本稿で説明する作業はUCRの幹細胞Coreのカリフォルニア再生医療研究所（CIRM）からの資金によって可能となった。

我々のプロトコルはGeneJuice（EMD）とAMAXA nuclefector装置を用いてヒトの性IPSCのクレオを用いてヒトの性IPSCをトランスフェクトするためのプロトコルが続くフィーダーフリー培養に人間性IPSCを適応させる方法で始まります。 注：以下の手順は、無菌層流フード内で実行されます。すべてのメディアおよびソリューションは、37℃以上、特に断らない限り起動する前に室温に戻しています。 1。フィーダーフリーシステムに人間性IPSCの確立以前にフィーダー細胞上で維持人間性IPSCは、分割Geltrexコーティングされた皿に移して、フィーダーフリートランスフェクションの前に2つの通路を維持することができる。 <ol><li> 4℃で一晩Geltrexを解凍Geltrexコーティングを準備するには、冷たいDMEM中で解凍Geltrex 1:50に希釈します。優しくソリューションを混ぜる。 </li></ol>注：Geltrex、マトリゲルなどが基底膜MATRの可溶性形態であるixはネズミEngelbreth·ホルム·スウォーム（EHS）腫瘍細胞から精製した。あるいは、マトリゲルをフィーダーフリー人間IPSC文化を確立するために細胞外マトリックスとして使用することができます。 <ol start="2"><li> Geltrex溶液（35-mmの1ミリリットルウェル）で培養ウェルの表面全体を覆​​う。 37℃Geltrex付きコート井戸℃で1時間インキュベーター。 </li><li>ほとんどの細胞が剥離し始めるまで通路人間性IPSCに、ウェル当たりaccutaseの1ミリリットルを加え、1分間37℃でインキュベートする。 </li></ol>ほとんどの細胞が剥離し始めるまで通路人間性IPSCに、ウェル当たりaccutaseの1ミリリットルを加え、1分間37℃でインキュベートする。 <ol start="4"><li>細胞がゆっくりと渦プレートを10から15にガラスビーズを追加します。ノックアウトDMEM / F12の2ミリリットルを加え、穏やかにひいて粉にする。 10 mlの遠心チューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li>室温で3分間800rpmで細胞をスピン。 </li><li>人間IPSCペレットはそのままにして、チューブから上清を吸引します。優しくチューブをフリック細胞ペレットを分散させる。 </li><li>コー​​ティングされた井戸からGeltrexを削除します。 </li><li>優しくSTEMPROの適切な音量で人間IPSCペレットを再懸濁します。 ）増殖速度に応じて、フィーダーのウェル間で配布しています。人間性IPSCは、1:2〜1:6の分割比で継代することができる。 </li><li>慎重に所定の位置5％CO 2インキュベーター、慎重にスワールプレートのウェルを越えた細胞の均一な分布を確実にするために。 </li><li>細胞まで、毎日のフィード細胞は（細胞が80％コンフルエントに達したとき）を再度分割する準備が整いました。 </li><li> 1:2の分割比で新しいGeltrexコーティングされた井戸の上に通路人間性IPSC（ステップ1.3から1.9）。小さなコロニーが形成され、よくGeltrexコーティングされたトランスフェクションの前に均等に分配されるべきである。 </li></ol> 2。 GeneJuiceと人間性IPSCのトランスフェクション細胞（6ウェルプレート上で増殖）最適なトランスフェクション効率を達成するために、トランスフェクションの日に合流、約40〜50％であるべきである。それは翌日まで細胞培地を変更する必要はありません。 <ol><li>滅菌済み1.5mlエッペンドルフチュー​​ブに100μlのKO-DMEM/F12を準備します。 27μlのGeneJuiceトランスフェクション試薬を追加します。よく混ぜる。 5分間室温でインキュベートする。 </li><li> 4μgのプラスミドDNAを追加。 15分間室温でチューブをインキュベートする。プラスミドの選択が最適なトランスフェクション効率のために重要です。我々はプロモーター5（pCAG-EGFP）をCAGによって駆動増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を有するプラスミドを使用しています。 CAGプロモーターと人間性IPSCにおける転写活性であり、したがって、これらの細胞に導入遺伝子の発現を駆動するために使用することができる強力なプロモーターである。我々の手では、プラスミドの線形化は、トランスフェクション効率に影響を与えていないようでした。 </li><li>細胞やスワールプレートにGeneJuice-DNA混合物を追加します。十分に人間性IPSCでトランスフェクション混合物の接触を高めるために5分間1200rpmで（ &#39;spinoculation&#39;メソッド）でプレートを回転させる。 </li><li> 37＆で細胞をインキュベート度、Cで一晩。 </li><li>翌日、トランスフェクション効率を監視する。 </li><li>安定したトランスフェクションのために、新鮮なSTEMPROで翌日培地を変更してください。 48時間 - 24の後に適切な抗菌薬の選択を追加します。 </li></ol> 3。人間性IPSCのヌクレオフィーダまたはGeltrex上に成長させた人間性IPSCはクレオのために使用することができます。しかし、我々は強く高い細胞生存率と回復を確実にするために、マウス胚線維芽細胞（MEF）またはヒト包皮線維芽細胞（HFF）のフィーダにnucleofected人間性IPSCを再播種をお勧めします。少なくとも2万個の細胞は、ヌクレオ以下の高い細胞生存率を達成するために使用されるべきである。 <ol><li>一夜フィーダー細胞を用いてヒトIPSCノックアウト血清代替（KOSR）メディアをインキュベートすることにより、フィーダー細胞馴化培地（CM）を準備します。 CMを24時間ごとに収集します。 </li></ol>注：フィーダー層を製造するために使用される任意のマウス系統（例えば、BLK6、CF1とMF1など）foを使用するのに適していますrはCMを作る。 <ol start="2"><li>クレオの日には、少なくとも1時間、10μMROCK阻害剤との人間性IPSCを事前に処理します。 </li><li>滅菌済み1.5mlエッペンドルフチュー​​ブにヒト幹細胞ヌクレオ液の82μlを準備します。 18μlのサプリメント（1）を加える。よく混ぜる。 5分間37℃で溶液をインキュベートする。 </li><li>プリ暖かいフィーダー細胞馴化培地（CM）および0.25％トリプシン/ EDTAを37℃ボンネットの下に、prelabel 1滅菌15 mlコニカルチューブ。 </li><li>慎重nucleofectedする人間IPSC文化からメディアを削除します。優しくウェル当たり2ミリリットル1Xリン酸緩衝液（PBS）で細胞を洗浄する。 PBSを吸引除去。ウェルあたりの0.25％トリプシンを1mlを加える。 3分37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li>そっと千ミリリットルピペットチップを用いて細胞をひいて粉にする。すべての人間性IPSCが完全に切り離されていることを確認するために井戸の底を洗います。ラベルの付いた15mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。 </li></ol>注：単一のcにトリプシン処理ellsは厳密に避けるべきである。細胞の約三つ子から成っていた細胞が唯一の細胞の小さな塊に外れなければなりません。細胞の小さな塊（セルトリプル）は、細胞のその後の取扱い中に単細胞に解離することになります。 <ol start="7"><li>トリプシンを不活性化するために9ミリリットルMEFのメディアを追加します。 3分間800rpmで細胞をスピン。注意深く上清を吸引し、細胞ペレットをそのままにしておく。 </li><li>ステップ3.3からヒト幹細胞ヌクレオソリューションの温めておいた100μlの細胞を再懸濁する。 </li><li> 1ミリリットルピペットチップを用いてヌクレオキュベットにセルを転送します。 </li><li>キュベット内の細胞懸濁液にプラスミドDNA4μgのを追加します。穏やかな旋回により細胞とDNAを混ぜます。ボンネットの表面に二回キュベットをタップします。 </li><li>ヌクレオホルダーにキュベットを挿入します。プログラムは、B-016を使用しています。ボタンXを押すことによって、細胞をNucleofect </li></ol> &lt; <ok>クレオプロセスがあるときのcomplet&gt;が表示されますED（通常は1〜5秒しかかかりません）。他のヌク​​レオプログラムの使用（-023-033とU-023）は、人間性IPSCからEGFP陽性細胞の10％未満が得られた。 </ok><ol start="12"><li>提供されるパスツールプラスチック製のピペットを使用してキュベットからnucleofectedセルを取得。滅菌済み1.5mlエッペンドルフチュー​​ブに温めておいたCMと、ROCK阻害剤でそれらを再懸濁することにより細胞を回収する。細胞が回復するように10分間37℃で細胞をインキュベートします。 </li><li> 1ミリリットルピペットチップを用いてフィーダー層上に滴下転送細胞。 37℃で一晩細胞をインキュベートします。 </li><li>翌日、トランスフェクション効率を監視する。に安定して導入遺伝子を発現するトランスジェニック人間性IPSCの安定したクローンを導出し、CMとROCK阻害剤で翌日培地を変更してください。 48時間 - 24の後に適切な抗菌薬の選択を追加します。 </li></ol> 4。代表的な結果： <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3110/3110fig1.jpg" /> <stチョロン&gt;図1。pCAG-EGFPでトランスフェRiv1人間性IPSCの顕微鏡写真。 （A）のEGFP発現細胞がRiv1 Geltrex 12時間トランスフェクション後にGeneJuiceを使用してトランスフェクションした。 Riv1人間性IPSCのコロニーは、B-016（B）と-023（C）のプログラムを使用してヌクレオ以下フィーダー上で平板培養し、形成された。 （D）はユビキタスeGFP発現で安定EGFP発現人間IPSCコロニーがGeneJuice由来。 （E）を安定的にトランスフェクトRiv1人間性IPSCは、胚様体の分化過程で恒常eGFP発現を保持した。

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	<li>Liew, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells:+possibilities+for+human+cell+transplantation.">Human embryonic stem cells: possibilities for human cell transplantation.</a> Ann Med. 37, 521-532 (2005).</li><li>Eiges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+embryonic+stem+cell-transfected+clones+carrying+a+marker+for+undifferentiated+cells.">Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells.</a> Curr Biol. 11, 514-518 (2001).</li><li>Zwaka, T. P., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogous+recombination+in+human+embryonic+stem+cells.">Homogous recombination in human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 21, 319-321 (2003).</li><li>Siemen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).</li><li>Liew, C. G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li><li>Xia, X., Ayala, M., Thiede, B. R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro-+and+in+vivo-induced+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+and+derivatives.">In vitro- and in vivo-induced transgene expression in human embryonic stem cells and derivatives.</a> Stem Cells. 26, 525-533 (2008).</li><li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells.">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li><li>Braam, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeder-free+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+conditioned+medium+for+efficient+genetic+modification.">Feeder-free culture of human embryonic stem cells in conditioned medium for efficient genetic modification.</a> Nat Protoc. 3, 1435-1443 (2008).</li><li>Hohenstein, K. A., Pyle, A. D., Chern, J. Y., Lock, L. F., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+mediates+high-efficiency+stable+gene+knockdown+and+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection mediates high-efficiency stable gene knockdown and transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1436-1443 (2008).</li><li>Placantonakis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenesis+in+human+embryonic+stem+cells+as+a+novel+tool+to+define+the+human+neural+lineage.">BAC transgenesis in human embryonic stem cells as a novel tool to define the human neural lineage.</a> Stem Cells. 27, 521-532 (2009).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

顕著な毒性作用と細胞死せずに人間性IPSCに導入遺伝子を導入するための、シンプルで堅牢で再現性の高い技術で提案されたプロトコルの結果。人間性IPSCは、多数の小さなコロニーで最適なトランスフェクション効率を確保するために（1:2）は、細胞の小さな塊（5-10セル）に継代し、高密度でGeltrex上にめっきされるべきである。分化および細胞死を起こしやすい人間IPSCの行では、人間性IPSCの数が多い（最大4×10 6細胞）を単ヌクレオ実験に使用されるべきである。一過性トランスフェクションアッセイは、1日以内に導入遺伝子を発現している人間性IPSCの大きい数字を生成します。安定にトランスフェクトされたIPSCのクローンは、通常7日以内に表示され、これらのトランスジェニックコロニーは3週間以内に取りに行く準備ができているはずです。ここで説明するCAGプロモーターの使用は、EGFPレポーターのユビキタスな発現を確実にします。このような改善の下では、我々のプロトコルは、過剰発現、cを含む、他のアプリケーションに供給することができますonditional誘導、系統特異的レポーターラインの導出、shRNAまたはsiRNAノックダウン、遺伝子ターゲティングと相同組換え。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> EDTAを0.25％トリプシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 25200056 </td><td></td></tr><tr><td> 2 - メルカプトエタノール</td><td>インビトロジェン</td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> 3ミリのガラスビーズ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 11-312A </td><td>ガラスビーズは、一晩塩酸（HCl）で洗浄し、水酸化ナトリウム（NaOH）と蒸留水で洗い流し、使用前にオートクレーブ滅菌する必要があります。 </td></tr><tr><td> Accutase細胞解離試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> A11105-01 </td><td></td></tr><tr><td>塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF） </td><td>インビトロジェン</td><td> PHG0263 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM（高グルコース） </td&gt; <td>ロンザ</td><td> 12から741、F </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16000044 </td><td></td></tr><tr><td> Geltrex </td><td>インビトロジェン</td><td> 12760013 </td><td>成長因子低減</td></tr><tr><td> GeneJuiceトランスフェクション試薬</td><td> EMD Biosciences社</td><td> 70967 </td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス-I（100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 35050061 </td><td> L-グルタミン（Invitrogen社、25030081）も代わりに使用することができます。 </td></tr><tr><td>人間IPSC KOSRメディア</td><td></td><td></td><td> 500ミリリットルヒトESメディアは390ミリリットルノックアウトDMEM / F12、100ミリリットルのノックアウト血清代替、5ミリリットルグルタマックス-I（100X）、5ミリリットルNEAA（100X）、500μlの2 - メルカプトエタノール（55ミリメートル）で構成され、10 ng / mlのbFGFを補っ。 </td></tr><tr><td>ノックアウトDMEM/F12 </td><td>インビトロジェン</td><td> 12660-012 </td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替（KOSR） </td><td>インビトロジェン</td><td> 10828-028 </td><td></td></tr><tr><td>マウス胚性線維芽細胞培地</td><td></td><td></td><td> MEFのメディアは、90％のFBS、1X NEAA、1Xグルタマックス-IとDMEM中1Xピルビン酸ナトリウム（高グルコース）で構成されています</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸、NEAA？（100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td>ヒト幹細胞ヌクレオ液1サプリメントで</td><td>ロンザ</td><td> VAPH-5012 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩は、Ca 2 +およびMg 2せずに緩衝生理食塩水+ </td><td>インビトロジェン</td><td> 10010023 </td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム（100X） </td><td>インビトロジェン</td><td> 11360070 </td><td></td></tr><tr><td> STEMPRO培地キット</td><td>インビトロジェン</td><td> A1000701 </td><td> 500ミリリットルSTEMPROメディアは454ミリリットルノックで構成されていますDMEM / F12、10ミリリットルSTEMPRO無血清増殖サプリメント（50X）、5ミリリットルグルタマックス-I（100X）、5ミリリットルNEAA（100X）、36 mlのBSA（ウシ血清アルブミン、25％）、909μlの2 - メルカプトエタノール（55mmの外）および10 ng / mlのbFGFを補った。 </td></tr></tbody></table>

transfecting and nucleofecting human induced pluripotent stem cells

遺伝子改変は、幹細胞生物学を研究することにし、ヒト胚性幹細胞（hESC）1の電位の臨床応用を定めたに不可欠なツールであることを続けています。いくつかの遺伝子送達方法の改善は2-9を説明してきたが、トランスフェクションは、ヒトES細胞のための気まぐれなプロセスのままで、まだ人間の人工多能性幹細胞（性IPSC）に報告されていません。このビデオでは、我々の研究室では日常的に増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポータープラスミドを用いてヒトの性IPSCをtransfectsとnucleofects方法をデモンストレーションします。人間性IPSCが適用され、フィーダー細胞のトランスフェクションの可能性を排除し、トランスフェクション後の安定したトランスジェニックIPSCクローンの効率的な選択を可能にするためにフィーダーフリー培養として維持されています。クレオは、人間性IPSCは、細胞馴化フィーダ内フィーダー上nucleofectedと再播種ROCK阻害剤11、細胞の小さな塊にトリプシン処理で前処理される細胞の回収を強化するための媒体である。導入遺伝子を発現している人間性IPSCは、6時間後に取得できます。抗生物質の選択は、24時間後に適用され、安定したトランスジェニック系統は、1週間以内に表示されます。我々のプロトコルはこれらの細胞の多能性を変えることなく、人間のIPSC行するための堅牢で再現性がある。

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Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

遺伝子組み換えの最近の進歩にもかかわらず、ヒト胚性幹細胞（hESC）のトランスフェクションは、気まぐれなプロセスのままです。我々の知る限りでは、人間の人工多能性幹細胞（性IPSC）トランスフェクトする体系的かつ効率的な方法が報告されていない。ここでは、効率的にトランスフェクトし、人間性IPSCをnucleofectするための堅牢なプロトコルを記述。

ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

transfecting-and-nucleofecting-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

21.3K ビュー.  University of California Riverside. 遺伝子組み換えの最近の進歩にもかかわらず、ヒト胚性幹細胞（hESC）のトランスフェクションは、気まぐれなプロセスのままです。我々の知る限りでは、人間の人工多能性幹細胞（性IPSC）トランスフェクトする体系的かつ効率的な方法が報告されていない。ここでは、効率的にトランスフェクトし、人間性IPSCをnucleofectするための堅牢なプロトコルを記?...

ビデオ: Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Transfecting Human Neural Stem Cells with the Amaxa Nucleofector

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection reagents has often resulted in poor cell viability and low transfection efficiency.  Other mechanical methods of introducing a gene of interest, such as a &#8220;gene gun&#8221; or microinjection, are also limited by poor cell viability and low numbers of transfected cells.  The strategy of using viral constructs to introduce an exogenous gene into primary cells has been constrained by both the amount of time and labor required to create viral vectors and potential safety concerns.  We describe here a step-by-step protocol for transfecting hNSPCs using Amaxa's Nucleofector device and technology with electrical current parameters and buffer solutions specifically optimized for transfecting neural stem cells.  Using this protocol, we have achieved initial transfection efficiencies of ~35% and ~70% after stable transfection.  The protocol entails combining a high number of hNSPCs with the DNA to be transfected in the appropriate buffer followed by electroporation with the Nucleofector device.

Introducing a gene of interest into a cell is a powerful method for elucidating its function in vivo. This protocol describes an efficient method of transfecting a culture of human neural stem/precursor cells (hNSPCs) using the Nucleofector electroporation apparatus made by Amaxa.

Amaxa Nucleofectorでヒト神経幹細胞をトランスフェクト

Transfection of primary mammalian neural cells, such as human neural stem/precursor cells (hNSPCs), with commonly used cationic lipid transfection ...

生物学

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

大人の線維芽細胞から再プログラムヒト人工多能性幹細胞のコロニーを選択し、分離

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

仙台ウイルスのヒト体細胞からの効率的な次世代ヒューマン誘導多能性幹細胞

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Episomal Reprogramming of Dermal Fibroblasts to Generate Human-Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs)

Episomal Reprogramming of Dermal Fibroblasts to Generate Human-Induced Pluripotent Stem Cells (HiPSCs)  

To begin, take a flask of cultured fibroblast cells, coat a 10-centimeter cell culture plate suitable for hiPSC culture with four milliliters of cold coating solution per plate, and incubate the plate for one hour at 37 degrees Celsius. Afterward, remove the media from the fibroblasts and wash them with four milliliters of pre-warmed PBS per flask. Aspirate the PBS and associate the fibroblasts with four milliliters of Trypsin-EDTA per flask by incubating for five to seven minutes at 37 degrees Celsius.Monitor cell detachment using a phase contrast microscope, and if needed, tap against the side of the flask to detach the cells from the plastic surface. Transfer the detached cells to a 50-milliliter conical tube and wash the empty flasks with six milliliters of pre-warmed fibroblast medium. Collect and pool the remaining cells in the conical tube.Then centrifuge the cells at 200 g for five minutes at 20 degrees Celsius. Aspirate the supernatant and re-suspend the cell pellet in three milliliters of fresh, pre-warmed PBS. Count the cells, transfer 1.5 times 10 to the sixth fibroblasts into a new conical tube and fill up with PBS to the five millimeter mark.Centrifuge the tube at 200 g for five minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant, re-suspend the cell pellet in five milliliters of electroporation medium, and centrifuge again. In the meantime, aspirate the coating solution from the coated 10-centimeter cell culture plate and add seven milliliters of pre-warmed fibroblast medium.At the end of the centrifugation, discard the supernatant and re-suspend the cell pellet in electroporation medium with a concentration of 1.5 times 10 to the sixth cells in 250 microliters. Transfer the 250 microliter cell suspension to an electroporation cuvette with a four millimeter gap distance. Next, prepare a plasma transfection mix by adding four micrograms of each plasmid to a total volume of 50 microliters of electroporation medium.Transfer the transfection mix to the cuvette, mix gently by flicking, and electroporate with one pulse at 280 volts. Finally, transfer 150 microliters of the electroporated fibroblasts to the prepared 10-centimeter cell culture plate. Agitate the plate thrice in all directions to distribute the cells, and incubate overnight.Fibroblasts present in a long, spindle-like phenotype, the size of 150 to 300 nanometers. After reprogramming, colonies with 50 micrometer small hiPSCs occur displaying distinct borders. The hiPSCs are distinguished by a high nuclei to body ratio and increased proliferation rate.