Name: establishment of genome-edited human pluripotent stem cell lines: from targeting to isolation
Uploaded: 2016-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
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この作品は、ヘレンBateupに脳研究財団のシード・グラント（BRFSG-2014から02）によってサポートされていました。ディルクHockemeyerは、エリソン医学財団のエイジングの新学者で、グレン財団だけでなく、ザ・Shurlとケイクルチ財団によってサポートされています。 DHはまた、NIHの助成金1R01CA196884-01によってサポートされています。

この原稿に記載された手順を見直し、カリフォルニア大学バークレー校の幹細胞研究監視委員会によって承認されました。 1.編集するための幹細胞を準備します<ol><li>成長し、マイトマイシンC不活性化マウス胚性線維芽細胞の2.4×10 6細胞 /プレートを含む6ウェルプレート上での培養ヒト多能性幹細胞（hPSCs）（MEF）フィーダーは、ゼラチン32上に成長させました。ウェルあたりヒト胚性幹細胞培地（hESC媒体）3mlにhPSCsを維持し、37で成長 3％O 2/5％CO 2で℃のインキュベーター。 注意：このプロトコルの成功のためには、低酸素培養器でhPSCsを維持する必要はありません。しかし、それは時間と細胞数がそれに応じて調整する必要がありますので、hPSCsは、高O 2の環境でより速く増殖することに留意することが重要です。それはまた、低酸素に維持hPSCs自発分化33の下側速度を有することに留意すべきです。 <ol><li> TO 500ミリリットルのhESCメディアは380ミリリットルのDMEM / F12、75ミリリットルウシ胎児血清（FBS）を組み合わせて行い、25ミリリットルノックアウト血清代替（KSR）。グルタミン（1mMの最終濃度）を、5 mlの100×非必須アミノ酸、100単位/ mlのペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）（4 ngの/ mlの最終濃度）、および2-加えますメルカプトエタノール（5.5μMの最終濃度）。 </li></ol></li><li>ガラスピペット、真空を使用してメディアの全容量（3 ml）を除去することにより、メディアを変更します。 3ミリリットル暖かいhESC媒体が血清学的ピペットを使用して交換してください。 hPSCsが約50％コンフルエント（1日目）になるまで繰り返したメディアは毎日変更されます。 </li><li> 1日（1日目）を標的とする前に、古い培地を除去し、10μMのY-27632を補足した温かみのhESCのメディアを追加し、hESCのメディアを変更します。 </li><li>また、1日目に、DR4マウス（2.4×10 6細胞 /プレート）34から薬剤耐性MEFフィーダー細胞の2個の6ウェルまたは10センチメートルプレートに1を準備します。 注意：一般的には、6ウェルプレートは、広告されています彼らは多くのメディアに対応するように、10cmプレートの上にvantageous。 6ウェルプレートは、異なるウ​​ェルからの異なるクローンが独立していることを確認してください。しかし、10cmのプレートは、このプロセスのために利用可能な顕微鏡に応じて、簡単にピッキングを可能にします。 </li></ol> 2.編集多能性幹細胞<ol><li> 1.5mlチューブにCRISPR / Cas9 px330エンコーディングプラスミド（ 図1）のZFN 1と2、TALEN 1および2、または15μgの5μgの各ピペッティングし、トランスフェクション溶液を調製します。このチューブに修理プラスミドのピペット30μgのにも。最後に、チューブにピペット1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を300μlに音量を表示します。 注：300μlの下のトランスフェクション溶液の全容積を維持するために、300 ngの/μLの最小濃度で（任意のキットが適しています）ミディプレップとしてプラスミドを準備します。これは、プラスミドを線形化するために、フェノール/クロロホルム抽出を行う必要がない場合、またはendotoを使用することXIN無料プラスミドプレップキット。 </li><li>ガラスピペット、真空を使用してhPSCsからメディアを取り出します。細胞を洗浄するために、各ウェルにピペット2ミリリットル暖かい1×PBS。 </li><li>ガラスピペット、真空を使用してすぐに、PBSを削除します。各ウェル中の細胞に直接0.5 mlの0.25％トリプシン-EDTA溶液を加えます。インキュベーターに入れ、約10分間（37℃/ 5％CO 2/3％O 2）。またはフィーダー層まで、プレートを持ち上げを開始します。 </li><li>トリプシン反応を停止し、各ウェルに2ミリリットル暖かいesWashメディア（470ミリリットルDMEM / F12、25ミリリットルのFBS、100単位/ mlのP / S）を追加します。 </li><li>フィーダー細胞がシートとして外れていることを確認してください。全てのウェルを組み合わせ、十分に単50 mlのコニカルチューブにそれぞれの内容をピペット。 10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて粉砕物の細胞。これは、フィーダー層を破壊する必要はありません。 hPSCsは穏やかな粉砕により、フィーダー層の外れます。細胞懸濁液の約15ミリリットルがあるはずです。 </li><li> voluを持って来るためにチューブにesWashメディアの25ミリリットルを追加します。私は最大40 mlの全。大きなフィーダーチャンクが1〜2分間、チューブの底に沈降することを許可します。新しい50mlコニカルチューブに血清用ピペットと預金を使用してチューブから上清（〜38ミリリットル）を取り外します。 </li><li> 190×gで5分間スピンダウン。ガラスピペットと真空を用いてチューブから上清を取り除きます。細胞ペレットを乱さないようにしてください。 500μlの1×PBSで細胞を再懸濁します。以前調製したプラスミドのトランスフェクション溶液を用いて結合します。この段階で細胞をカウントします。エレクトロポレーションにつき5から10000000細胞を使用してください。 </li><li> 、4ミリメートルのエレクトロポレーションキュベットに全体800μlの懸濁物をピペットで3〜5分間氷上に置きます。 250 V、500μF、∞抵抗、および4ミリメートルキュベットサイズ：次のパラメータを使用してエレクトロポレーションシステムの指数関数プログラムを使用して電気穿孔細胞。エレクトロポレーション後、3分間バック氷上のキュベットを配置します。 注：エレクトロポレーションシステムにエレクトロポレーションの時定数を観察します。時定数細胞数及びDNAの純度に応じて変化します。記載された条件および遺伝子パルサーIIを使用した場合のトランスフェクションの成功は、通常、10〜14ミリ秒の時間定数を有します。時定数は、これらの値から変化した場合より低いエレクトロポレーション効率が発生する可能性があります。 </li><li>暖かいhESCのメディアは、10μMのY-27632を補足した18ミリリットル中にエレクトロポレーションした細胞を再懸濁します。プレート3 DR4フィーダー細胞との6ウェルプレートの各ウェルに、この単一細胞懸濁液1ml。インキュベーター（37℃/ 5％CO 2/3％O 2）に戻ります。 </li></ol>陽性コロニーの3選択<ol><li> 2日目、ガラスピペットと真空を使用してすべてのメディアを削除します。 10μMのY-27632を補足した温かみのhESC媒体3mlのと交換してください。 3日目、ガラスピペットと真空を使用してすべてのメディアを削除します。 Y-27632を含まない温かいhESC媒体3mlのと交換してください。 4日目、ガラスピペットと真空を使用してすべてのメディアを削除します。 3mlでのSelectIための抗生物質を補充した温かみのhESCのメディアを交換してくださいに。インキュベーター（37℃/ 5％CO 2/3％O 2）に戻ります。 注意：使用する抗生物質の種類は、カセットが修理テンプレートに含ま抵抗に依存します。 WIBR＃3 hPSCs（NIHレジストリ0079）、0.5 / mlのピ​​ューロマイシン、70μgの/ mlのG418（ジェネティシン）、および35 / mlのハイグロマイシンを操作する場合は正常に使用されてきました。選択のための濃度は、約1週間以内に野生型細胞を死滅させるのに必要な抗生物質の最小濃度を確立することによって経験的に決定されるべきです。 </li><li>日5-12、変化媒体毎日、抗生物質を補充した温かみのhESC媒体で古いメディアを毎回交換します。 注：細胞死を大量に期待しています。個々のコロニーを、8~10日の周りに明らかになるであろう。抗生物質を含まない正規のhESC媒体は、連続選択の12-14日後に使用することができます。細胞密度が高い場合、または細胞死が遅い場合には、培地の酸性化は避けるべきであり、それはメディアvo​​luを増加させる必要があるかもしれません私（4〜5ミリリットルまで）選択の最初の数日間。 </li></ol> 4.ピッキング選択したコロニー（日12-14） <ol><li>日12〜14のコロニーを観察します。解剖顕微鏡で選び、それらが分化し始めている細胞が含まれていないことを確実にするために準備ができているコロニーを観察します。おおよそのサイズは、800-1,200μMでなければなりません。コロニーは12日前にこのサイズに達すると、それは彼らが次に選んだすることをお勧めします。 注：各ターゲット実験では、目的の遺伝子型が分離されていることを確認するために必要な数のコロニーを選択します。例として、AAV-CAGGS-EGFP修理テンプレートとAAVS1編集は一貫して強固な統合が示されており、唯一の12〜24コロニーが約5〜10ヘテロ接合の標的クローンを得るために取りに行く必要がありました。他の標的の実験を採取するために多くのコロニー（ 表1）を必要とする場合があります。正しいターゲッティング事象の頻度は、SSの効率などの要因に依存しますDSB、インサートのサイズ、および選択戦略を導入するN。正しく適切に標的化クローンを得るために必要なコロニーの数を減少させる、標的部位に組み込まれたときにここに提示AAVS1遺伝子座の遺伝子トラップ法の場合には、選択マーカーは、発現されます。 </li><li>ピッキングの前に、MEFを12ウェルプレートを準備する1日（2.4×10 6細胞 /プレート、1つのウェルは、各コロニーのために使用されます選びました）。 </li><li>ピッキングの日に、ガラスピペットと真空を用いて12ウェルプレートにMEFからすべてのメディアを削除し、1ミリリットルのhESCのメディアと交換してください。またピッキングの日に、ピックアップしようとしている6ウェルプレート上のhESCのメディアを変更します。 </li><li>フィーダー層からの個々のコロニーを機械的に解離用ガラスピペットを引き出します。イン・フードブンゼンバーナーの上にピペットを下げ、ガラスが可鍛性になるまで展開点で軟化。すぐに炎から削除して、角度のポイントを作成離れてピペットを引き出します。ブレイク狭いチャネルを残して、曲がった軸から約2cmを指します。 1-2秒間炎に暴露することによって、チャネルの端部を磨きます。 注：鈍い先端は、潜在的に、その後の採集物を汚染する、メディアに各コロニーからの細胞のより多くの量を除去することができるよう必要に応じてコロニーをP20ピペットチップを選ぶが、これは、文化のクローン性を減少させることができます。 </li><li> P1000のフィルターピペットチップを取り、狭い端部に吸引電球を取り付けることによって、デバイスを選んで組み立てます。ワイド端に引っ張らガラスピペットを挿入します。 </li><li>組織培養フードに取り付けられた解剖顕微鏡のステージに選ばれるべきhPSCsの6ウェルプレートを置きます。ピッキング装置の電球を圧縮し、ゆっくりと10〜20の等しいサイズのピースに個々のコロニーを切除し、カット、メディアに作品をリリースしないように注意して。電球を解放することにより、ピペットにコロニーの切除したHPSC片を取ります。転送中にできるだけ少ないメディアを取るようにしてください。 </li><li> TRANSF12ウェルプレートMEFの1ウェルに、個々のコロニー、今壊れて植民地を解放し、ウェルに直接再び電球を圧縮えー。単一細胞由来のクローンの固有の識別を可能にするために、各ウェルにラベルを付けます。ガラスピペットを毎回変え、必要な数のコロニーを繰り返します。 注：ピッキングコロニーを学ぶのに時間がかかる場合があります。これは、対象となるコロニーを分離しようとする前にいくつかのコントロール細胞の実験の練習することをお勧めします。 </li><li>穏やかに、各ウェルの中央に細胞の蓄積を回避するために、第一プレートを揺動、インキュベーター（37℃/ 3％O 2/5％CO 2）で12ウェルプレートを返します。 </li><li>翌日とそれ以降の毎日は、ガラスピペット、真空を使用してメディアのフルボリュームを削除して、細胞が約50％コンフルエントになるまで温かいhESC媒体1.5mlのと交換してください（これは通常10〜12日かかります）。 </li><li> 10〜12日後、各ウェルから1〜2個のコロニーを選択し、再新しい12ウェルプレートに移すMEFpeatingは、レプリカプレートを生成するために、4.1から4.8を繰り返します。 </li><li>元のMEFプレートの各ウェルに残っているコロニーから（下記参照）のDNAを抽出します。 <ol><li>ガラスピペットと真空を使用して、すべてのウェルから培地を除去。ピペット1mlの細胞を洗浄し、各ウェルにPBSを1倍。ガラスピペット、真空を使用して、PBSを削除します。ピペット細胞溶解緩衝液250μlの（H 2 O中の最終濃度：10mMのトリスHCl、5mMのEDTA、0.2％SDS、200mMのNaCl、0.08 mg / mlのプロテイナーゼK）の各ウェルに。インキュベーターに入れ（37℃/ 3％O 2/5％CO 2）O / N。 </li><li>次の日、ピペットそれぞれの内容だけでなく、個々に1.5ミリリットルチューブ。ピペット各チューブにイソプロピルアルコール250μlのDNAを沈殿させました。精力的にチューブを振ります。白色の沈殿物が表示されるはずです。 </li><li>テーブルトップ遠心機で13,000 rpmで3分間、各チューブをスピンダウン。スピンダウンした後、液体廃棄物の中にデカントすることにより、上清を捨てます。小さなDNAペレットの底に付着したままにしておく必要がありチューブ。 DNAペレットを洗浄するために、各チューブに250μlの70％エタノールをピペット。勢いよく振ります。テーブルトップ遠心機で13,000 rpmで3分間、各チューブをスピンダウン。 </li><li>スピンダウンした後、液体廃棄物の中にデカントすることにより、上清を捨てます。小さなDNAペレットをチューブの底に付着したままにしてください。チューブ内に残された液体が存在しないので、上清の残りをピペット。 5〜10分間、ベンチトップ上で乾燥オープンチューブを残します。乾燥後、250μlのTE緩衝液中にDNAを再懸濁します。 DNAを溶解させるために6時間37℃で置きます。 </li></ol></li><li>あらかじめ最適化されたPCRまたはサザンブロット戦略を使用して、各サンプルを遺伝子型。 注意：AAVS1は、AAV-CAGGS-EGFP修理テンプレートを使用して標的とするため、サザンブロット戦略がら 、2009年4総合的なサザンブロット法プロトコルは、南部で見つけることができHockemeyerで見つけることができます2006年35のマルチプレックスPCRジェノタイピングのために。同じ実験を、プライマー及び条件がすることができます表2 36で見つかりました。 </li><li>適切に標的にされていない井戸を捨て、日々適切に標的細胞上のhESCのメディアを変更し続けています。彼らは約50％コンフルエントである場合、ダウン細胞凍結プロトコルを凍結については、以下を参照してください。 <ol><li>ある日、凍結前に、古い培地を除去し、10μMのY-27632を補足した温かみのhESCのメディアを追加し、hESCのメディアを変更します。 </li><li>凍結の日にある2つの15 mlのコニカルチューブにダウン凍結されている12ウェルプレートのウェル当たり、溶液Aと溶液Bの0.5 mlずつを準備します。氷の上でソリューションを配置します。溶液A：50％のhESCのメディアと、50％のFBS;溶液B：80％FBS、20％ジメチルスルホキシド（DMSO）。 </li><li>凍結前に、単一の細胞にHPSCコロニーを解離します。それに応じてボリュームをスケーリング、これを行うための手順2.2から2.8に従ってください。溶液Aを0.5mlで完全に再懸濁細胞ペレット</li><li>細胞懸濁液を均質にするために細胞懸濁液、上下ピペットに0.5ミリリットル溶液Bを追加します。タークE 2ミリリットルクライオチューブに細胞懸濁液（〜1ml）および預金の合計容量。しっかりとキャップをねじ込みます。 </li><li> -80℃の冷凍庫O / Nで置きクライオチューブ。凍結後の日は、-80℃の冷凍庫から凍結細胞を除去し、すぐに長期保存のために液体窒素タンクに置きます。 </li></ol></li></ol>

著者は全く競合する金融利益を宣言しません。

遺伝子編集されたヒト多能性幹細胞の均質な集団を単離するため、ここで提示された方法は、標的遺伝子座でのみ異なる同質遺伝子HPSC株を生成するための強力なアプローチです。これらの細胞は、ヒト細胞の分化および発生のメカニズムを探索するためだけでなく、制御の遺伝的環境の中で単一遺伝子疾患の病態生理を理解するための理想的なシステムです。ここで実証されるように、それはAAVS1遺伝子座での標的組込みを達成するために、3つの独立したSSNの設計戦略（ZFNは、TALENs、およびCRISPR / Cas9）を使用することが可能です。これらの方法のそれぞれが独自の長所と短所があります。電位のZFNの利点とは、ある程度、TALENsは個々ヌクレアーゼ42のDNA結合ドメインを改善するために、反復エンジニアリングを可能にするそれらの設計の柔軟性です。このヌクレアーゼの最適化は、CRIで達成可能であるものを超えてのZFNとTALENsの特異性を増加させることができますSPR / Cas9システム。このような選択性は、標的特異性の高い程度を必要とする臨床応用のために重要であり得ます。 CRISPR / Cas9システムの主な利点は、その使いやすさです。 TALENとZFNコンストラクションキットは、パブリック（ すなわち、Addgene〜21）が利用できるようにしてきたがpx330プラスミドを使用する場合にのみ必要なカスタマイズが20塩基対のオリゴヌクレオチド（あるとして、CRISPR / Cas9ベースのSSNは、構築する非常に容易ですデザイン14）。このシンプルさは、彼らの研​​究におけるゲノム編集を含めるように探している研究室のために有利であることがわかります。 遺伝子編集しHPSCラインを作成するためのヌクレオ43、などの代替トランスフェクション技術があります。しかし、エレクトロポレーションは、一貫して費用対効果4,5,25であることが示されています。ヌクレオはSSN効率ANの増加、直接核にCas9ガイドRNAのリボ核タンパク質複合体をトランスフェクトするために使用することができDの忠実度44。 MEFの上に成長hPSCsは、過剰な分化せずに多能性状態でhPSCsを維持するために、堅牢かつ安価な方法です。また、遺伝的に同一のコロニーの容易な単離を可能にします。あるいは、しかしながら、これらの培養条件は、フィーダベースの培養よりも高価になることができ、MEFのない培養hPSCsすることが可能です。さらに、全体のプロセスは非常にまれな編集イベントの単離または並列編集実験で多数の異なる細胞株の生成を可能にする、拡張可能です。 ここで説明するプロトコルは強固です。しかし、正しく編集したクローンを得ることができると効率に影響を与えるいくつかの重要なステップがあります。この方法のための最も重要なコンポーネントは、高品質のMEFと薬剤耐性のDR4のMEFをしています。単一hPSCsの生存が希薄で、低品質のMEFは未分化HPSCラインの分離を妨げます。第二に、Y-27632の使用でもあります異常な核型45を有する細胞に対して選択的な圧力を生成せずに、単一の細胞の生存を可能にするキー。第三に、十分な間隔コロニーを選ぶことは由来細胞株の遺伝的均質性を保証します。最後に、開口部は、複数のコロニーを新しいウェルに成長することを確認して、多くの小片にコロニーを破壊するのに十分に小さくなるようにガラスピペットを準備することが重要です。これは、遺伝子型決定のために単離したコロニーの原版を残し、文化の中で持っているレプリカプレートでよく間隔のサブクローンのピッキングが可能になります。このプロトコルで挑戦的な部分は、ガラスピペットの引き上げマニュアルです。これは、事前に実施されなければなりません。これは、ガラスピペットを必要としないクローンピッキングの複数の技術が存在することに留意すべきです。実験者は、彼らのために最も適したものを見つけるために奨励されています。 単純な修正によって克服することができるこのプロトコルには制限があります。 Oに意図された実験NLY編集された細胞を富化する別の方法を使用する必要があり、修理またはその修理テンプレート選択カセットを含まないものなしに関心の座を崩壊させます。陽性クローンを見つけるために選ばれなければならないコロニーの数は、選択の非存在下では大幅に増加することに注意してください。効率を改善する1つの戦略は、蛍光タンパク質を発現する非組み込みプラスミドを同時トランスフェクトすることです。細胞は2日間回復させた後、標的細胞は、蛍光活性化セルソーティングを使用して正の蛍光でソートし、29を再播種することができます。このプロセスは、エレクトロポレーションによりプラスミドでトランスフェクトされた細胞のために豊かにし、それによって細胞内での同時編集イベントの確率が高くなります。 ここに記載された技術は、同時に複数の遺伝子座14,46,47を標的とするために 、複数のガイドRNAを使用するように拡張することができます。多くのプロトコルは、hPSCsを区別するために設立されました異なる細胞型に、関心対象30の細胞型における種々の遺伝子操作を可能にします。全体的に、我々は関係なく、SSNの選択のhPSCsで効率的なゲノム編集の可能性を実証しました。我々は、この技術は、任意のゲノム遺伝子座での遺伝子編集された同質遺伝子HPSCラインを作成するように構成することができることを提案します。

ゲノム編集技術が急速に分子および細胞生物学の1のための標準的なツールに進化しています。 hPSCsは、遺伝的に無傷の初代ヒト細胞の自己再生ソースを表し、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）の遺伝子操作は、特に重要です。 hPSCsは、疾患のモデリングのための、または移植療法2,3のソースのような種々の細胞型に分化させることができます。ここでの実証は、AAVS1遺伝子座にレポーター構築物の標的組み込みのための内因性DNA修復機構に関連して、部位特異的ヌクレアーゼ（SSNの）の3つの異なるタイプを使用するプロトコルです。 hPSCsへのSSNのトランスフェクションの後、我々は、レポーターを保有する同質遺伝子の細胞集団を分離する方法を示します。 特に多能性細胞のゲノムを幹、ゲノムを操作する能力は、使用してのSSNは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNを）および転写activatのユーティリティなどの新しい現象ではありません遺伝子編集またはのようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）が数年前に4-10実証されました。しかし、S。ピオゲネスCRISPR / Cas9技術11-13の出現により、遺伝子編集は14広くアクセスできるようになりました。すべてのSSNは、非相同末端結合（NHEJ）または相同性向かう修理（HDR）15のいずれかを使用して、内因性の細胞メカニズムによって修復された特定の標的部位1,4,5,11で二本鎖DNA切断（DSB）を導入。 HDRは、SSNと修復鋳型の同時トランスフェクションを介して導入される新規な要素を可能にしながら、NHEJは、誤りがちであり、遺伝子機能の喪失をもたらすフレームシフト変異を導入することができます。遺伝子編集を促進するDNA修復の基本原理は、各SSNのために大部分が同じであると考えられている一方で、プラットフォーム間のいくつかの違いに注意することができます。のZFNのデノボ設計は柔軟性およびヌクレアーゼの最適化16、公にのが使用することができます個々のZFNを設計するために利用可能な組立ライブラリおよびスクリーニングツールは、時間がかかることがあります。 ZFN媒介性標的化のための所望の遺伝子座が決定されると、ZFN対は、オンラインツールZiFit 17を設計することができます。設計後、ZFNはモジュール式には、プラスミドクローニング18のいくつかのラウンドを通じて組み立てることができます。また、事前検証済みのZFN 19、市販の多くがあります。 TALEヌクレアーゼは、オンラインツールと公に利用可能なコンポーネント17,20を用いて設計することができます。例えば、TALENsは急速FLASHアセンブリ21またはPCRベースの階層的なゴールデンゲートアセンブリ 22 を使用してを通じて、5 TALEリピートのブロックから組み立てることができます。 SSNの設計およびCRISPR / Cas9を使用して、建設の速度やすさ、広くアクセス可能なツールを編集するゲノムをしました。ガイドRNAの多重化は単一の構築物14でいくつかの遺伝子座を標的とするようにするためのショートガイドRNAを媒介CRISPR / Cas9の標的化もできます。デザイン標的遺伝子座に近接し、遺伝子編集のためのCas9のprotospacer隣接モチーフ（S.用NGGトリヌクレオチドはCas9をpyrogenes PAM）の識別のみを必要とします。 px330プラスミド14にPAMの20塩基対の5 &#39;末端に対応するオリゴヌクレオチドを挿入することによって、構築物は、一のクローニング工程で組み立てることができます。 Sに加えて、 N.からピオゲネス Cas9、Cas9 5&#39;-NNNNGATT-3 &#39;（PAM）を認識し、 髄膜炎菌 （NmCas9）はhPSCs 23で効率的な遺伝子編集を可能にすることが示されています。 SSN設計の容易さの違いに加えて、各プラットフォームに固有の特性を有します。例えば、ZFNはとTALENsはCas9は主に平滑末端のDSBを生成すると考えられている間に4ヌクレオチドの5 &#39;オーバーハング24を発生させるのFokIヌクレアーゼドメインを利用します。 ZFNは、TALENs、およびCas9は、オンオフ率標的DNAに、それらのタンパク質の安定性に異なり、DNAスキャンのモードすべてがCの理論的には、編集結果1の小さな差が生じるウルド。さらなる研究は、完全にこれらの違いの影響を理解するために必要とされるが、ここではすべての3つのプラットフォーム間で非常に堅牢で、容易に遺伝的に改変されたhPSCsを生成するために使用できるプロトコルを記述する。 かかわらず、SSNの選択の、エレクトロポレーションは、hPSCs 25にSSNのと相同性の修理テンプレートをトランスフェクトする堅牢な手順です。抗生物質耐性のための選択後にコロニーの生存数は、遺伝子座特異的なパラメータと編集方針（トランスジェニック挿入と選択のモードの例えば、大きさ）に依存します。ここで説明するプロトコルは、通常、約150〜400単一細胞由来のコロニーを生じます。 このプロトコルを使用してAAVS1遺伝子座での遺伝子編集は、以前のSSN 4,5の有効性を実証するために使用されています。 AAV-CAGGS-EGFP修理テンプレートは、遺伝子トラップstrを使用しています遺伝子座特異的にピューロマイシン耐性を付与するategy。簡単に言えば、修理テンプレートは、プロモーターのピューロマイシン耐性カセットの上流のスプライスアクセプター部位を含みます。 AAVS1遺伝子座におけるPPP1R12C遺伝子の最初のイントロン中に正しい組込みに際して、耐性カセットを編集する遺伝子のプロモーターから発現されます。この特定のAAVS1アッセイの堅牢性は、私たちは各SSNプラットフォームの効率を比較することができます。 SSNのを用いた遺伝子編集は任意の遺伝子を破壊および/または理論的に変更する能力与えられた強力です。 hPSCsは、その後、このようなニューロン26,27を肝細胞、心筋細胞28のようなヒトの細胞型の多数に分化させることができるようにhPSCsにこの戦略を適用すると、汎用性を提供します。加えて、患者由来の誘導多能性幹細胞の使用は、患者固有の遺伝的背景29における修復または既知の疾患を引き起こす変異の導入を可能にします</sup&gt;、病気のメカニズムおよび患者自身のセル 30 を用いた試験治療を調査するためのプラットフォームを提供します。要約すると、hPSCsにおける遺伝子編集は人間開発や病気31の基本的な生物学を研究するための効率的で汎用性の高い手法です。

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (HI)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor - basic</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>12-well plates</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>4 mm Electroporation cuvettes</td><td>Bio-rad</td><td>165-2081</td><td></td></tr><tr><td>X-cel gene pulser II</td><td>Bio-rad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>10&amp;times; Phosphate buffered saline (PBS) pH7.4&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes, plugged</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5941</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Life Technologies</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>TX89125-172SFU</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol</td><td>VWR</td><td>MK303216</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>1.8 ml Cryotubes</td><td>ThermoScientific</td><td>377267</td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of genome-edited human pluripotent stem cell lines: from targeting to isolation

ヒト多能性幹細胞（hPSCs）のゲノム編集は人間開発​​を理解し、疾患の病態生理学を研究する、そこから遺伝的に制御され、臨床的に関連するプラットフォームを提供します。ゲノム編集のための部位特異的ヌクレアーゼ（のSSN）を採用することにより、それ以外の場合は同質遺伝子の設定で特定の遺伝子変異を保有する新しいHPSCラインの迅速な誘導が可能となります。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNは）、転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ（TALENs）とクラスタ化された定期的interspaced短い回文繰り返し（CRISPR）/ Cas9は、最も一般的に使用されるのSSNです。これらのヌクレアーゼのすべては、それによってゲノム遺伝子座で正確な遺伝子編集を促進する、指定されたサイトで、二本鎖DNA切断を導入することによって機能します。 SSN-瞑想ゲノム編集は、挿入/欠失変異を導入したり代替するか、細胞の内因性DNA修復機構、非相同末端結合（NHEJ）と相同性を向い修理（HDR）のうちの2つを利用します二重鎖切断部位での相同修理テンプレートを使用してゲノムえー。 hPSCsのエレクトロポレーションは、蛍光レポーターおよび抗生物質耐性カセットとして導入遺伝子を組み込むのSSNや修理テンプレートをトランスフェクションの効率的な手段です。エレクトロポレーション後に、抗生物質耐性のために選択することによって、修復構築物を組み込んだだけhPSCsを単離することが可能です。機械的にHPSCコロニーを分離し、ジェノタイピングを通じて標的部位での適切な統合を確認すると、正確に標的と遺伝的に均一な細胞株を単離することができます。このプロトコルの有効性は、ヒト多能性幹細胞におけるAAVS1セーフハーバー座に構築EGFPおよびピューロマイシン耐性を組み込むためにすべての3つのSSNのプラットフォームを利用して、ここで示されています。

ここでは、遺伝子工学的にHPSCラインを作成するには、3つの異なるSSNのプラットフォームと互換性のあるプロトコルを示しています。我々は、EGFPレポーターおよびピューロマイシン耐性カセット4を導入し 、修復テンプレートを使用してTALENs 5、以前に発表されたZFN 4を使用して AAVS1遺伝子座でWIBRの＃3ヒト胚性幹細胞を標的としCRISPR / Cas9s 37。 我々は、未分化hPSCsの維持・拡大を可能にする細胞培養ワークフロー（ 図2）のためのMEF上で私たちのhPSCsを培養し、それはまた、効果的かつスケーラブルなコストです。細胞が必要以上に成長している場合は、トランスフェクトされた多能性細胞の数及びその結果として得られる正しく標的HPSCのコロニーの数を減少させる、増加した分化の危険性があります。 我々はelectropSSNのプラットフォームあたり5.0×10 6個の細胞をoratedとDR4 MEFを、単一の6ウェルプレートに、各ターゲットから細胞を播種しました。選択後、各プラットフォームは、EGFP陽性コロニー（ 図3）と、非標的ホモターゲットとヘテロで対象となるクローン（;表3、図4A、B）の組み合わせとなりました。ここで紹介する条件の下で、我々はAAVS1 TALENsは、ほとんどのEGFP陽性クローンが得られたことがわかります。この実験に用いた補修テンプレートは、EGFPレポーターおよびピューロマイシン耐性カセットの上流のスプライス受容部位で構成されています。この「遺伝子トラップ」戦略（ 図1）を使用して 、構築物は、ピューロマイシン耐性カセットの発現を駆動するために、内因性プロモーターを用いて、AAVS1遺伝子座の最初のイントロンに挿入する必要があります。での発現を防止する必要があり、修理テンプレート内のピューロマイシン耐性遺伝子の発現を駆動するプロモーターの欠如<html>ランダム統合のイベント。 したがって、我々はすべてのピューロマイシン耐性クローンがAAVS1サイトで標的にすることを期待しています。それはではなく、ほとんどのPCR戦略（ 図1; 図4C）により、クローンのサブセットが内部プローブを用いたサザンブロットによって検出されているAAVS1遺伝子座における異常の統合を運ぶことに留意すべきである4。これらの統合イベントは、最も可能性の高いドナープラスミド4の倍数の統合につながる異種ターゲティング事象の結果です。私たちは、それぞれのSSNの実験から24個のコロニーを採取し、すべてのプラットフォームが非常に高いターゲティング効率を有しており、最小限の違いを示したことがわかりました。 PCRにより尋問のようTALENプラットフォームは、ほとんどのホモターゲットのクローン（ 表3）を有しながら、CRISPR / Cas9は最も正確に標的のクローンが得られました。 /files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg &quot;幅=&quot; 700 &quot;/&gt; 遺伝子の 図1 の回路図、AAV-CAGGS-EGFP修理テンプレートを使用してAAVS1遺伝子座を編集しました。Hockemeyer らから変更された。2009年<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" width="700" /> 図WIBR＃3セルの2コロニー。ターゲットの前にWIBR＃3ヒト胚性幹細胞のコロニーの代表的な明視野像。分化の欠如と非理想的なもの（右）とは対照的に、理想的なコロニー（左）におけるフィーダー層から明確に分離に注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" width="700" /> 図3. EGFP陽性WIBR＃3セル。WIBRの＃AAVS1遺伝子座におけるEGFP発現修理テンプレートの標的と3細胞の代表的な画像。 ZFNで編集代表コロニーの画像、TALENsおよびCRISPR / Cas9が示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" width="700" /> 図4.ジェノタイピング戦略正しいターゲティングを確認する。（A）代表のPCR遺伝子型判定結果3 SSNのプラットフォーム間で、非標的ヘテロ接合およびホモ接合の標的クローンを示します。 WT CTLは野生型コントロールを=。 （B）Repreヘテロ接合の標的クローンおよび3 &#39;外部プローブを用いて検出ホモ接合対象となるクローンを示すsentativeサザンブロットの結果。フラグメントサイズ：WT-6.5キロバイト、編集・6.9キロバイト（C）適切に編集したクローンと非ランダム二重統合とヘテロ接合クローンを示す代表的なサザンブロットの結果。フラグメントサイズ：適切に編集した-6.9キロバイト、異常な追加の統合-5キロバイト<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 研究 </td><td> 遺伝子ターゲット </td><td> プラットフォーム </td><td> 修理テンプレートの種類 </td><td> 取り上げたクローンの＃ </td><td> ターゲティング効率 </td></tr><tr><td>セクストンら 、2014 </td><td> TPP1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-ピューロ</tD&gt; <td>報告されていません</td><td>報告されていません</td></tr><tr><td>セクストンら 、2014 </td><td> TERT </td><td> ZFN </td><td>ハイグロマイシン</td><td>報告されていません</td><td>報告されていません</td></tr><tr><td> Hockemeyer ら 、2009 </td><td> POU5F1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-ピューロ</td><td> 31 </td><td> 39.0パーセント</td></tr><tr><td> Hockemeyer ら 、2009 </td><td> PITX3 </td><td> ZFN </td><td> GFP-ピューロ</td><td> 74 </td><td> 14.9％ </td></tr><tr><td> Hockemeyer ら 、2011 </td><td> POU5F1 </td><td> TALEN </td><td> GFP-ピューロ</td><td> 68 </td><td> 91.0パーセント</td></tr><tr><td> Hockemeyer ら 、2011 </td><td> PITX3 </td><td> TALEN </td><td> GFP-ピューロ</td><td> 96 </td><td> 13.0％ </td></tr><tr><td>マークルら 、2015 </td><td> VASA </td><td> Cas9 </td><td>レポーター、ジェネティシン</td><td> 139 </td><td> 94.0パーセント</td></tr><tr><td>マークルら&lt;/ em&gt;の、2015 </td><td> CRH </td><td> Cas9 </td><td>レポーター、ジェネティシン</td><td> 30 </td><td> 93.0パーセント</td></tr><tr><td>マークルら 、2015 </td><td> HCRT </td><td> Cas9 </td><td>レポーター、ジェネティシン</td><td> 154 </td><td> 92.0パーセント</td></tr><tr><td>マークルら 、2015 </td><td> HMX2 </td><td> Cas9 </td><td>レポーター、ジェネティシン</td><td> 11 </td><td> 45.0パーセント</td></tr><tr><td>フォースターら 、2014 </td><td> LRG5-Nterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-ピューロ</td><td>報告されていません</td><td> 30.0％ </td></tr><tr><td>フォースターら 、2014 </td><td> LRG5-CTERM </td><td> ZFN </td><td> GFP-ピューロ</td><td>報告されていません</td><td> 14.0％ </td></tr><tr><td> Soldner ら 、2011 </td><td> SNCA </td><td> ZFN </td><td>ピューロ</td><td> 96 </td><td> 1.0％ </td></tr></tbody></table> カレとこの方法を用いて標的他の遺伝子の表1の説明、以前に発表された研究から取られた効率をターゲットsponding。4,5,38-41 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 軌跡 </td><td> シーケンス </td><td> ノート </td></tr><tr><td> AAVS1-Fプライマー</td><td> CTCTAACGCTGCCGTCTCTC </td><td> PCR条件：T mを= 57℃、35サイクル</td></tr><tr><td> AAVS1-WT-Rプライマー</td><td> GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG </td><td> WTバンド：1273塩基対</td></tr><tr><td> AAVS1-ターゲット-Rプライマー</td><td> CGTCACCGCATGTTAGAAGA </td><td>ターゲットバンド：992塩基対</td></tr><tr><td> T2-Cas9ガイド</td><td> GGGCCACTAGGGACAGGAT </td><td>マリら 、2013年から</td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN右</td><td> TAGGGACAGGAT </td><td> Hockemeyer ら 、2009年から</td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN左</td><td> TGGGGTGTCACC </td><td> Hockemeyer ら 、2009年から</td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN右</td><td> TCCTAACCACTGTCTTT </td><td> Hockemeyer ら 、2011年から</td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN左</td><td> CCCCTCCACCCCACAGT </td><td> Hockemeyer ら 、2011年から</td></tr></tbody></table> プライマーとSSN標的化配列の表2のリスト。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 標的構 ​​築物 </td><td> EGFP +コロニー数 </td><td> ターゲット取り上げたクローン（PCRを検証） </td><td> （サザンブロットによる）前報告正しいターゲティング効率 </td></tr><tr><td> ZFN </td><td> 150 </td><td> 86.9パーセント（73.9パーセントのヘタ/ 13.0％ホモ） </td><td> 56％（50％HET / 6％のホモ） </td></tr><tr><td> TALEN </td><td> 412 </td><td> 91.3パーセント（47.8パーセントのヘタ/ 39.1パーセントホモ） </td><td> 47％（37.5％のヘタ/ 9.3％ホモ） </td></tr><tr><td> CRISPR-Cas9 </td><td> 235 </td><td> 95.7パーセント（69.5パーセントHET / 26.3％ホモ） </td><td>報告されていません</td></tr></tbody></table> 表3.比較EGFP陽性の数とはTALEN、ZFNを対象とし、CRISPR / Cas9ヒト幹細胞コロニー。PCRは、以前の実験4,5に適切な単一の統合検証サザンブロットと比較されるこの実験のAAVS1遺伝子座での統合を検証しました。

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Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

ゲノム編集したヒト多能性幹細胞株の樹立：分離へのターゲティングから

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.5K ビュー.  University of California, Berkeley. Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance. 

ビデオ: Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Transfection, Selection, and Colony-picking of Human Induced Pluripotent Stem Cells TALEN-targeted with a GFP Gene into the AAVS1 Safe Harbor

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral vector mediated random integration. This protocol describes a universal and efficient transgene targeted addition platform in human iPSCs based on utilization of validated open-source TALENs and a gene-trap-like donor to deliver transgenes into a safe harbor locus. Importantly, effective gene editing is rate-limited by the delivery efficiency of gene editing vectors. Therefore, this protocol first focuses on preparation of iPSCs for transfection to achieve high nuclear delivery efficiency. When iPSCs are dissociated into single cells using a gentle-cell dissociation reagent and transfected using an optimized program, >50% cells can be induced to take up the large gene editing vectors. Because the AAVS1 locus is located in the intron of an active gene (PPP1R12C), a splicing acceptor (SA)-linked puromycin resistant gene (PAC) was used to select targeted iPSCs while excluding random integration-only and untransfected cells. This strategy greatly increases the chance of obtaining targeted clones, and can be used in other active gene targeting experiments as well. Two weeks after puromycin selection at the dose adjusted for the specific iPSC line, clones are ready to be picked by manual dissection of large, isolated colonies into smaller pieces that are transferred to fresh medium in a smaller well for further expansion and genetic and functional screening. One can follow this protocol to readily obtain multiple GFP reporter iPSC lines that are useful for in vivo and in vitro imaging and cell isolation.

TALEN-mediated gene editing at the safe harbor AAVS1 locus enables high-efficiency transgene addition in human iPSCs. This protocol describes the procedures for preparing iPSCs for TALEN and donor vector delivery, transfecting iPSCs, and selecting and isolating iPSC clones to achieve targeted integration of a GFP gene to generate reporter lines.

トランスフェクション、選択、およびAAVS1セーフハーバーへのGFP遺伝子とTALENを標的とする人間の人工多能性幹細胞のコロニーピッキング

Targeted transgene addition can provide persistent gene expression while circumventing the gene silencing and insertional mutagenesis caused by viral ...

発生生物学

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

遺伝学

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

ヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-CAS9を用いて定義されたゲノム修飾の生成

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Introducing Point Mutations into Human Pluripotent Stem Cells Using Seamless Genome Editing

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing in mammalian cells. Here we describe detailed procedures to seamlessly genome edit the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus as an example in human pluripotent stem cells. Combining a piggyBac-based donor plasmid and the CRISPR-Cas9 nickase mutant in a two-step genetic selection, we demonstrate correct and efficient targeting of the HNF4&#945; locus.

Here, we describe a detailed method for seamless gene editing in human pluripotent stem cells using a piggyBac-based donor plasmid and the Cas9 nickase mutant. Two point mutations were introduced into exon 8 of the hepatocyte nuclear factor 4 alpha (HNF4&#945;) locus in human embryonic stem cells (hESCs).

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

Custom designed endonucleases, such as RNA-guided Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-Cas9, enable efficient genome editing ...

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

生物学

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is still time consuming. Comparative studies that use recombinant lines with transgenes integrated into safe harbor loci could benefit from approaches that use site-specific targeted recombinases, like Cre or FLPe, which are more rapid and less prone to off-target effects. Such methods have been described, although they do not significantly outperform gene targeting in most aspects. Using Zinc-finger nucleases, we previously created a master cell line in the AAVS1 locus of hPSCs&#160;that contains a GFP-Hygromycin-tk expressing cassette, flanked by heterotypic FRT sequences. Here, we describe the procedures to perform FLPe recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) using this line. The master cell line is transfected with a RMCE donor vector, which contains a promoterless Puromycin resistance, and with FLPe recombinase. Application of both a positive (Puromycin) and negative (FIAU) selection program leads to the selection of RMCE without random integrations. RMCE generates fully characterized pluripotent polyclonal transgenic lines in 15 d&#160;with 100% efficiency. Despite the recently described limitations of the AAVS1 locus, the ease of the system paves the way for hPSC transgenesis in isogenic settings, is necessary for comparative studies, and enables semi-high-throughput genetic screens for gain/loss of function analysis that would otherwise be highly time consuming.

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Here we report a rapid and efficient gene editing method based on RMCE in the AAVS1 locus of human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) that improves upon previously described systems. Using this technique, isogenic lines can be rapidly and reliably generated for proper comparative studies, facilitating transgenesis-mediated research with hPSCs.

中リコンビナーゼ媒介カセット交換による組換えヒト多能性幹細胞の迅速かつ効率的な生成<em&gt; AAVS1</em&gt;軌跡

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

医学

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Efficient iPS Cell Generation from Blood Using Episomes and HDAC Inhibitors

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using episomal plasmids and histone deacetylase (HDAC) inhibitors. The advantages of this approach include: (1) the use of a minimal amount of peripheral blood as a source material; (2) nonintegrating reprogramming vectors; (3) a cost effective method for generating vector free iPSCs; (4) a single transfection; and (5) the use of small molecules to facilitate epigenetic reprogramming. Briefly, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are isolated from routine phlebotomy samples and then cultured in defined growth factors to yield a highly proliferative erythrocyte progenitor cell population that is remarkably amenable to reprogramming. Nonintegrating, nontransmissible episomal plasmids expressing OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A, and a p53 short hairpin (sh)RNA are introduced into the derived erythroblasts via a single nucleofection. Cotransfection of an episome that expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) allows for easy identification of transfected cells. A separate replication-deficient plasmid expressing Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA1) is also added to the reaction mixture for increased expression of episomal proteins. Transfected cells are then plated onto a layer of irradiated mouse embryonic fibroblasts (iMEFs) for continued reprogramming. As soon as iPSC-like colonies appear at about twelve days after nucleofection, HDAC inhibitors are added to the medium to facilitate epigenetic remodeling. We have found that the inclusion of HDAC inhibitors routinely increases the generation of fully reprogrammed iPSC colonies by 2 fold. Once iPSC colonies exhibit typical human embryonic stem cell (hESC) morphology, they are gently transferred to individual iMEF-coated tissue culture plates for continued growth and expansion.

Here we describe a protocol for generating human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using an episome based reprogramming strategy and histone deacetylase inhibitors.

エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

This manuscript illustrates a protocol for efficiently creating integration-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) from peripheral blood using ...

Derivation and Characterization of a Transgene-free Human Induced Pluripotent Stem Cell Line and Conversion into Defined Clinical-grade Conditions

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic genes remaining in actively transcribed regions of the genome, limit their potential for use in human therapeutic applications1. Additionally, non-human antigens derived from stem cell reprogramming or differentiation into therapeutically relevant derivatives preclude these hiPSCs from being used in a human clinical context2. In this video, we present a procedure for reprogramming and analyzing factor-free hiPSCs free of exogenous transgenes. These hiPSCs then can be analyzed for gene expression abnormalities in the specific intron containing the lentivirus. This analysis may be conducted using sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR), which has an advantage over less sensitive techniques previously used to detect gene expression differences3. Full conversion into clinical-grade good manufacturing practice (GMP) conditions, allows human clinical relevance. Our protocol offers another methodology&#8212;provided that current safe-harbor criteria will expand and include factor-free characterized hiPSC-based derivatives for human therapeutic applications&#8212;for deriving GMP-grade hiPSCs, which should eliminate any immunogenicity risk due to non-human antigens. This protocol is broadly applicable to lentiviral reprogrammed cells of any type and provides a reproducible method for converting reprogrammed cells into GMP-grade conditions.

We describe a protocol for deriving lentiviral-based reprogrammed and characterized factor-free human induced pluripotent stem cells and conversion into putative clinical-grade conditions.

導入遺伝子のない人間の人工多能性の導出および特徴は、定義された臨床グレードの条件に細胞株および変換の幹

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) can be generated with lentiviral-based reprogramming methodologies. However, traces of potentially oncogenic ...

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical application of this technique, particularly in pluripotent stem cells, presents certain challenges, such as being time- and labor-intensive and having low editing efficiency. Here, we describe the generation of a CRISPR-mediated gene knockout in a human embryonic stem cell (hESC) line stably expressing sgRNAs for the L2HGDH gene, using a highly efficient and stable lentiviral-mediated gene delivery system. The sgRNAs targeting exon 1 of the L2HGDH gene were chemically synthesized and cloned into the lentiCRISPR v2-puro vector, which combines the constitutive expression of sgRNAs with Cas9 in a highly efficient single-vector system to achieve higher lentiviral titers for hESC infection and stable selection using puromycin. Puromycin-selected cells were further expanded, and single-cell clones were obtained using the limited dilution method. The single clones were expanded, and several homozygous knockout clones for the L2HGDH gene were obtained, as confirmed by a 100% reduction in L2HGDH expression using Western blot analysis. Furthermore, using MSBSP-PCR, the CRISPR mutation site was mapped upstream of the PAM recognition sequence of Cas9 in the selected homozygous clones. Sanger sequencing was performed to analyze the exact insertions/deletions, and functional characterization of the clones was conducted. This method produced a significantly higher percentage of homozygous deletions compared to previously reported non-viral gene delivery methods. Although this report focuses on the L2HGDH gene, this robust and cost-effective approach can be used to create homozygous knockouts for other genes in pluripotent stem cells for gene function studies.

<meta charset="utf8"></head><body>フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

The presented method describes the generation of a CRISPR-mediated gene knockout in the human embryonic stem cell (hESC) line H9, which stably expresses sgRNAs targeting the L2HGDH gene using a highly efficient lentiviral-mediated gene delivery system.

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical ...