DIC顕微鏡は、複雑な環境下でのプラズモニックナノ粒子のイメージングにおいて、暗視野よりも優れています。しかし、DICは再現性のある結果を得るためにも、より多くの知識とスキルを必要とします。DIC顕微鏡は、高い横解像度と浅い被写界深度の両方を提供します。
これらの形質は、細胞内または複雑な環境でナノ粒子を監視する際に非常に重要です。まず、スクライビングペンを使用して、各ガラスカバースリップの中央に浅い短いスクラッチマークを配置し、付属のテキストプロトコルに記載されているようにガラスをきれいにします。次に、マイクロピペットを使用して、元の貯蔵容器から05ミリグラム/ミリリットルの金ナノ粒子溶液の100マイクロリットルを除去し、1.5ミリリットルの遠心分離管に溶液を排出します。
6,000倍の重力でサンプルを10分間遠心します。終了したら、ナノ粒子溶液から過剰な界面活性剤を取り除くために、マイクロピペットで上清を除去します。次に、遠心分離管に100マイクロリットルの超純水を加えます。
サンプルを簡単に渦巻いてペレットを分解し、その直後に20分間超音波処理し、ナノ粒子凝集体を完全に再懸濁させる。マイクロピペットを使用して、6マイクロリットルのナノ粒子溶液を洗浄および傷付きガラスカバースリップにドロップキャストします。その後、慎重にカバースリップを反転し、顕微鏡ガラスの2番目の大きな部分の上に置きます。
ドロップはすぐにガラスの2つの部分の間に均等に広がるはずです。ガラスの2つの部分の間に閉じ込められた気泡を取得しないように注意してください。マニキュアの狭いラインを使用して、カバースリップの端を密封して液体の蒸発を防ぎます。
サンプルを顕微鏡のステージに置き、顕微鏡の目的と凝縮器を揃えます。焦点を合わせてサンプルが置いた焦点面を見つけ、先ほど作成したスクラッチマークを見つけます。それに焦点を当て、ナノ粒子が見えるまで焦点を微調整します。
凝縮器の正確な配置を決定するには、20xの目標から始めて、80または100xのような高倍率に移動することによって、コーラー照明法を利用する。次に、イメージング用サンプル内の対象領域を選択します。カメラの視野で領域を中央に配置し、必要に応じてフォーカスを調整します。
顕微鏡がデ・セナーモンの設計を持っている場合は、最大バックグラウンド絶滅に近い偏光子セットから始め、徐々に偏光子を回転させて背景絶滅の減少に向けて回転させます。背景の強度は徐々に増加します。理想的な設定は、ナノ粒子が局所的なバックグラウンド平均と比較して最大の強度差に達したときに達成される。
プラズモニックナノ粒子の場合、最大のコントラストは、通常、最大バックグラウンド絶滅の時点または近く比較的暗い背景で達成される。ルーム照明をオフにして、工程との相互作用を防ぎます。対象領域を表示するために、中心波長を主局面プラズモン共鳴波長と共存する半最大バンドパスフィルターに10ナノメートルの全幅を配置します。
次に、バックグラウンドレベルがカメラの最大容量レベルの5%から40%になるまでランプの強度または露出時間を調整します。対象領域内のオブジェクトは、カメラの最大強度レベルの 90% を超える信号強度を示す必要があります。それぞれが最大10ナノメートルの半幅で全幅を持ち、全体として関心のある波長範囲全体にわたってイメージングを可能にする一連のバンドパスフィルタでサンプルを画像化します。
光の電力ではなく露光時間を調整して、画像の背景の強度が互いの 5% 以内に残っていることを確認します。フィルターを切り替えた後、画像をキャプチャする前にサンプルの焦点を合わせ直します。すべての関連情報を保持するために、画像を非圧縮のTIFFファイルまたはソフトウェアのネイティブファイル形式で保存します。
解析を開始するには、ImageJ で画像を開きます。四角形ツールを使用して、対象となるメイン領域の周囲に四角形を描画します。次に、ツールバーで画像を選択し、ズームに移動して選択します。
イメージングウィンドウが選択した領域を拡大表示します。次に、画像を選択し、調整に移動し、明るさ/コントラストを選択します。サンプル領域の表示を改善するには、画像の最小値、最大値、明るさ、およびコントラストを調整します。
これらの調整は科学的データを変更せず、単にサンプル領域のより良い可視性を可能にします。ここで、長方形ツールをもう一度使用し、測定する最初のナノ粒子の周りにボックスを描画します。ボックスは、ナノ粒子の風通しの良いディスクよりもわずかに大きくする必要があります。
選択したら、分析に移動し、メジャーを選択します。新しいウィンドウが表示され、選択したボックス内にあるピクセルの最小、最大、平均の強度が報告されます。ボックスの元のサイズを保持し、背景のコントラストが比較的均等で、パーティクルや汚染物質が存在しないパーティクルのすぐ隣の領域にボックスをドラッグします。
メジャー ツールをもう一度使用して、バックグラウンド領域の平均強度を決定します。シリーズ内のすべてのイメージの各パーティクルに対してこの手順を繰り返します。次に、データをスプレッドシートにエクスポートして、すべての波長と角度にわたる各パーティクルのコントラストまたは強度を計算します。
各パーティクルのコントラストを計算するには、次の式を入力します。最後に、X軸に沿った波長とY軸に沿ったコントラストまたは強度を持つデータをプロットして、所定のナノ粒子位置のスペクトルプロファイルをグラフ化します。最適なイメージング設定を決定するために、これらの金ナノスフィアをいくつかの偏光子設定でイメージングした。
ゼロ度では、パーティクルはほとんど白く表示され、中央部を横切って暗いストライプが走ります。これは、ナノスフィアサンプルのクロス偏光を示しています。偏光子を異なる角度に回転させると、パーティクルは 1 つのコーナーに向かって暗い影を投影します。
ただし、パーティクルのコントラスト値は劇的に変化します。このサンプルでは、最適なイメージング設定は偏光子シフトが10度です。ここで、波長は金ナノスフェアの対比に対してプロットされる。
各データポイントは、各粒子径の平均20ナノ球を表します。各パーティクルのピークコントラストは、そのサイズに応じてわずかに変化します。この金ナノロッドのような異方性の形では、強度と回転がさらに重要になります。
ここで波長は、2つの異なる偏光子設定で強度に対してプロットされます。いずれの場合も、明るい側の強度は暗い側よりもはるかに強いです。ステージの回転中の局在表面プラズモン共鳴波長における単一の金ナノロッドの強度プロファイルは、試料が180度回転する際に暗い面と明るい面の間に大きな強度差を示す。
サンプルイメージングは非常に重要です。それは顕微鏡の部分に勤勉さと忍耐の両方を必要とします。一連の日にサンプルを再イメージングする必要がある実験を実行する場合、スクラッチマークなどのランドマークは、関心のある地域を再配置する上で重要です。
DIC顕微鏡は、特に動的および細胞環境において、ナノ粒子を研究する研究者によって関心が高まっています。DICは、特に複雑なサンプリング環境において、最適な空間分解能を提供するからです。
