大戦実施、分析し実験を設計し、原稿を書いていた。D.X. と C.P. 図の準備を支援し、実験を行なった。この作品は、NSFC (31320103906) によって支えられたおよび結核 111 プロジェクト (B16013)

動物は、動物のケアの確立された標準と脳科学研究所と状態キー研究所の医療神経生物学の復旦大学、上海、中国の手順に従って維持されました。
1. ソリューションの準備
注: は、材料の表を参照してください。
<ol>
	<li>(変更された Gey ソリューション) のスライスのバッファーを準備: 92 mM の NaCl、KCl、1.25 mM NaH2PO4、30 mM NaHCO3、2.5 mM 25 mM グルコース、20 mM HEPES、3 mM Na+-ピルビン酸、10 mM MgSO4、および 0.5 mM CaCl2。</li>
	<li>7.6 carbogenation なし 1 M NaOH を使用してに pH を調整します。</li>
	<li>4 ° C でバッファーを保存します。 注: 滴定濁った液体を明らかにします。浸透圧は、305 310 mOsm です。カーボゲン ・21には、5% の二酸化炭素と 95% の酸素が含まれています。</li>
	<li>希釈原液重炭酸、ブドウ糖が含まれていないアプライドの x 10 の最終組成物を与えることで、アプライドの準備: 124 mM の NaCl、2.5 mM KCl、2.5 mM CaCl2、2 mM MgCl2、および 1.25 mM KH2PO4。</li>
	<li>重炭酸塩と 10 mM グルコースと 26 mM NaHCO3に到達するためにグルコースを追加します。</li>
	<li>Carbogenate NaHCO3を追加した直後にブロックされた端と穴あきシリコン チューブを通してアプライド。</li>
	<li>Carbogenating (pH 7.3 7.4) しながら pH を測定します。 注意: バッファー容量は、NaHCO3の量を変えることによって少し調整できます。結果 pH は温度に依存するので動作温度 (例えば、 30 ° C) で carbogenating しながら結果の pH をチェックする必要は。</li>
</ol>
2. 急性海馬スライスの準備
注: は、材料の表を参照してください。
<ol>
	<li>急性脳スライスのインキュベーション室にスライスを保持メッシュを配置、アプライド、28-30 ° C で少なくとも 30 分22 carbogenate (4-6 L/h) とチャンバー</li>
	<li>2-4 ° c. の下に手術器具をクールします。</li>
	<li>寒さとバッファー (2-4 ° C)、vibratome の近くの氷/水混合物の維持をスライス carbogenated ガラス ビーカーを置きます。</li>
	<li>ラットやマウスの麻酔まで角膜反射が消える (30-50 s) 500 μ L を勘案し 2 L ガラス瓶または 50 mL のチューブに 12.5 μ L イソフルランを使用します。</li>
	<li>説明し、マティスらの著書・論文で詳細に可視化法を用いた脳を分離します。(2011 年)23 日宗門ら(2014)24。</li>
	<li>小脳の解剖と半球を分ける前に (少なくとも 2 分) の冷たいスライス バッファーに 2-4 ° C まで脳を冷やします。</li>
	<li>図 1Cに示すように腹と海馬の中間部分から横スライスを取得するのに各半球の25の背側縁に沿って 70 ° の角度で背側皮質の部分を解剖するのに冷たい外科ブレードを使用します。E。</li>
	<li>冷たい歯科用セメントへらで、フィルター ペーパーで簡潔に作成された表面 (1 〜 2 秒) を乾燥する部分に半球を転送します。</li>
	<li>速効性の接着剤; を使用して冷たいスライス プラットフォームで新鮮なカット面をもつ 2 つの半球をマウントします。半球顔かみそりの刃 (図 1D) の尾の端を持っています。</li>
	<li>スライスのプラットフォームを vibratome の冷却室に置き、スライスのバッファー (2-4 ° C) とその部屋を埋めます。Carbogenate 穴あきシリコン チューブを使用しています。</li>
	<li>適切な vibratome 設定を使用して 350 μ m のスライス カット (例えば、ブレード前方速度: 1.2 mm/s、ブレード振幅: 1 mm)。</li>
	<li>Subiculum と 2 つの注入カニューレを使用して嗅皮質から海馬を分離 (&#62; 28 G) はさみとして。</li>
	<li>パスツール ピペットを使用して事前に準備された培養室のスライスを保持メッシュから泡を削除します。</li>
	<li>スライス スライスのプラットフォームから地層属三角骨にいくつかの透明性は、インキュベーション室のメッシュに転送します。任意の折りたたみ、ストレッチ、重複、および大きな口パスツール ピペットにアプライドとスライスを吸引によって浮動を回避します。 メモ: 全体の手順 (手順 2.5 2.14) がかかる 5-10 分。したがって、4 ° C で維持するために時間をかけて緩衝液の温度をチェックすることが重要です。</li>
	<li>インキュベーション室に少なくとも 1.5-2 時間 30 ° C でスライスをインキュベートし、4-6 L/h でカーボゲン ・を提供します。 注: は、インキュベーター内のバッファーを循環するが、浮遊からのスライスを防ぐカーボゲン ・流量を調整します。</li>
</ol>
3. 変更、アプライドの Carbogenation の小さな貯水池のリサイクル
<ol>
	<li>リサイクル システム (図 2B) の流出に 3 ウェイ チューブ コネクタを追加します。</li>
	<li>カーボゲン ・供給管と 3 ウェイ チューブ コネクタの中間の腕を接続し、エアフロー メーター (図 2Dと図 4C3-4 L/h) と流量を調節します。</li>
	<li>リサイクル システムの流入に 2 番目の 3 ウェイ チューブ コネクタを追加します。中間の腕を貯水池 (低域通過フィルターから流入管インライン ヒーター、薄いシリコン チューブ (10 cm) にアッパー アームとロアアームに直面する管に接続します。図 4C)。</li>
	<li>薄いシリコン チューブにチューブ絞りを配置 (OD: 2 mm) 蠕動ポンプによって生成されたスライス チャンバーでアプライドの脈動が、最低は管に沿って位置に。 注: 流出-carbogenation (流出-炭水化物) 変更はアプライド貯水池、リサイクル率、アプライドのボリュームに carbogenation レベルの感受性を減らすと小さなアプライド貯水池内に相対的なチューブを配置 (&#60; 50 mL。図 3)。低域通過フィルターに関する薄膜シリコン チューブで空気量削減アプライドの流れの脈動したがって、空気とほとんどチューブを満たす必要があります。</li>
</ol>
4。水没スライス チャンバー内シナプス応答の記録
注: は、材料の表を参照してください。
<ol>
	<li>あらかじめ約 28-30 ° c に (これは、気泡の録音室を防止) 水浴のアプライド解決を暖めます。</li>
	<li>リサイクル システム (4-5 mL/分) を開始し、少なくとも 1 時間のためのシステムを平衡にインライン ヒーターをアクティブにします。</li>
	<li>レンズ クリーニング ペーパーと数分 (図 4) 水没スライス チャンバーで U 字白金線に固定ナイロン メッシュの小片を presoak します。</li>
	<li>U 字白金線を削除します。</li>
	<li>リサイクル電源、レンズ クリーニング ペーパーのスライスを配置します。</li>
	<li>すぐにスライスの上にスライスを保持メッシュを配置し、ポンプのスイッチ、目的をくずさず、アプライドに 30 分間平衡スライス。</li>
	<li>アプライドとホウケイ酸塩のマイクロ ピペット (すなわち、記録電極) を記入 (先端抵抗: 1 2 MΩ いっぱいアプライドで 1/3)、ピペット ホルダーにマウントします。</li>
	<li>NaHCO3ソリューションにそれを置くことによって金属刺激電極の絶縁体をチェック (&#62; 40 mM)。DC 電圧のマイナス極に、電極を接続 (1-2 V、肯定的な棒: 銀やプラチナ ワイヤ)、解剖顕微鏡の下で先端に泡の形成を観察して (&#62; 60 倍の倍率)。</li>
	<li>マニピュレーター ホルダー内テスト エポキシ絶縁タングステン刺激電極を置き、スライス チャンバーでワイヤを参照。</li>
	<li>室に 2 番目参照電極を追加し、記録電極 (図 4A) のパッチアンプ用アダプターの参照のソケットに接続します。</li>
	<li>アンプ コントロール ソフトウェアの「ゼロ ・ クランプ」ボックスをクリックし、「出力ゲイン一覧」ボックスをダブルクリックして進みます。ゲインを選択「100」の"ハイパス フィルター リスト ボックスのダブルクリック (ベッセル)」「0.1 Hz"を選択し、"ローパス フィルター リスト ボックスをダブルクリック (AC)」「3 kHz」を選択するには</li>
	<li>レコーディング ソフトウェアでクリックしてで「取得 |プロトコルを開きます。"エピソードの録音の開始後 10 ms を刺激アイソレータ トリガー設定が自動的に間欠的刺激と 50-100 ms の 10-20 kHz で増幅された電位のデジタル化を可能にするプロトコルを選択します。</li>
	<li>ラインと属地層三角骨、たとえば (図 4および図 5) に平行に刺激と記録電極を配置します。</li>
	<li>クリックして"取得 |プロトコルを編集"し (ポップアップ ウィンドウ) の「トリガー」タブを選択します。トリガ ・ ソースとして「トリガ ・ ソース」ボックスと「スペースバー」を選択をクリックします。「OK」ボタンををクリックしてします。集録を開始し、トリガー ボタンでポップアップ ウィンドウを注意してください「レコード」ボタンをクリックします。</li>
	<li>刺激アイソレータ ソフトウェアで「電圧制御」ボックスをクリックし、、"0"を入力してください。「ダウンロード」ボタンををクリックしてします。「ソフトウェアを記録」ウィンドウをクリックし、スペース バーを押します。「電圧制御」ボックスの 1 mV ステップには 1 から 8、たとえば、値を入力順にしてこのサイクルを繰り返します。</li>
	<li>FEPSP 勾配値と刺激強度の相関、fEPSP 斜面の 40% の最大値を得るために必要な刺激の強度を決定します。「電圧制御ボックス」をクリックし、、確定値を入力します。「ダウンロード」ボタンををクリックしてします。 メモ: 刺激アイソレータは、脳組織に簡単な電圧または電流パルスを適用する使用されます。二相パルスは、フェーズごとに 100 μ 秒を持つことができます。</li>
	<li>レコーディング ソフトウェアで停止ボタンをクリックし、「獲得」メニューをクリックしてします。「プロトコルを編集」をクリックし、ポップアップ ウィンドウに"トリガー"タブを選択します。トリガ ・ ソースとしてトリガー ソース ボックスと「内部タイマー」を選択をクリックします。「OK」ボタンををクリックしてします。すべて 30 フィールド電位の自動記録を開始レコード ボタンをクリックしてたとえば s。30-60 分後に、"stop"ボタンをクリックします。</li>
	<li>「取得」メニューをクリックし、「オープンなプロトコル、」をクリックして、シナプス可塑性の誘導が必要なプロトコルを選択し、"OK"ボタンをクリックしますします。高頻度刺激と記録を自動的にアクティブに「レコード」ボタンをクリックします。「停止」ボタンををクリックしてします。 注: シナプス可塑性に関連する調査、場合長期増強や長期ベースライン録音後の長期不況の標準誘導パラダイムの一つを適用します。図 7と図 8にシナプス伝達の変調の代表例を示します。</li>
	<li>レコーディング ソフトウェアでクリックして"取得 |プロトコルを開き」、ステップ 4.12 のように同じプロトコルを選択します。"OK"ボタンをクリックし、「記録」をクリックたとえば、2-4 時間フィールドの潜在的な録音を自動的に実行してください。録音を終了する"stop"ボタンをクリックします。</li>
	<li>化合物を適用医薬品研究の場合直接、アプライドに貯水池恒久的な化合物の管理がある場合希望 (図 6)。</li>
</ol>
5. セットアップとヒントをクリーニング
メモ: 以下の一般的なヒントをください。
<ol>
	<li>毎週 10% H2O2脱イオン H2o. 洗浄後 20 分以上をリサイクルしてシステムをきれい 注: エタノールはクリーニングのため推奨されません。同様に、参照線と H2O2で目的を浸すことは推奨していません。</li>
	<li>対物レンズまたは 0.1 N HCl、水とチャンバ周囲の表面に沈殿した塩を削除します。</li>
	<li>蒸留水または 0.1 N HCl でカーボゲン ・ バブラーを洗います。</li>
	<li>10% H2O2 5 分でスライス培養室に週に一度を浸すし、脱イオン H2o ・ インキュベーション室を徹底的にリンス</li>
	<li>金属刺激電極の場合各実験後脱イオン水で刺激電極先端部を洗うし、残留組織を除去し、エタノールに浸した綿球で刺激電極先端部を軽く拭きます。</li>
	<li>サンドペーパーで慎重な強打を先端の断熱材を削除することによって商業金属刺激電極の抵抗を減らします。</li>
	<li>ポリテトラフルオロ エチレン チューブとシリコン チューブを取り付け、チューブをリサイクルしながら、アプライドからカーボゲン ・の損失を減らします。</li>
	<li>線材表面に塩化銀のフォームに漂白剤で数日間記録電極と参照電極の銀線を維持します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>McIlwain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+response+in+vitro+to+electrical+stimulation+of+sections+of+mammalian+brain.">Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain.</a> Biochem J. 48 (4), (1951).</li><li>McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. 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(103), (2015).</li><li>Du, H., Lin, J., Zuercher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+efficiency+of+CO2+injection+into+seawater+by+a+venturi+than+a+conventional+diffuser+system.">Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system.</a> Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).</li><li>Weinman, J., Mahler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Analysis+of+Electrical+Properties+of+Metal+Electrodes.">An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes.</a> Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).</li><li>Fanselow, M. S., Dong, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+the+dorsal+and+ventral+hippocampus+functionally+distinct+structures.">Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures.</a> Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+BDNF-gene+transcripts+with+short+3'+UTR+in+hippocampal+CA1+neurons+improves+memory+formation+and+enhances+synaptic+plasticity-relevant+signaling+pathways.">Translation of BDNF-gene transcripts with short 3' UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways.</a> Neurobiol Learn Mem. , (2016).</li></ol>

著者らは、調査した潜在的な利益相反として解釈される可能性が商業や金融関係の不在を宣言します。

インターフェイス スライス室より堅牢なシナプス応答25,26,27,28の展示物、水没室提供パッチ ・ クランプ記録および蛍光追加の利便性イメージング。したがって、我々 はフィールド ニューロン17,18、蛍光プローブのイメージングに簡単に拡張するこ...

1951 年に初めて報告した急性期脳スライス実験は実施1.梨状皮質2,3海馬ニューロンが海馬の4、1 つの septotemporal 軸に沿って横相互接続されて検出から成功体外録音後の 1971 年に、海馬神経活動の最初の in vitroの録音は達成5だった生体内および生体外での条件の下でニューロンの神経生理学的または neurostructural パラメーターの類似性はまだいくつかの討論の6件名が、1975 年に Schwartzkroin7ことが示された基底神経細胞の特性は体外で維持され、その高周波刺激 (すなわちtetanization) 海馬における求心性神経のシナプス電位8の長期的な円滑化を誘導します。記録神経活動の電気生理学的体外大幅拡大活動依存的シナプス可塑性9,10至福によって 1973 年に発見されていた細胞のメカニズムの研究ら11 生体内で実験ウサギ。
神経細胞の活動やシグナル伝達経路脳スライスで、特に急性海馬スライスの研究は今標準的なツールです。しかし、驚いたことに、体外実験があるまだ標準化される準備や急性海馬スライスのメンテナンスのために存在する複数のアプローチによっても明らかなようリードら(1988 年)12は、急性脳スライス スライス チャンバーの種類と入浴中、pH、温度、酸素のレベルの選択肢でのメンテナンスの方法論的課題を検討しました。これらのパラメーターは、まだスライス記録のセットアップの in vitroのカスタムメイドの要素のための記録室の制御が困難です。可能性があります問題の克服にいくつかの方法論的課題と説明水没スライス チェンバース、間質性の 3 D microperfusion システム13、強化された層流と酸素室などの新しいタイプの出版物を見つけることができます。14、コンピューター化された温度コントロール15システム、マルチチャンバ記録システム16を供給します。これらの部屋は簡単に構築できないので、ほとんどの科学者は市販のスライスの部屋に依存します。これらの部屋は、こうして電気生理学および蛍光イメージングの17,18,19の組み合わせを可能にする顕微鏡システムにマウントできます。以来、これらの部屋は、人工髄液 (アプライド) に沈んで脳スライスを維持、新薬承認申請の費用を増加緩衝液の流量を維持する必要があります。このため、流出 carbogenation 比較的小さいアプライド ボリュームを使用して浸漬スライス チャンバー内電位長時間記録の十分な安定性を提供するリサイクル灌流システムを組み込みました。さらに、我々 は活動依存的シナプス可塑性10の結果に影響を与えるこの実験的 carbogenation/灌流システムを使用し、どの真核伸長因子 2 キナーゼ (eEF2K) の抑制を調節するシナプスを要約伝送20。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents required&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, China</td><td>10019318</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, China</td><td>10016318</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, China</td><td>10017618</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, China</td><td>10012818</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, China</td><td>10005861</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, China</td><td>10018960</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, China</td><td>10010518</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, China</td><td>20040718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma</td><td>A4043</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, China</td><td>20025118</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Chemical Reagent, China</td><td>10019718</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tools and materials for dissection&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decapitators</td><td>Harvard apparatus</td><td>55-0012</td><td>for rat decapitation</td></tr><tr><td>Bandage Scissors</td><td>SCHREIBER</td><td>12-4227</td><td>for mouse decapitation</td></tr><tr><td>double-edge blade</td><td>Flying Eagle, China</td><td>74-C</td><td></td></tr><tr><td>IRIS Scissors</td><td>RWD, China</td><td>S12003-09</td><td></td></tr><tr><td>Bone Rongeurs</td><td>RWD, China</td><td>S22002-14</td><td></td></tr><tr><td>Spoon</td><td>Hammacher&amp;nbsp;</td><td>HSN 152-13</td><td></td></tr><tr><td>dental cement spatula</td><td>Hammacher&amp;nbsp;</td><td>HSN 016-15</td><td></td></tr><tr><td>dental double end excavator</td><td>Blacksmith Surgical, USA</td><td>BS-415-017</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating Microtome</td><td>Leica, Germany</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>surgical blade&amp;nbsp;</td><td>RWD, China</td><td>S31023-02</td><td></td></tr><tr><td>surgical holder</td><td>RWD, China</td><td>S32007-14</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Electrophysiology equipment and materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vertical Pipette Puller</td><td>Narishige, Japan</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Vibration isolation table</td><td>Meirits, Japan</td><td>ADZ-A0806</td><td></td></tr><tr><td>submerged type recording chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26GLP</td><td></td></tr><tr><td>4 Axis Micromanipulator</td><td>Sutter, USA</td><td>MP-285, MP-225</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Wire</td><td>World Precision Instruments</td><td>PTP406</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Data Acquisition System</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Anaysis software</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Clampex 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Microscope</td><td>Nikon, Japan</td><td>FN1</td><td></td></tr><tr><td>LED light source</td><td>Lumen Dynamics Group, Canada</td><td>X-cite 120LED</td><td></td></tr><tr><td>micropipettes</td><td>Harvard apparatus</td><td>GC150TF</td><td>extracelluar recording</td></tr><tr><td>borosilicate micropipettes</td><td>Sutter, USA</td><td>BF150-86</td><td>patch clamp</td></tr><tr><td>tungsten electrode</td><td>A-M Systems, USA</td><td>575500</td><td></td></tr><tr><td>peristaltic pump</td><td>Longer, China</td><td>BT00-300T</td><td></td></tr><tr><td>tubes for peristaltic pump</td><td>ISMATEC, Wertheim, Germany</td><td>SC0309</td><td>1x inflow, ID: 1.02 mm</td></tr><tr><td>tubes for peristaltic pump</td><td>ISMATEC, Wertheim, Germany</td><td>SC0319</td><td>2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>PCO, Germany</td><td>pco.edge sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>lens cleaning paper</td><td>Kodak</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Prechamber</td><td>Warner Instruments</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>Inline heater</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system

脳スライスの実験は 1951 年以来使用されている、にもかかわらず、フィールドや潜在的な細胞内の録音を実行するとき、シナプス伝達の変調の安定した、成功した分析を達成するための確率を低減問題が残っています。この原稿は、急性脳スライスの維持のため、市販の水没商工会議所における興奮性シナプス後電位を記録するための実験条件の改善に役立つ可能性のある方法論的側面をについて説明します流出 carbogenation 付け。流出 carbogenation は、薬物実験のコスト効率を高めるために小さなバッファー貯留層の循環依存の実験で酸素レベルを安定させるのに役立ちます。さらに、原稿はシナプス伝達の活動依存的シナプス可塑性に及ぼす異なる carbogenation モードと刺激パラダイムを調べる代表的な実験を紹介します。

プロトコル セクションの男性 c57bl/6 マウスとラット (5-8 週間) の海馬 (図 1) の腹側と中間部分から急性海馬スライスの作製について述べる。スライサー プラットフォーム上半球の位置は、安定を保つのに役立ち、寒天やアガロースと安定化の必要性を削除します。灌流システム自体は液体の必要流量を与えるため高回転で作動、ペリスタルティ...

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Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

このプロトコルでは、再生バッファーの量が少ないと水中急性海馬スライスにおける活性依存性シナプス可塑性を記録の方法論的側面の酸素レベルの安定化について説明します。

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

recording-synaptic-plasticity-acute-hippocampal-slices-maintained

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.5K ビュー.  Fudan University. このプロトコルでは、再生バッファーの量が少ないと水中急性海馬スライスにおける活性依存性シナプス可塑性を記録の方法論的側面の酸素レベルの安定化について説明します。

ビデオ: Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

老化とアミロイド病理の間にシナプス変化の研究のためのラットおよびトランスジェニックマウスからの急性海馬スライスの準備

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

神経科学

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory encoding. LTP elicited in the CA1 region of acute hippocampal slices has been extensively studied. However the molecular mechanisms underlying the maintenance phase of this phenomenon are still poorly understood. This could be partly due to the various experimental conditions used by different laboratories. Indeed, the maintenance phase of LTP is strongly dependent on external parameters like oxygenation, temperature and humidity. It is also dependent on internal parameters like orientation of the slicing plane and slice viability after dissection.
The optimization of all these parameters enables the induction of a very reproducible and very stable long-term potentiation. This methodology offers the possibility to further explore the molecular mechanisms involved in the stable increase in synaptic strength in hippocampal slices. It also highlights the importance of experimental conditions in in vitro investigation of neurophysiological phenomena.

This paper presents a complete methodology to prepare and preserve in vitro acute hippocampal slices from adult mice. This protocol allows the recording of very stable long-lasting long-term potentiation (LTP) for more than 8 hours with a success rate of 95%.

長期増強の非常に安定しており、再現性録音のための改良された準備と海馬マウススライスの保全

Long-term potentiation (LTP) is a type of synaptic plasticity characterized by an increase in synaptic strength and believed to be involved in memory ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity is achieved in neurons within a specific time frame. These long-term plasticity-related processes are the leading candidate models to study the basis of memory formation and persistence at the cellular level. Both STC and cross-tagging involve two serial processes: (1) setting of the synaptic tag as triggered by a specific pattern of stimulation, and (2) synaptic capture, whereby the synaptic tag interacts with newly synthesized plasticity-related proteins (PRPs). Much of the understanding about the concepts of STC and cross-tagging arises from the studies done in CA1 region of the hippocampus and because of the technical complexity many of the laboratories are still unable to study these processes. Experimental conditions for the preparation of hippocampal slices and the recording of stable late-LTP/LTD are extremely important to study synaptic tagging/cross-tagging. This video article describes the experimental procedures to study long-term plasticity processes such as STC and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using stable, long-term field-potential recordings from acute hippocampal slices of rats.

This video article describes experimental procedures to study long-term plasticity and its associative processes such as synaptic tagging, capture and cross-tagging in the CA1 pyramidal neurons using acute hippocampal slices from rodents.

げっ歯類からの急性海馬スライスを用いて、シナプスタグ付け/キャプチャとクロス捕獲調査

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Investigating Long-term Synaptic Plasticity in Interlamellar Hippocampus CA1 by Electrophysiological Field Recording

The study of synaptic plasticity in the hippocampus has focused on the use of the CA3-CA1 lamellar network. Less attention has been given to the longitudinal interlamellar CA1-CA1 network. Recently however, an associational connection between CA1-CA1 pyramidal neurons has been shown. Therefore, there is the need to investigate whether the longitudinal interlamellar CA1-CA1 network of the hippocampus supports synaptic plasticity.
We designed a protocol to investigate the presence or absence of long-term synaptic plasticity in the interlamellar hippocampal CA1 network using electrophysiological field recordings both in vivo and in vitro. For in vivo extracellular field recordings, the recording and stimulation electrodes were placed in a septal-temporal axis of the dorsal hippocampus at a longitudinal angle, to evoke field excitatory postsynaptic potentials. For in vitro extracellular field recordings, hippocampal longitudinal slices were cut parallel to the septal-temporal plane. Recording and stimulation electrodes were placed in the stratum oriens (S.O) and the stratum radiatum (S.R) of the hippocampus along the longitudinal axis. This enabled us to investigate the directional and layer specificity of evoked excitatory postsynaptic potentials. Already established protocols were used to induce long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) both in vivo and in vitro. Our results demonstrated that the longitudinal interlamellar CA1 network supports N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor-dependent long-term potentiation (LTP) with no directional or layer specificity. The interlamellar network, however, in contrast to the transverse lamellar network, did not present with any significant long-term depression (LTD).

We used recording and stimulation electrodes in longitudinal hippocampal brain slices and longitudinally positioned recording and stimulation electrodes in the dorsal hippocampus in vivo to evoke extracellular postsynaptic potentials and demonstrate long-term synaptic plasticity along the longitudinal interlamellar CA1.

電気生理学的フィールド記録によるインターラメラ海馬CA1における長期シナプス可塑性の調査

The study of synaptic plasticity in the hippocampus has focused on the use of the CA3-CA1 lamellar network. Less attention has been given to the ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

電気生理学的記録のための急性ヒト海馬スライスの調製

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

急性マウス脳スライスによる、海馬ネットワーク活動の調査

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Recording of Local Field Potential in Mouse Hippocampal-Entorhinal Cortex Slices

Source: Whitebirch, A. C. <a href="https://app.jove.com/v/61704">Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity.</a> J. Vis. Exp. (2020)
The video demonstrates a procedure to record the local field potential (LFP) in mouse hippocampal-entorhinal cortex slices. Electrical stimulation is provided at the CA3 stratum radiatum of the hippocampus, which causes changes in the postsynaptic potential at the CA1 stratum pyramidale. The combined change in the membrane potential of CA1 neurons, termed the local field potential, is recorded.

マウス海馬-内膜皮質スライスにおける局所電界電位の記録

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Transcardial perfusion

	Suspend ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Recording Neuronal Field Excitatory Postsynaptic Potentials in Acute Hippocampal Slices

Source: Weng, W., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55936">Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the procedure for setting up a brain slice in a submersion chamber to record synaptic activity. The process involves securing the slice on lens paper, maintaining a continuous flow of artificial cerebrospinal fluid (aCSF) to ensure neuronal viability, and accurately positioning the stimulation and recording electrodes relative to a specific brain region of interest. This setup allows for precise monitoring of baseline synaptic activity and the effects of electrical stimulation.

少量循環、血流 - と水没型チャンバーシステムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

要約

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老化とアミロイド病理の間にシナプス変化の研究のためのラットおよびトランスジェニックマウスからの急性海馬スライスの準備

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

長期増強の非常に安定しており、再現性録音のための改良された準備と海馬マウススライスの保全

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

げっ歯類からの急性海馬スライスを用いて、シナプスタグ付け/キャプチャとクロス捕獲調査

電気生理学的フィールド記録によるインターラメラ海馬CA1における長期シナプス可塑性の調査

電気生理学的記録のための急性ヒト海馬スライスの調製

急性マウス脳スライスによる、海馬ネットワーク活動の調査

マウス海馬-内膜皮質スライスにおける局所電界電位の記録

急性海馬切片における神経野興奮性シナプス後電位の記録

少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

要約

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老化とアミロイド病理の間にシナプス変化の研究のためのラットおよびトランスジェニックマウスからの急性海馬スライスの準備

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

長期増強の非常に安定しており、再現性録音のための改良された準備と海馬マウススライスの保全

器官型海馬スライスにおけるペア全細胞記録

げっ歯類からの急性海馬スライスを用いて、シナプスタグ付け/キャプチャとクロス捕獲調査

電気生理学的フィールド記録によるインターラメラ海馬CA1における長期シナプス可塑性の調査

電気生理学的記録のための急性ヒト海馬スライスの調製

急性マウス脳スライスによる、海馬ネットワーク活動の調査

マウス海馬-内膜皮質スライスにおける局所電界電位の記録

急性海馬切片における神経野興奮性シナプス後電位の記録

少量循環、血流 - と水没型チャンバーシステムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録