この作品は、頭脳科学のためのアレンの協会によって賄われていた。著者のアレンの協会創設者、ポール g. アレンとジョディのアレン、ビジョン、励まし、サポートに感謝したいです。また、動物の世話、飼育、遺伝子型を実行するためのアレンの協会テクニカル サポート スタッフを感謝いたします。

著者が明らかに何もありません。

Na+スパイクの Gigaohm シール形成とパッチク ランプ記録の成功を向上させます。 NMDG 保護回復法の初期バージョンは、成人・高齢の動物2,5用に設計されました。一部のアーリー アダプターの少年動物脳スライスにこの方法論を適用しようとしているも (すなわち、マウス < 30 日古い)。しかし、優れた目視により確認神経保存この年齢範囲の NMDG 保護回復法を用いたと対照をなして gigaohm シール形成できます頻繁失速、パッチク ランプ失敗した試行を記録するリードが指摘されています。1 つの仮説は、NMDG 陽イオンより容易に成人の脳のスライスに対する若年脳スライスに閉じ込められているシールの形成を妨げることができます。しかし、少年の脳スライスが NMDG アプライド (データは示されていない) で完全に水中に沈む中 gigaohm シールが形作ることができる容易に、こうしてを示すその NMDG アプライド自体を妨害されていない gigaohm シール形成。
低-高 Na+ソリューション初期脳スライスの回復手順の完了時からの急速な転移神経細胞膜に損傷を引き起こすし、シールの形成過程を摂動します。低-高 Na+、冷たい・暖かい温度、および Ca2 +の劇的な上昇から Mg2 +比への移行は、総称して自発的なシナプスの大規模な復活につながることを考えれば、これは直感的。この抑制のリバウンド局面がプロシージャをスライス脳では虚血性の侮辱の後再灌流障害を反映する可能性が。したがって、さらに Na+ NMDG 保護回復培養室内濃度分布の標高はゆっくりと漸進的な Na+スパイクのプロシージャが組み込まれています最初の回復段階で神経細胞膜の損傷を軽減します。再現性をもって正確なタイミングに昇格。元の保護回復プロシージャように温度から Na+の高度と Ca2 +/Mg2 +比昇格一時的な解離は有益です。さらに、Na+スパイクの手続きが早い時点と脳組織が生じます、遅い時間ポイントに向かって大きく細胞外の Na+濃度が小さい増加につながるが、Na+濃度の上昇に合わせてより良い機会。この手順は、段階的なソリューション exchange に代わる制御灌流ポンプまたは重力によって点滴ライン Na+レベルの定数の増加につながる、流入と流出スライス チャンバーのオーバーフローを避けるために注意が必要です。特に、この Na+でスパイクの手続きスライス チャンバーに溶液の浸透圧次第にスライスは通常浸透圧溶液に返されますが、これはない健康に悪影響スライスする前に数分間の期間または、パッチク ランプ記録成功。高浸透圧切削ソリューションより良い、この一時的なパッチ クランプ記録57,58, 真正のドーパミン神経細胞を維持するために脳スライス標本で以前使用されていますhyperosmolality は、いくつかの文脈に有益である可能性があります。
NMDG 保護回復法と段階的な Na+最適化されたプロシージャを実装することで成熟した大人の動物の年齢層を介して少年をカバーするスパイクのステップこの脳スライスの方法論のユーティリティを拡張されています。この更新されたプロトコルは、単一の最適な NMDG アプライド定式化およびプロシージャを使用して動物の年齢の広い範囲に適しています今。必要に応じて、徐々 に長く遅延および/またはより古い動物から脳スライスの生存率を高める遅い時間コースと Na+スパイクの手続きを適用でき、推奨は、スパイクでのよるとスケジュールの基本的なガイドを提供しています。動物に年齢 (表 2参照)。一方、我々 は、幅広いアプリケーションに適した基本的なフレームワークを提供している、生存率と脳スライス成人・高齢の動物からの寿命をさらに強化するため追加の高度な手順を調べることができます。たとえば、グルタチオン復元戦略はこの点に特に効果的し、2,6を他の場所で説明されているように実装することができます。
実験に挑戦のためのスループットの向上 パッチ ・ クランプ記録によってシナプス結合の解析は、成功の高い信頼性を実現するために神経細胞の構造と機能の両方の優秀な保存を必要とする要求の厳しいアプリケーションです。同時に記録されるニューロンの数として上がるまで直線的にスープラ-直線的技術的な難しさのレベルが 。多数の障害モードがあります、障害の最も頻繁な原因の 1 つ 1 つまたは複数の標的細胞に十分な gigaohm 印を結びができません。進行状況、特に 3 時が大幅に低下することができますこのまたはより多くのニューロンを同時に記録する必要があります。高速の発見と一致 gigaohm 最適化された NMDG 保護回復法と形成時間をシール、トランスジェニック両方の大人と成功率と多ニューロン パッチク ランプ実験のスループットに著しい改善があったマウスの脳スライスおよび成人の脳神経外科脳スライス。効率の向上より迅速かつ信頼性の高い gigaohm シール形成とこのプロトコルとスライスの神経保存性の向上の両方にほとんど確かに起因します。このプロトコルは、パッチク ランプ記録アプリケーションを明示的に利点に焦点を当て、脳スライスの生存が最優先他の挑戦的な実験アプリケーション同様の利益が予想されます。

急性脳スライス標本は、神経科学における重要な実験系です。約半世紀のこのプラットフォームがさまざまな解剖学的な脳領域と動物種の間で動的生きている脳機能学を有効に。かどうかは、目的のアプリケーション生化学、機能イメージ投射、形態、または電気生理学は、最適な整合性とスライスした組織の生存を確保する最も重要なのです。それは、高い弾力性のある少年の齧歯動物の脳スライス標本 (すなわちマウスの生後 30 未満) の日付に最も好ましいいるこの理由です。成熟した大人からスライスの十分に健康な脳を得ることが困難とほとんどの手ごわい挑戦をあると証明した動物を高齢化し成熟した脳の機能的な建築を勉強するための厳しい制限を課しています。これは特にパッチク ランプ記録、優秀な形態および機能の保全を必要とし、特定された単一ニューロンの組み込みとシナプスの詳細なプロパティを特徴付けるために不可欠な技術に当てはまります。過去数十年間パッチ クランプ electrophysiologists の大半は少年とはるかに低い健康な脳スライスを準備するためショ糖置換低 Na+アプライド1を使用して '保護切断' メソッドに依存しています。程度、若い大人動物。このメソッドはパッシブ Na+流入とそれに続く水の侵入と細胞のスライス切断段階膨張がそれらのニューロンにあるため特にニューロンの貧しい人々 の生存につながる優勢な侮辱をあるという前提に基づいて、ブレードの動きから直接の外傷を維持する可能性が最も高い浅層。しかし、保護加工法はまだ実装されている特定のアプライドの定式化に関係なく成熟した大人の動物から脳スライス標本を望まれるべき多くを残します。
この問題にシンプルだが効果的なソリューションがされている2,3,4,5,6を説明し、'保護回復' 脳スライス法と呼ばれます。このメソッドの元のバージョンは、NMDG は、最も汎用性と様々 な他候補ナトリウム イオンの代替品 (スクロース、グリセリン、コリン、トリスなど) の間で効果的なとして同定された NMDG 置換のアプライドを使用します。メディアの定式化は、脳スライス浮腫に抵抗し、強力な pH7第をバッファリングを提供 HEPES 添加と酸化ストレス (表 1) の有害な影響を打ち消すためにサプリメントの添加によってさらに強化されました。それ、経験的に決め、最初の回復培養ステップ低 na+、低 Ca2 +、高 Mg2 + NMDG アプライド必要かつ充分にいた大人の脳組織スライス直後後が神経改善動物年齢3,5,6細胞の種類、脳の広い範囲にわたって保全。
特に、何が今保護回復法と呼ばれる以前の化身は文学1,8,9,10、11,12,で見つけることができます。13、完全な成熟した大人、動物の脳のスライスとパッチ ・ クランプ記録を高齢化はなかったが認識またはこれらの初期の作品で実証します。さらに、微妙な手順のバリエーションは、実験用途4,14,15,16を支持して出てくる続けます。これらの多数の研究グループの仕事の集合体は、改良された組織保存の保護回復法のロバスト高信頼を付与します。NMDG 保護回復法今広く採用され大人動物脳スライス標本を用いた多くの研究発表研究で実装されています。これらの急性スライス研究にまたがる新皮質3,17,18, 海馬15,19,20,21, 線条体22,23,24 日、中脳25,26,27,28,29, と後脳30,31,32,33,34領域、およびさまざまな神経伝達物質や神経調節物質のグルタミン酸作動性4,30, gaba 作動性18,20,31,35 など ,36, ドーパミン24,29,37,38, コリン作動性14,37,38, 39、40ノルアドレナリンとセロトニン27,28神経伝達。メソッドはトランスジェニック動物3,39または生体内でウイルス注射17,27、次の派生のスライスにおける神経活動の光遺伝学的制御に適しています 28,40,41,42,43, 神経活動244,の機能的な Ca2 +イメージングとして ,,4546。短期可塑性4,47,48と長期的な可塑性16,35,48の多様な形態の解析がされています。報告しました。最近の研究は広範かつ系統的な構成49を記録 octopatch を使用して成熟した成体マウスの脳スライスの視覚野のシナプス接続のプロービングを容易にする NMDG 保護回復法を適用-強力なこのメソッドの堅牢性とユーティリティのデモンストレーション。保護回復法は、血管および成人の大脳皮質脳スライス50、パッチク ランプ記録から周の保存性の向上など、以前不測の実験的コンテキストで正常に適用されているも1-1.5 歳アルツハイマー病マウス モデル20と、成人の脳スライス受容体輸送アッセイ51介在ニューロン集団を移植しました。
次のプロトコルでは、急性の脳スライスの生存率を改善するために脳スライス標本の最適化の NMDG 保護回復メソッドを実装するための手順について説明します。この複雑な多ニューロン パッチ クランプ若い大人トランスジェニック マウスの脳スライスと成熟した大人の両方の実験を記録手法の明確な利点のデモだけでなく、神経保存性の向上のための原則を紹介します。脳神経外科脳スライス。成人患者から派生した人間の脳標本はして、次のプロトコルを 1 つ以上歳 21 日古いからマウスのも検証されています。

<table><tbody><tr><td>Compresstome VF-200</td><td>Precisionary Instruments</td><td>VF-200</td><td>Vibrating tissue slicer (recommended)</td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5405</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate monobasic dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71505</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5280</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate heptahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1880</td><td>aCSF constituent</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T48402</td><td>Anesthetic component 1</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>240486</td><td>Anesthetic component 2</td></tr><tr><td>Curved blunt forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11065-07</td><td>Brain dissection tools</td></tr><tr><td>Fine dissecting scissors (supercut)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Brain dissection tools</td></tr><tr><td>Large heavy duty scissors 7&#039;&#039;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14000-18</td><td>Brain dissection tools</td></tr><tr><td>Metal spatula</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z511455-1PAK</td><td>Brain dissection tools</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>89031-954</td><td>Brain dissection tools</td></tr><tr><td>Brain Slice Keeper-4</td><td>Automate Scientific</td><td>S-BSK4</td><td>brain slice holding chamber</td></tr><tr><td>nylon netting&amp;nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0198</td><td>For building small slice recovery chambers</td></tr><tr><td>Pyrex glass beakers (250 mL)</td><td>VWR</td><td>89090-434</td><td>For building small slice recovery chambers</td></tr><tr><td>35 mm plastic dish, round</td><td>VWR</td><td>100488-376</td><td>For building small slice recovery chambers</td></tr><tr><td>Gas diffuser stones (10 &amp;micro;m)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59277</td><td>For constant carbogenation (fine bubbles)</td></tr><tr><td>Agarose Type I-B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0576</td><td>For embedding brain specimens</td></tr><tr><td>Micro loader tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491229</td><td>For filling patch clamp electrodes</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>VWR</td><td>102092-312</td><td>For making a custom dissecting platform</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>For pH adjustment of media</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465-25G</td><td>For pH adjustment of media</td></tr><tr><td>Potassium Hydroxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473</td><td>For pH adjustment of media</td></tr><tr><td>Plastic transfer pipets 3 mL graduated</td><td>VWR</td><td>89497-676</td><td>For slice transfer</td></tr><tr><td>Zirconium ceramic injector blades</td><td>Cadence Specialty Blades</td><td>EF-INZ10</td><td>http://cadenceinc.com/</td></tr><tr><td>KG-33 borosilicate glass capillary w/filament</td><td>King Glass Company</td><td>custom quote</td><td>ID: 0.87mm, OD 1.50mm</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4261</td><td>Intern pipette solution</td></tr><tr><td>Phosphocreatine disodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td>Intern pipette solution</td></tr><tr><td>Potassium Gluconate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4500-100G</td><td>Intern pipette solution</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Intern pipette solution</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9187</td><td>Intern pipette solution</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-GTP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51120</td><td>Intern pipette solution</td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td>Intern pipette solution</td></tr><tr><td>Heated water bath (2.5L)</td><td>VWR</td><td>13491-060</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>Filter paper rounds</td><td>VWR</td><td>28456-022</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue</td><td>Amazon</td><td>B000BQRBO6</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>Glass petri dish</td><td>VWR</td><td>89000-326</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>10X Phosphate buffered saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>30 mL syringes</td><td>VWR</td><td>BD302832</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>1 mL syringes</td><td>VWR</td><td>BD-309628</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>25 5/8 gauge needles</td><td>VWR</td><td>89219-292</td><td>Miscellaneous</td></tr><tr><td>Thermomixer (w/1.5 mL tube block)</td><td>VWR</td><td>89232-908</td><td>To keep agarose molten&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

preparation of acute brain slices using an optimized n-methyl-d-glucamine protective recovery method

このプロトコルはNへの実用的なガイド-メチル-D-glucamine (NMDG) 保護回復法脳スライス標本。多くの最近の研究は、神経保存と全体的な脳スライスの生存率を高めるためのこの方法の有用性を検証しました。早期導入によるこの技術の実装は、脳機能を実験的、多様なアプリケーションを使用して、動物の年齢、脳領域、および細胞のタイプの広い範囲にわたる詳細な調査を促進しています。NMDG 人工髄液 (アプライド) メディアの最適化された定式化と強化されたプロシージャを使用して確実に入手できるパッチ クランプ電気生理学のための健康な脳スライス保護回復脳スライス技術を実施するための手順のとおりです。この更新方法は、速度の大幅な改善が観察され、gigaohm の信頼性シール対象パッチク ランプ優れた神経保存、それにより挑戦的な促進を維持しながら実験を記録中に形成実験アプリケーション。代表的な結果は、若い大人のトランスジェニック マウスと成熟した大人の人間脳神経外科標本から調製した新皮質脳スライスのシナプス接続多ニューロン パッチク ランプを試金する実験の記録から提供されています。さらに、脳スライスの最適化された NMDG 保護回復法はこのように独自の方法論の限界を解決する少年と成人の両方の動物と互換性が。要約すると、様々 な種や優れた生存率および組織の保全を達成するために年齢の間で 1 つのメディアの定式化と脳スライス手順を実装できます。

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Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

このプロトコルは、最適化されたNの実装方法を示します-メチル-D-glucamine (NMDG) 保護回復法脳スライス標本。1 つのメディアの定式化は、確実にあらゆる年齢層の様々 な実験用の動物から健康な脳のスライスを取得する使用されます。

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

preparation-acute-brain-slices-using-an-optimized-n-methyl-d

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

46.1K ビュー.  Allen Institute for Brain Science. このプロトコルは、最適化されたNの実装方法を示します-メチル-D-glucamine (NMDG) 保護回復法脳スライス標本。1 つのメディアの定式化は、確実にあらゆる年齢層の様々 な実験用の動物から健康な脳のスライスを取得する使用されます。

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Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by development of effective, easy to administer and safe preconditioning treatments. We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. Low-level pro-inflammatory mediator signaling changes over time are essential for cold-preconditioning neuroprotection. This signaling is consistent with the basic tenets of physiological conditioning hormesis, which require that irritative stimuli reach a threshold magnitude with sufficient time for adaptation to the stimuli for protection to become evident.
Accordingly, delineation of the immune signaling involved in cold-preconditioning neuroprotection requires that biological systems and experimental manipulations plus technical capacities are highly reproducible and sensitive. Our approach is to use hippocampal slice cultures as an in vitro model that closely reflects their in vivo counterparts with multi-synaptic neural networks influenced by mature and quiescent macroglia / microglia. This glial state is particularly important for microglia since they are the principal source of cytokines, which are operative in the femtomolar range. Also, slice cultures can be maintained in vitro for several weeks, which is sufficient time to evoke activating stimuli and assess adaptive responses. Finally, environmental conditions can be accurately controlled using slice cultures so that cytokine signaling of cold-preconditioning can be measured, mimicked, and modulated to dissect the critical node aspects. Cytokine signaling system analyses require the use of sensitive and reproducible multiplexed techniques. We use quantitative PCR for TNF-&alpha; to screen for microglial activation followed by quantitative real-time qPCR array screening to assess tissue-wide cytokine changes. The latter is a most sensitive and reproducible means to measure multiple cytokine system signaling changes simultaneously. Significant changes are confirmed with targeted qPCR and then protein detection. We probe for tissue-based cytokine protein changes using multiplexed microsphere flow cytometric assays using Luminex technology. Cell-specific cytokine production is determined with double-label immunohistochemistry. Taken together, this brain tissue preparation and style of use, coupled to the suggested investigative strategies, may be an optimal approach for identifying potential targets for the development of novel therapeutics that could mimic the advantages of cold-preconditioning.

We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. We present strategies for such work that require biological systems, experimental manipulations plus technical capacities that are highly reproducible and sensitive.

コー​​ルド - プレコンディショニングによる神経保護の研究のための戦略

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by ...

神経科学

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

脳虚血に対する酸性ポストコンディショニングの神経保護を研究するための実験モデル

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

ATP または急性脳スライスにおけるセロトニンに対するミクログリアのプロセスの魅力の二光子励起イメージング

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly useful for disorders in which identifiable neuronal circuitry plays a key role, such as epilepsy and movement disorders. Currently available surgical modalities, while effective, generally involve an invasive surgical procedure, which can result in surgical injury to non-target tissues. Consequently, it would be of value to expand the range of surgical approaches to include a technique that is both non-invasive and neurotoxic.
Here, a method is presented for producing focal, neuronal lesions in the brain in a non-invasive manner. This approach utilizes low-intensity focused ultrasound together with intravenous microbubbles to transiently and focally open the Blood Brain Barrier (BBB). The period of transient BBB opening is then exploited to focally deliver a systemically administered neurotoxin to a targeted brain area. The neurotoxin quinolinic acid (QA) is normally BBB-impermeable, and is well-tolerated when administered intraperitoneally or intravenously. However, when QA gains direct access to brain tissue, it is toxic to the neurons. This method has been used in rats and mice to target specific brain regions. Immediately after MRgFUS, successful opening of the BBB is confirmed using contrast enhanced T1-weighted imaging. After the procedure, T2 imaging shows injury restricted to the targeted area of the brain and the loss of neurons in the targeted area can be confirmed post-mortem utilizing histological techniques. Notably, animals injected with saline rather than QA do demonstrate opening of the BBB, but dot not exhibit injury or neuronal loss. This method, termed Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery (PING) could provide a non-invasive approach for treating neurological disorders associated with disturbances in neural circuitry.

The goal of the protocol is to provide a method for producing non-invasive neuronal lesions in the brain. The method utilizes Magnetic Resonance-guided Focused Ultrasound (MRgFUS) to open the Blood Brain Barrier in a transient and focal manner, in order to deliver a circulating neurotoxin to the brain parenchyma.

脳回路の非侵襲的切断に対する標的ニューロン損傷

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

成虫マウスおよび老化マウスからの海馬スライスにおける低酸素症の最小化

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

<meta charset="utf8"></head><body>成虫のげっ歯類の海馬の背極からの急性脳スライスの準備

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

成虫のげっ歯類の海馬の背極からの急性脳スライスの準備

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

マウス脳の水平海馬スライス

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Preparation of Acute Slices from Dorsal Hippocampus for Whole-Cell Recording and Neuronal Reconstruction in the Dentate Gyrus of Adult Mice

Although the general architecture of the hippocampus is similar along its longitudinal axis, recent studies have revealed prominent differences in molecular, anatomical and functional criteria suggesting a division into different sub-circuits along its rostro-caudal extent. Owing to differential connectivity and function the most fundamental distinction is made between the dorsal and the ventral hippocampus, which are preferentially involved in spatial and emotional processing, respectively. Accordingly, in vivo work regarding spatial memory formation has focused on the dorsal hippocampus.
In contrast, electro-physiological in vitro recordings have been preferentially performed on intermediate-ventral hippocampus, largely motivated by factors like slice viability and circuit integrity. To allow for direct correlation of in vivo data on spatial processing with in vitro data we have adapted previous sectioning methods to obtain highly viable transverse brain slices from the dorsal-intermediate hippocampus for long-term recordings of principal cells and interneurons in the dentate gyrus. As spatial behavior is routinely analyzed in adult mice, we have combined this transversal slicing procedure with the use of protective solutions to enhance viability of brain tissue from mature animals. We use this approach for mice of about 3 months of age. The method offers a good alternative to the coronal preparation which is frequently used for in vitro studies on dorsal hippocampus. We compare these two preparations in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

We present a protocol to prepare acute-slices from the dorsal-intermediate hippocampus of mice. We compare this transversal preparation with coronal slicing in terms of quality of recordings and preservation of morphological features of recorded neurons.

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

要約

さらに動画を探す

コールド - プレコンディショニングによる神経保護の研究のための戦略

脳虚血に対する酸性ポストコンディショニングの神経保護を研究するための実験モデル

少量循環、血流 - と水没型チャンバーシステムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

ATP または急性脳スライスにおけるセロトニンに対するミクログリアのプロセスの魅力の二光子励起イメージング

脳回路の非侵襲的切断に対する標的ニューロン損傷

成虫マウスおよび老化マウスからの海馬スライスにおける低酸素症の最小化

成虫のげっ歯類の海馬の背極からの急性脳スライスの準備

成虫のげっ歯類の海馬の背極からの急性脳スライスの準備

マウス脳の水平海馬スライス

成体マウスのデンテート・ジラスにおける全細胞記録と神経再建のための、逆海馬からの急性スライスの作製

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

要約

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コー​​ルド - プレコンディショニングによる神経保護の研究のための戦略

脳虚血に対する酸性ポストコンディショニングの神経保護を研究するための実験モデル

少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

ATP または急性脳スライスにおけるセロトニンに対するミクログリアのプロセスの魅力の二光子励起イメージング

脳回路の非侵襲的切断に対する標的ニューロン損傷

成虫マウスおよび老化マウスからの海馬スライスにおける低酸素症の最小化

成虫のげっ歯類の海馬の背極からの急性脳スライスの準備

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マウス脳の水平海馬スライス

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コールド - プレコンディショニングによる神経保護の研究のための戦略

少量循環、血流 - と水没型チャンバーシステムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録