマッピングは、いずれの試験ではそう実証されていません。通常の生物物理学的プロセスを経て特定の臓器への関心のナノ粒子を堆積する（多くの場合、自身の研究の対象）予測不可能であるため、該当するポジティブコントロールの決意が困難であることができ、制御メートルのどの世代の配慮が必要です。もう1つの考慮事項は、組織に特異的に関連します興味のある材料の状態に影響を与えるIGHT。スペクトルライブラリが関心の自然のままのナノ粒子から作成されている場合、それが原因で変更することにより、 例えば粒子（の変化に起因するスペクトルの変化に組織または細胞におけるこれらの同じナノ粒子にライブラリをマップすることが困難な場合がありますpHは、溶解、凝集、結合タンパク質）および全体的な微小環境または行列。最後に、技術は、その半定量的性質に制限される：それは、それが容易にそのような材料の全器官の負担を特徴付けるなどのタスクを実行するために使用することができないことを意味同様の解像度の他の二次元顕微鏡技術のように定量することができます。 全体的に、EDFMとHSIは、TEM、HAADFやDICなどの従来のナノ材料のイメージングと特性評価技術、いくつかの利点を提供します。 EDFM / HSIはより集中Convenとに比べて時間とコストを節約するより高速画像収集と分析を可能にします的な技術。さらに、EDFM / HSIための試料調製は、時間を節約し、また、それは、他の技術のために使用することができるので、与えられたサンプルのより柔軟な分析を可能にする、一般的に最小で非破壊の両方です。さらに、HSIは、多くの組成物のナノスケール物質の分析のためおよびマトリックスの様々な可能、汎用性があります。研究チームは、技術の特異性の詳細な評価を含め、他の材料とサンプルタイプのためにここに記載された方法を改善するために取り組んでいます。研究チームによる調査の下で重要な次のステップは、目的の材料や組織タイプのための伝統的な金の基準に対するこれらの技術の検証（例えば、ラマン、TEM、SEM）です。

ナノ材料は、ますます産業や様々な用途で使用されているように、このような電子顕微鏡のような伝統的な様式、より多くの、手頃な価格の迅速、かつ便利なナノスケール画像化および特徴付けの方法が必要です。細胞、組織、および生物系でナノ粒子（NP）の相互作用を可視化するために、多くの光学技術は、微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡1と、このような全反射（TIR）又は近などのエバネセント場ベースのアプローチを含め、使用されていますフィールド走査光学顕微鏡（NSOM）2,3。しかし、これらはほとんどの非専門家のラボ4の手の届かないところに、ハイエンドの分析手法です。透過型電子顕微鏡（TEM）などの電子顕微鏡は、また、細胞5,6,7,8-とNPの相互作用を研究するために使用されています。高角度環状暗視野（HAADF）走査型透過電子顕微鏡は、NPの相互作用を研究するために使用されていますウイルス9と。共焦点顕微鏡は、NP-細胞の相互作用10を研究するために使用される別の人気の技術です。 近年では、暗視野ベースのハイパースペクトルイメージング（HSI）技術は、生物学的マトリックス11内のNPを研究するための有望な分析ツールとして使用されてきました。 HSIシステムは、超立方体またはデータキューブ12として知られている空間およびスペクトルデータの三次元表現を生成します。スペクトル変化の空間的なマップは、材料識別のために使用されます。既知の物質のスペクトルプロファイルを生成し、未知試料との比較のための参照ライブラリとして使用することができます。 HSIシステムの主な利点の一つは、それによって、知られており、同様の組成物の別の基準粒子にそれらをリンクするだけでなく、 インビボまたはエクスビボでの位置及び未知のNPの分布を確立する分光法とイメージングを結合する能力、です。 のいくつかの利点があります従来の撮像技術よりHSIシステムを使用して：最小限のサンプル調製が必要です。試料調製は、本質的に、典型的には非破壊的です。画像収集と分析が高速です。技術は費用対効果の高い13です。そして、混合された組成物および/ ​​または複雑なマトリックス中の化合物の空間分布及び分析がより容易に達成される14。 貴重なサンプルを含むナノ材料の研究のために、最も重要な検討事項の一つは、潜在的に繰り返して1つ以上の方法により試料を検査することを可能にする非破壊イメージング法の利用可能性です。反復または複数の分析は、単一のメソッドから利用できないでしょう包括的なデータセットを開発することが望まれます。この点には、その光学的性質を研究することは、サンプルを分析するための最も安全な方法です。強化された暗視野顕微鏡（EDFM）とHSIシステムを使用することにより、試料の光学応答を研究するために - すなわちリフレctanceだけでなく、吸光度と透過率-特徴識別および特徴付けは、15を行うことができます。潜在的な特性評価のエンドポイントは、相対的な大きさや形状のナノ粒子または凝集体のサンプル中のナノ粒子の分布の評価が含まれます。 本稿では、スペクトルアングルマッパー（SAM）と呼ばれるピクセルのスペクトルマッチアルゴリズムに基づいて、HSIシステムを使用して、死後組織中の金属酸化物ナノ粒子のために特別にマッピング方法を説明します。それは動物モデルは工業ナノ材料への曝露の健康への影響を評価するために使用される生体 nanotoxicology調査で 、現在および将来を補完する可能性があるので、私たちは、この特定のアプリケーションを選択しました。この方法の適用はまた、組織または動物モデルを利用したナノスケールの薬物送達研究を知らせることができます。 Oを通して、特に、ナノ粒子の吸収、分布、代謝、および排泄rgansや組織は、このシステムで調査することができます。多種多様なアプリケーションには、生物医学研究11で使用するために検討されています。 この方法は、元素組成16-19の種々のナノ粒子に曝露されている（例えば、種々の組織型、気管支肺胞洗浄試料、血液塗抹標本など）異なる生物学的試料の評価のために利用することができます。さらに、この方法は、 インビボおよびナノスケールの薬物送達研究のために適切である11 インビトロでのナノ粒子の生体内分布の研究に有用です。生物学的試料を越えて、EDFMとHSIは、廃水20のような環境試料中のナノ粒子を評価するために使用することができます。これは、ナノ粒子の侵入を防止するのに個人用保護具の有効性を評価するために使用することができるので、職業暴露評価は、同様にこの技術を使用することによって容易にすることができます。さらに、研究テ午前は、現在、職業暴露評価から集めたナノ粒子のフィルター媒体サンプルの評価のための同様のEDFMとHSIプロトコルを開発しています。 EDFMとHSIのためのこれらの種々のサンプルタイプの製剤は変化し得るが、それは彼らが容易に光学系によって視覚化することができるような方法で製造されることが重要です。それは従来の明視野顕微鏡を介して可視化されることになるかのように一般的に、サンプルを用意する必要があります。 11市販のいくつかのハイパースペクトルイメージングシステムがあります。

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CytoViva 150 Unit (condenser)</td>
			<td>CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>mounted to Olympus BX43 microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>for use with CytoViva 150 Unit condenser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>enhanced darkfield camera and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software</td>
			<td>obtained through CytoViva (Auburn, AL)</td>
			<td></td>
			<td>hyperspectral camera and software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides)</td>
			<td>Schott NEXTERION</td>
			<td>1025087</td>
			<td>reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x&#160; 1.45mm)</td>
			<td>Schott NEXTERION</td>
			<td>custom</td>
			<td>reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>type A microscopy immersion oil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12368B</td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol in water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>free open-source software online download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>metal oxide nanoparticles</td>
			<td>supplied to the research team by industrial partners</td>
			<td></td>
			<td>alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of metal oxide nanoparticles in histological samples by enhanced darkfield microscopy and hyperspectral mapping

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.

ハイパースペクトル顕微鏡は、分光光度法と同様の方法で物質を同定する能力のために有用です。 図1に示されるように、各材料は、いくつかの特徴的なスペクトル及びユニークで、その反射率の全体的な形状を有しています。また、 図1は、スペクトルプロファイルのマトリックス依存性を示す図である：組織学的組織サンプル中の3つの金属酸化物のそれぞれ（上のパネル）のスペクトルプロファイルは、水性懸濁液中で3つの金属酸化物の各々についてスペクトルプロファイル（異なります下のパネル）。同じマトリックス中に未知の試料の特徴的なスペクトルプロファイルをマッピングすることによって、この技術は、材料の有無を決定するために有用であり、また、半定量的サンプル中の物質の相対量を比較することができます。 陽性対照皮膚サンプルから作成した基準スペクトルライブラリーは実験的にマッピングするために適切です皮膚サンプル。 図2に見られるように、基準スペクトルのライブラリは、対応する陽性対照にうまくマッピングし、対応する負のコントロールにマップされません。 技術の最も重要な利点は、試料中の目的の物質の低いレベルを検出するため、ならびに汚染物質と区別するために、その能力です。例えば、個々のナノチューブ20〜30グラムのラット25で40μgのほど低用量の吸入の間に肺に観察することができる。図3は、組織学的皮膚サンプルでこれを示しています。いくつかの粒子は、暗視野光学像で容易に明らかであるが（コラム2）他のものは明視野顕微鏡（カラム1）、または他の方法を使用して、見逃されている可能性があり、ハイパースペクトルイメージング（列3）を用いて検出されます。暗視野HSIの使用はまた、単純な明視野顕微鏡上の特異性を改善するのに役立ちます。これらの画像は、その後、n分析のより定量的な形態を受けることができますImageJの経由otably粒子分析。 強化された暗視野顕微鏡でもハイパースペクトルイメージングの非存在下では、いくつかの異なる用途を有します。最初は、高品質、高コントラストの画像を生成する能力です。これは、最もよくする目的の粒子は、それらの明視野の対応と比較して容易に識別され、 図3に示されています。ハイパースペクトルマッピングが存在しない場合には、注意が関心のある粒子からの汚染物質の粒子を混乱を避けるために必要があるが、これらの画像はまた、定量的な粒子分析を受けることができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig1.jpg" /> スペクトルライブラリ（懸濁液中のナノ粒子）に比べて、図1の参照スペクトルライブラリ（組織マトリックス）。この図はナンから基準スペクトルライブラリーを生成することの重要性を実証します実験試料と同じマトリックスに関心のomaterials。最初の行は、この研究（アルミナ、シリカ、セリア）の各材料のための参照スペクトルライブラリ（RSL）を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> このRSLは、陽性対照組織サンプルは、陰性対照組織サンプルに対して濾過したこのプロトコールに記載の方法によって作成されました。 2行目は、スライドガラス上の液体懸濁液中の関心のナノ粒子から作成されたスペクトルライブラリ（SL）を示しています。より多くの湾曲の少ない独特のピークはシリカの周りを600でアルミナNPサスペンションSLで見られたのに対し、アルミナの場合は、500と650の波長における二峰性ピークは、RSLで発見された、周りの650の波長でピークがありましたより多くの湾曲の少ない独特のピークはarouでシリカNPサスペンションSLで見られたのに対し、RSLに存在します少ない独特のピークが周りの560でセリアNPサスペンションSLで見られたのに対し、NDセリアの場合600は、二峰性のピークは、RSLに520と620の波長で発見されたこれは、NPのが埋め込まれたマトリックスが作成されますことを示唆していますなどの特定の実験のためのSLを作成するためのコントロールを選択するときに、かなりのことができるスペクトルのシフト。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig2.jpg" /> 図2の参照スペクトルライブラリ（組織マトリックス）を陽性対照および陰性対照ブタ皮膚組織にマッピング 。各RSL（左の列）は、その対応する陽性対照（中央の列）にもマッピングし、それに対応するネガティブコントロール（右列）にマッピングされていないという点で、この図は、実験試料へのマッピングに適したとしてのRSLの確認として機能し<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig2large.jpg" target="_blank">てください。時間をクリックします</a>この図の拡大版を表示するには、ERE。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53317/53317fig3.jpg" /> 金属酸化物ナノ粒子にさらされる実験ブタ皮膚組織の図3ハイパースペクトルマッピング 。それぞれ、表皮、真皮、皮下組織、：上から下への行は、表層から最も深い層に皮膚の異なる層に対応しています。最初の行は、懸濁液中のアルミナのNPに曝露された皮膚試料の表皮の角質層を示す図です。 2行目は、懸濁液中のシリカのNPに曝露しました。 3行目は、懸濁液中でのNPをセリアします。各列は、異なる技術を用いて画像化皮膚の同じ領域を示しています。強化された暗視野顕微鏡（EDFで、最初の列は、明視野顕微鏡赤い四角で囲まれた領域が拡大された（40X MAG;スケールバー=50μm）を、（スケールバー=10μmの100XのMAG）に対応白い矢印は、高コントラストのNPを指している第二カラム、中のM）。 3列目は同じ高コントラストのNP（白矢印）を示す、ハイパースペクトルカメラ（HSI）を得ました。 EDFMおよびHSI画像は、100Xの倍率で撮影しました。 =10μmのスケールバー。 4番目の列は、それぞれイエローの各アルミナのNPが緑で表示されている曝露群、赤中のシリカのNP、およびセリアのNPに対するそれぞれのRSLに対してマッピングされたHSI画像を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53317/53317fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping

Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

強化された暗視野顕微鏡とハイパースペクトルマッピングにより組織学的試料中の金属酸化物ナノ粒子の同定

Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.3K ビュー.  SUNY Polytechnic Institute, Colleges of Nanoscale Science and Engineering. Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.

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Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

生物工学

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

酸化鉄ナノ粒子との機能を有する磁性細菌Nanocelluloseの作製

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the target site while minimizing deleterious effects to off-target sites. Magnetic cell targeting is an efficient, safe, and straightforward delivery technique. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) are biodegradable, biocompatible, and can be endocytosed into cells to render them responsive to magnetic fields. The synthesis process involves creating magnetite (Fe3O4) nanoparticles followed by high-speed emulsification to form a poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) coating. The PLGA-magnetite SPIONs are approximately 120 nm in diameter including the approximately 10 nm diameter magnetite core. When placed in culture medium, SPIONs are naturally endocytosed by cells and stored as small clusters within cytoplasmic endosomes. These particles impart sufficient magnetic mass to the cells to allow for targeting within magnetic fields. Numerous cell sorting and targeting applications are enabled by rendering various cell types responsive to magnetic fields. SPIONs have a variety of other biomedical applications as well including use as a medical imaging contrast agent, targeted drug or gene delivery, diagnostic assays, and generation of local hyperthermia for tumor therapy or tissue soldering.

Targeted cell delivery is useful in a variety of biomedical applications. The goal of this protocol is to use superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION) to label cells and thereby enable magnetic cell targeting approaches for a high degree of control over cell delivery and localization.

細胞標識および超常磁性酸化鉄ナノ粒子とターゲティング

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

アテローム性動脈硬化症の高速検出のための酸化鉄ナノ粒子のマイクロ波駆動型の合成

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

水試料中の微量金属分析のためのダイポールアシスト固相抽出マイクロチップの作製

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

Production of Metal Nanoparticles by Pulsed Laser-ablation in Liquids: A Tool for Studying the Antibacterial Properties of Nanoparticles

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of medicine. In addition to efforts to identify novel small-molecule antimicrobial drugs, there has been great interest in the use of metal nanoparticles as coatings for medical devices, wound dressings, and consumer packaging, due to their antimicrobial properties. The wide variety of methods available for nanoparticle synthesis results in a broad spectrum of chemical and physical properties which can affect antibacterial efficacy. This manuscript describes the pulsed laser-ablation in liquids (PLAL) method to create nanoparticles. This approach allows for the fine tuning of nanoparticle size, composition, and stability using post-irradiation methods as well as the addition of surfactants or volume excluders. By controlling particle size and composition, a large range of physical and chemical properties of metal nanoparticles can be explored which may contribute to their antimicrobial efficacy thereby opening new avenues for antibacterial development.

The antimicrobial properties of metals such as copper and silver have been recognized for centuries. This protocol describes pulsed laser-ablation in liquids, a method of synthesizing metal nanoparticles that provides the ability to fine tune the properties of these nanoparticles to optimize their antimicrobial effects.

液体中のパルスレーザアブレーションによる金属ナノ粒子の生成：ナノ粒子の抗菌特性を調べるためのツール

The emergence of multidrug-resistant bacteria is a global clinical concern leading some to speculate about our return to a "pre-antibiotics" era of ...

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling molecules at low levels and damaging molecules at high levels. Accumulation of ROS in stressed plants can damage metabolites, enzymes, lipids, and DNA, causing a reduction of plant growth and yield. The ability of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) to catalytically scavenge ROS in vivo provides a unique tool to understand and bioengineer plant abiotic stress tolerance. Here, we present a protocol to synthesize and characterize poly (acrylic) acid coated nanoceria (PNC), interface the nanoparticles with plants via leaf lamina infiltration, and monitor their distribution and ROS scavenging in vivo using confocal microscopy. Current molecular tools for manipulating ROS accumulation in plants are limited to model species and require laborious transformation methods. This protocol for in vivo ROS scavenging has the potential to be applied to wild type plants with broad leaves and leaf structure like Arabidopsis thaliana.

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Here, we present a protocol for the synthesis and characterization of cerium oxide nanoparticles (nanoceria) for ROS (reactive oxygen species) scavenging in vivo, nanoceria imaging in plant tissues by confocal microscopy, and in vivo monitoring of nanoceria ROS scavenging by confocal microscopy.

植物活性酸素種体内はアニオン性セリウム酸化物ナノ粒子の触媒の清掃

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

Using Magnetometry to Monitor Cellular Incorporation and Subsequent Biodegradation of Chemically Synthetized Iron Oxide Nanoparticles

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized in cells and then left within. One challenge is to assess their fate in the intracellular environment with reliable and precise methodologies. Herein, we introduce the use of the vibrating sample magnetometer (VSM) to precisely quantify the integrity of magnetic nanoparticles within cells by measuring their magnetic moment. Stem cells are first labeled with two types of magnetic nanoparticles; the nanoparticles have the same core produced via a fast and efficient microwave-based nonaqueous sol gel synthesis and differ in their coating: the commonly used citric acid molecule is compared to polyacrylic acid. The formation of 3D cell-spheroids is then achieved via centrifugation and the magnetic moment of these spheroids is measured at different times with the VSM. The obtained moment is a direct fingerprint of the nanoparticles&#8217; integrity, with decreasing values indicative of a nanoparticle degradation. For both nanoparticles, the magnetic moment decreases over culture time revealing their biodegradation. A protective effect of the polyacrylic acid coating is also shown, when compared to citric acid.

Iron oxide nanoparticles are synthesized via a nonaqueous sol gel procedure and coated with anionic short molecules or polymer. The use of magnetometry for monitoring the incorporation and biotransformations of magnetic nanoparticles inside human stem cells is demonstrated using a vibrating sample magnetometer (VSM).

磁気測定を用いて細胞の組み込みとそれに続く化学的合成酸化鉄ナノ粒子の生分解をモニタリングする

Magnetic nanoparticles, made of iron oxide, present a peculiar interest for a wide range of biomedical applications for which they are often internalized ...

High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning

Surgical margin analysis (SMA), an essential procedure to confirm the complete excision of cancerous tissue in tumor resection surgery, requires intraoperative diagnostic tools to avoid repeated surgeries due to a positive surgical margin. Recently, by taking the advantage of the high intrinsic optical absorption of DNA/RNA at 266 nm wavelength, ultraviolet photoacoustic microscopy (UV-PAM) has been developed to provide high-resolution histological images without labeling, showing great promise as an intraoperative tool for SMA. To enable the development of UV-PAM for SMA, here, a high-speed and open-top UV-PAM system is presented, which can be operated similarly to conventional optical microscopies. The UV-PAM system provides a high lateral resolution of 1.2 &#181;m, and a high imaging speed of 55 kHz A-line rate with one-axis galvanometer mirror scanning. Moreover, to ensure UV-PAM images can be easily interpreted by pathologists without additional training, the original grayscale UV-PAM images are virtually stained by a deep-learning algorithm to mimic the standard hematoxylin- and eosin-stained images, enabling training-free histological analysis. Mouse brain slice imaging is performed to demonstrate the high performance of the open-top UV-PAM system, illustrating its great potential for SMA applications.

A high-speed and open-top ultraviolet photoacoustic microscope that can provide histological images intraoperatively for surgical margin analysis is demonstrated, including the system configuration, optical alignment, sample preparation, and experimental procedures.