We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).

すべての動物の手順は、動物のケアのローカルガイドラインに従って行いました。本研究の全ての詳細はCECCAPP、フランスの倫理委員会によって承認されました。 ヘキスト染料流出アッセイによるサイドポピュレーション（SP）の1選定<ol><li>ヘキスト33342染料を用いて50万個の細胞を染色します。 <ol><li> 1「ヘキスト」と表示されたチューブと「ヘキストとベラパミル」と表示された1：2 15ミリリットルに円錐形の底部を有する滅菌チューブを準備します。滅菌水で5 mMのベラパミル塩酸塩溶液10mlを準備します。幹細胞の培養培地（CM）を調製します。 <ol><li> 、CSC（CM-CSC）のためのCM​​を調製以下を組み合わせる：ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）：F12（1：3、v：v）によって精製したウシ胎児血清（FCS）を、5％、ヒドロコルチゾンの0.04 mg / Lでペニシリン、ストレプトマイシンを0.1g / L、および20μgの上皮成長因子（EGFR）の/ Lの、100 U / mlです。 </li></ol></li><li>層流フードの下で、細胞をトリプシン処理。秒で洗浄し、メディアを削除terileリン酸緩衝生理食塩水（PBS）と75 cm 2のフラスコのためにトリプシンEDTA 1mlの（は0.5g / L）を添加します。 37℃で3分間インキュベート。親細胞株のために使用される培養培地を添加することによって反応を停止させます。細胞カウンターを用いて細胞数をカウントします。 <ol><li>親細胞株（CM-P）のためのCM​​を調製するために、10％FCS、0.4ミリグラム/ヒドロコルチゾンのL、ペニシリン100 U / mlで、0.1グラム/ Lのストレプトマイシン）を含むDMEMを補います。 </li></ol></li><li> CM-Pで10 7細胞/ mlを得るために、ステップ1.1.2で得られた細胞懸濁液を希釈します。チューブ内のチューブに100μlの（10 6細胞）を入れ、「ヘキストとベラパミル」と4ミリリットル（4×10 7細胞） &quot;ヘキスト」：準備2チューブ中の細胞懸濁液を分割します。 </li><li>サンプル「ヘキストおよびベラパミル」では、5 mMのベラパミル塩酸塩溶液（最終濃度：0.5 mM）の10μlのを追加し、穏やかに混合します。 1グラム/ Lのヘキストの5μlの溶液（：0.1グラム/ Lの最終濃度）を追加します。サンプル＆＃で34;ヘキスト」、10 6個の細胞（200μlの合計）あたり1グラム/ Lのヘキスト溶液5μlを追加するには、今後、アルミ箔を使用して直接光暴露から保護したサンプルを保ちます。 </li><li> 1時間30分間37℃の水浴ですべてのチューブをインキュベートします。沈降から細胞を防止するために、穏やかに15分ごとに混ぜます。 </li><li> 4℃で5分間、250×gで遠心分離管。上清を除去し、1×PBS 2mLで各ペレットを再懸濁します。 </li><li> 4℃で5分間、250×gで遠心分離管。上清を取り除きます。 PBS緩衝液で希釈した5 mg / LのPI 4ml中のPBS緩衝液と「ヘキスト「ペレットで希釈して5 mg / Lのヨウ化プロピジウム（PI）の500μLで再懸濁「ヘキストおよびベラパミル「ペレット。 </li><li>フローサイトメーター上のサンプルの取り込みのためのチューブに単一細胞を凝集物を除去し、収集するために70μmのセルストレーナーを介して試料溶液を転送します。サンプルを氷上に保ち、アルミ箔を使用して直接光の暴露から保護します。 </li></ol></li><li>私細胞選別によってヘキスト色素を除くサイド人口のゾル化。 <ol><li>次のパラメータを使用してソーターフローサイトメトリーヘキスト負の細胞分離を実行します。UVレーザー（355 nm）で、ブルーヘキスト（BPを450/50）と赤ヘキストフィルタ（BPを610/20）とUVレーザーパス上の2の検出器、および2コレクター。 <ol><li>まず、染色およびフローサイトメーターセットアップを流すための陽性対照として役立つサンプル「ヘキスト &quot;を分析します。 </li><li>サイトメーターソフトウェアを使用して、「グローバル・ワークシート」ウィンドウで、「ドットプロット」をクリックします（第五右画像を上）とグローバルワークシート上のグラフを作成します。縦軸に、右クリックで、FSC-A（前方散乱）、横軸に、SSC-A（側方散乱）（ 図1A）を選択します。同様に、SCC-Hドットプロット対SSC-Wを作成します。この第2のドットプロットでは、P1領域を作成するには、「多角形ゲート」（第十四右の写真をトップ）（ 図1B）33 をクリックします。 注：P1領域がします単一細胞を包含し、ダブレットを判別します。 </li><li>オプション：P1にゲートをPI対FSC-Aを作成することにより、PI陽性細胞を除外します。このドットプロットでは、PI陽性の死細胞を排除するために、PI陰性集団（P2）を選​​択します。 </li><li>サイトメーターソフトウェアを使用して、「グローバル・ワークシート」ウィンドウで、「ドットプロット」をクリックして、グローバルワークシート上のグラフを作成します。縦軸に、右クリックで、青ヘキスト-Aを選択し、横軸に、赤ヘキスト-A。人口の上で右クリックすると、「ショーの人口」とP1を選択します。このドットプロットでは、細胞（ 図1C）の主な人口の左側のサイドアームとして表示され、負のヘキスト色素側人口（SP）細胞を選択するための領域（P2）を作成します。 </li></ol></li><li>サンプル「ヘキスト」を分析し、10,000事象を収集します。 SP集団を表すゲートP2は、よく配置されていることを確認するために、サンプルを分析し、「ヘキストおよびベラパミル」（10,000イベント）SPの人口（ 図1D）の消失を観察しました。 </li><li> 1.1.1.1で作製したCM-CSCの1ミリリットルを含む15mlチューブでSPヘキスト染料陰性細胞を収集します。 </li><li> 5分間250×gで細胞選別、遠心分離細胞懸濁液の終わりに、上清を除去し、CM-CSCの1mlでペレットを再懸濁。細胞カウンターを用いて選別された細胞の数を計数し、培養フラスコへの細胞の適切な数を転送する（ 表1参照）。 CM-CSCを加え、37℃、5％CO 2雰囲気中でインキュベートします。 </li><li> 5×10 7細胞（ステップ3、「細胞培養法」を参照）の最小値があるまで2通路の最大のために、同じ条件下で培養中の細胞を維持します。 </li></ol></li></ol>サイド人口ソートにおけるCD44 高 / ALDH 高サブ人口の2セレクション<ol><li> ALDH検出キットおよびCとSP細胞の50万ドルを染色D44抗体。 <ol><li> 「未着色」（管A）、「CD44-APC」（管B）、「IgG1の-APC」（チューブC）、「ALDH」（チューブd）は、「ALDHとDEAB：7 15ミリリットルを次のようにラベルされた滅菌チューブを準備します「（チューブe）は、「ALDHおよびCD44-APC」（チューブf）は、「ALDH、DEABおよびCD44-APC」（チューブグラム）。染色中に4℃で全てのチューブおよび試薬を保管してください。 </li><li> （キットに含まれる）は、バッファ1の4.5ミリリットルとCD44-APC（アロフィコシアニン）抗体（1：100希釈）の45μlの緩衝液Aを準備します。バッファ1の100μlのおよびIgG1-APC抗体の1μlの（1：100希釈）を用いて緩衝液Bを準備します。バッファ1の4ミリリットルとキットの試薬20μlの緩衝液Cを準備します。 </li><li> 10 7細胞/ mlで、以前に選別された細胞（ステップ1.2.5）の細胞懸濁液を準備します。 、BおよびC、ならびに管Fに4ミリリットル（4×10 7細胞）を試験管に100μLの細胞懸濁液（10 6細胞）を加えます。現時点では、チューブのD、E及びグラムで細胞を入れないでください。 </li><li> 5分間250×gで細胞を含むチューブを遠心。上清を除去し、チューブにペレットを再懸濁し、バッファ1の100μl中b及びcチューブeおよびgのジエチルアミノ5μlの（DEAB）、ALDH阻害剤を追加します。 <ol><li> 4ミリリットルの試薬Cと、すぐにF管で細胞を再懸濁し、チューブのD、E及びグラムに100μLを移します。 30分間37℃の水浴ですべてのチューブをインキュベートし、アルミ箔を用いた直接光の暴露から保護します。沈降から細胞を防ぐために15分後にボルテックスで穏やかに細胞懸濁液を混合します。 </li></ol></li><li>この瞬間から、氷上のチューブを保持し、アルミ箔を用いた直接光の暴露から保護しました。遠心分離機4℃で5分間、250×gで全てのチューブ、上清を除去します。 </li><li> 4ミリリットルと他のチューブに緩衝液Bを100μlの緩衝A.再懸濁管cの100μlのとb及びグラムのチューブ、再懸濁チューブfは1インキュベート10分4℃で緩衝液100μlを追加します; C。 </li><li>遠心分離機4℃で5分間、250×gで全てのチューブ、上清を除去します。 4℃で5分間、250×gで再びバッファ1（チューブfの4 ml）及び遠心分離機の1ミリリットルで一回すすいでください。上清を取り除きます。再懸濁4ミリリットルとバッファ1の1ミリリットル中の他のすべてのチューブ内チューブFペレットを。 </li><li>凝集物を除去し、フローサイトメーター上のサンプルの取り込みのために適切なチューブ内の単一細胞を収集するために70μmのセルストレーナーを介して試料溶液を転送します。 </li></ol></li><li>蛍光活性化細胞選別によってCD44 高 / ALDH 高細胞集団の単離。 <ol><li>ブルーレーザー（488 nm）の赤色レーザ（波長633nm）、FITCフィルター（530/30）と青色レーザ経路上の1検出器、1：次のパラメータを使用してフローサイトメトリーソーターのソートCD44 高 / ALDH 高いセルを行いますAPCフィルタ（20分の660）と2コレクターの赤色レーザー経路上の検出器。 </li><li>サイトメーターソフトウェアを使用して、ドットPLO」をクリックしてくださいトン」（第五右上の画像）のセクション1.2.1.2に記載されているように細胞形態をチェックして、SSC-H対SSC-Wで単セルで構成される集団を選択するために、SSCドットプロット対FSC-Aを作成しますドットプロット。 </li><li>サイトメーターソフトウェアを使用して、「グローバル・ワークシート」ウィンドウで、「ドットプロット」をクリックして、グローバルワークシート上のグラフを作成します。縦軸に、右クリックで、二重染色された集団を選択するために、APC-Aと横軸、FITC-A上を選択します。 ALDH 高い細胞（ 図2A）を選択するために、dおよびeチューブを使用してゲートを作成します。注：陽性細胞はDEAB（ 図2B）で処理されたチューブe。で消えます。 <ol><li>同じチャート上では、CD44 high細胞（ 図2Cおよび2D）を選択するために、チューブのb及びcを用いて第2のゲートを作成します。陽性細胞は、IgG1-APCを含むチューブに消えます。 fとgのチューブを分析し、CD44 高 / ALDHを&lt;含まれる第3ゲートを作成SUP&gt; high細胞（ 図2Eおよび2F）。 注：陽性細胞のIgG1-APC（ 図2D）を含む管中に存在する場合、細胞およびAPC染色抗体との間の相互作用は特異的ではありません。 </li></ol></li><li> CM-CSCの1ミリリットルを含む15ミリリットルチューブにCD44 高 / ALDH 高細胞を収集します。 CM 19の1ミリリットルを含む15ミリリットルチューブにも低 CD44 低 / ALDHを収集します。注：ステップ1.1.1.1で説明したようにCM-CSCを準備します。 </li><li> 、5分間250×gで細胞懸濁液を遠心上清を除去し、CM-CSCの1mlでペレットを再懸濁。選別された細胞の数をカウントします。 </li></ol></li></ol> 3.細胞培養法<ol><li>上記のように細胞の二重選別した後、5％CO 2、37℃で、CM-CSCと適切な培養フラスコ（ 表1）に分類された細胞をプレート。 18-24時間後、細胞が付着しているかどうかを確認し、培地を変更します。拡大コロニーが50％コンフルエントより大きくなるまで、3日毎に培地を変更します。 </li><li>培養フラスコから細胞をトリプシン処理するためにEDTA（ 表1） -トリプシン0.5グラム/ Lの適切な量を使用してください。 37℃で細胞を3~5分間インキュベートします。トリプシンの作用を停止するためにCM-CSC（ 表1）の適切な量を追加します。 </li><li>得られた細胞の数をカウントし、CM-CSCと175 cm 2の培養フラスコ中で4×10 5細胞をプレー。 37℃で培養し、5％CO 2。この濃度で、24時間の倍加時間を有する細胞は、7日間で70％コンフルエントになります。 </li><li>彼らは3継代を受けた前に、in vitroおよびin vivo実験のためのCSCを使用してください。 </li></ol>腫瘍の可能性とCSC特性4.確認<ol><li> CD44 高 / ALDHの腫瘍の可能性を確認するために、腫瘍球形成高い細胞。 <ol><li> 3.2で説明したように、細胞をトリプシン処理します。 5分間、250×gで15ミリリットルチューブと遠心分離機に1×10 6個の細胞を追加します。上清を除去し、DMEM中でペレットを再懸濁：F12（3：1）rhEGFのメディアFCS無料、20 ng / mlで、ヘパリンおよび1×B27の4 mg / Lでを。 37℃で6ウェル低足場プレート培養フラスコ中で細胞をインキュベートし、5％CO 2。 注意：使用DMEM：F12（3：1）細胞は、FCSなく成長しない場合、FCSの5％、rhEGFの20 ngの/ mlの、4ヘパリンのmg / Lでかつ1×B27を含む培地。 </li><li> （ 図3A）を播種後4〜10日から光学顕微鏡で腫瘍球形成を観察します。 注：腫瘍球の直径以上35μmであるべきです。 CD44 高 / ALDH 高細胞はCD44 低 / ALDHの低に比べ数と大きさの点でより速く、より強化された腫瘍球形成を表示します。 </li></ol></li><li> in vivoで腫瘍形成能を評価した後NOD-SCIDマウスにおけるCD44 高 / ALDH 高い細胞の皮下注射。 <ol><li>選別後の3つの異なる濃度でPBS中に再懸濁細胞（10 4細胞/ mlで、10 5細胞/ mlで、10 6細胞/ ml）。 6マウスの右側腹部に皮下に10 4細胞/ ml（10 3細胞）の100μLを注入します。 10 5細胞/ ml（10 4細胞）、および10 6細胞/ ml（10 5個の細胞）についても同様にします。 注：10 3個の細胞を試験することができるよりも低い希釈。 </li><li>左脇腹領域にCD44 低 / ALDH low細胞の同じ濃度を注入します。最大10週間モニター注射したマウスは、腫瘍の進行19を参照してくださいします。 </li></ol></li></ol>

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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cell+traits+in+squamospheres+derived+from+primary+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas.">Cancer stem cell traits in squamospheres derived from primary head and neck squamous cell carcinomas.</a> Oral Oncol. 47 (2), 83-91 (2011).</li><li>Yu, Q., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface-localized+matrix+metalloproteinase-9+proteolytically+activates+TGF-beta+and+promotes+tumor+invasion+and+angiogenesis.">Cell surface-localized matrix metalloproteinase-9 proteolytically activates TGF-beta and promotes tumor invasion and angiogenesis.</a> Genes Dev. 14 (2), 163-176 (2000).</li><li>Krishnamurthy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-initiated+signaling+promotes+the+survival+and+self-renewal+of+cancer+stem+cells.">Endothelial cell-initiated signaling promotes the survival and self-renewal of cancer stem cells.</a> Cancer Res. 70 (23), 9969-9978 (2010).</li><li>Chikamatsu, K., Takahashi, G., Sakakura, K., Ferrone, S., Masuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoregulatory+properties+of+CD44++cancer+stem-like+cells+in+squamous+cell+carcinoma+of+the+head+and+neck.">Immunoregulatory properties of CD44+ cancer stem-like cells in squamous cell carcinoma of the head and neck.</a> Head Neck. 33 (2), 208-215 (2011).</li><li>Chen, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cucurbitacin+I+suppressed+stem-like+property+and+enhanced+radiation-induced+apoptosis+in+head+and+neck+squamous+carcinoma--derived+CD44(+)ALDH1(+)+cells.">Cucurbitacin I suppressed stem-like property and enhanced radiation-induced apoptosis in head and neck squamous carcinoma--derived CD44(+)ALDH1(+) cells.</a> Mol Cancer Ther. 9 (11), 2879-2892 (2010).</li><li>Clay, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-marker+identification+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cancer+stem+cells+with+aldehyde+dehydrogenase.">Single-marker identification of head and neck squamous cell carcinoma cancer stem cells with aldehyde dehydrogenase.</a> Head Neck. 32 (9), 1195-1201 (2010).</li><li>Meinelt, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Technical Bulletin: Standardizing Application Setup Across Multiple Flow Cytometers Using BD FACSDiva Version 6 Software. , (2012).</li><li>Zhou, L., Wei, X., Cheng, L., Tian, J., Jiang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+one+of+the+markers+of+cancer+stem+cells+in+Hep-2+cell+line.">CD133, one of the markers of cancer stem cells in Hep-2 cell line.</a> Laryngoscope. 117 (3), 455-460 (2007).</li><li>Fukusumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD10+as+a+novel+marker+of+therapeutic+resistance+and+cancer+stem+cells+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">CD10 as a novel marker of therapeutic resistance and cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Br J Cancer. 111 (3), 506-514 (2014).</li><li>Shen, C., Xiang, M., Nie, C., Hu, H., Ma, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+as+a+molecular+marker+to+screen+cancer+stem+cells+in+hypopharyngeal+cancer.">CD44 as a molecular marker to screen cancer stem cells in hypopharyngeal cancer.</a> Acta Otolaryngol. 133 (11), 1219-1226 (2013).</li><li>Kanojia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+cancer+stem+cells+derived+from+primary+tumors+of+HER2/Neu+transgenic+mice.">Proteomic profiling of cancer stem cells derived from primary tumors of HER2/Neu transgenic mice.</a> Proteomics. 12 (22), 3407-3415 (2012).</li><li>Higgins, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tumor+stem+cell+multipotency+correlates+with+nanog+expression+and+extent+of+passaging+in+human+glioblastoma+xenografts.">Brain tumor stem cell multipotency correlates with nanog expression and extent of passaging in human glioblastoma xenografts.</a> Oncotarget. 4 (5), 792-801 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、他のHNSCC細胞系にも適用可能である特定の細胞株からのCSCの成功を単離するための信頼できる方法を記載しています。孤立した頭と首のCSCは、その後、免疫不全マウス19内移植によるvitroおよび機能的検証のさらなる分子特性に適しています。しかし、いくつかの変更は、サイドポピュレーションまたは親細胞株中に存在するCD44 高 / ALDH 高...

頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）は、世界的に一般的な悪性腫瘍であり、現在の治療法の進歩にもかかわらず、進行した疾患を有する患者は予後不良です。患者の全体の5年生存率は、手術、化学療法、放射線療法及び標的 - 療法を含む治療法の組み合わせにもかかわらず、約30％です。最近の研究では、抗がん治療1次がん幹細胞様細胞（CSCは）の生存に局所再発および遠隔転移を属性。乳房、脳、前立腺、肺、結腸、膵臓、肝臓および皮膚2-含む種々の固形腫瘍における幹細胞の特性（未分化状態、自己再生および分化能力、およびテロメラーゼ活性）を提示する細胞の存在を支持する証拠が蓄積されています10。しかし、CSCをの起源は11,12不明のままです。これらは、正常な幹細胞3,13またはdedifferenの悪性転換から生じ得ますCSCのような機能14,15を獲得する腫瘍細胞のtiation。したがって、CSCをに関連する独特の経路を理解することは耐性HNSCCの早期診断と治療への洞察を提供します。 それのCSCはまた、腫瘍細胞のバルク16〜19と比較し、低酸素ニッチ20内に局在する腫瘍の再発を生じ、標準的な化学療法および放射線療法を回避耐性の表現型を有することが提案されています。多くの要因は、静止の傾向としてのCSCのこれらの抵抗、強化DNA修復、アップレギュレートされ、細胞周期制御機構、及びフリーラジカルスカベンジャー21を説明するために提案されています。また、いくつかの発癌分子経路は、具体的にCSCを17で活性化されてもよいです。さらにターゲット・治療のためのCSCの知識を向上させるために、我々は、中の幹細胞関連マーカーの不均一性のために、のCSCの同定および単離のための信頼できる方法が必要癌22の様々なタイプ。 HNSCCにおいて、幹様腫瘍開始細胞が、そのような薬物排出トランスポーターの発現23と異なるCSCバイオマーカー（CD44 高 、CD24 低 CD133 高 、のc-Met +表現型10,24を発現する細胞を選別することにより、一次患者の腫瘍から単離されています25、またはALDH 高活性26）またはCSC特性を有するsquamospheresを形成するために、主要な患者の腫瘍を栽培。それにもかかわらず、squamospheresの数は、このように、さらなる特徴付けのための小さなサンプルサイズが27を研究して与え、2継代後に劇的に減少します。したがって、十分に確立された細胞株から出発インビトロアッセイのCSCの知識を向上させるために実験を設計するための簡単なソリューションです。 この記事の目的は、マルチパラメトリックフローサイトメトリー分析aを用いHNSCC細胞株からのCSCを単離するための方法を提案することですNDセルソーティング。 ALDH活性を含むいくつかのCSCの特性との相関におけるCD44の発現は、サイドポピュレーション（SP）の表現型、スフェロイド形成能と腫瘍形成を分離したCSCのこのサブ集団を特徴付けるために使用されます。 CD44、細胞表面糖タンパク質は、細胞接着および遊走に関与しています。 CD44は、高度に頭頸部癌モデル29-31を含め、CSCを28多くの固形腫瘍で発現されます。 CD44 low細胞が10できないのに対し、さらに、CD44 高細胞は、in vivo異種の腫瘍を発生させることができます。 SPアッセイは、CSC膜内で過剰発現トランスポータータンパク質のATP結合カセット（ABC）ファミリーを介しヘキスト色素22を流出する細胞の差電位に基づいています。このアッセイでは、対照試料中のベラパミルなどのABCトランスポーター阻害剤の使用を含みます。アルデヒド脱水素酵素（ALDH）は、RETにレチノールの変換に関与する細胞内酵素であります初期の幹細胞の分化25,26の間inoic酸。高いALDH活性ショーHNSCC 26における幹様細胞の挙動およびALDH 高い細胞の非常に少ない数を示す細胞は、 インビボ 26,32 に腫瘍を生成することができます。 これらのマーカーとプロパティの組み合わせが正常にベルトラン間tのアルで使用されていた。 インビトロ及び光子と炭素イオン照射19にこれらのCSCの生体内で抵抗を研究します。それらの結果は、様々な細胞マーカーおよび特性の組み合わせは、単一のマーカーのアプローチよりHNSCCのCSC集団に関する有用な研究のために、より選択的であることを示しました。

<table><tbody><tr><td>Fetal Calf Serum Gold</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone water soluble</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0396-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x</td><td>Dominique Dutscher</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td>The solution must be prepared just before use because it is very unstable</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>StemcellTM Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus vitamin A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td>Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4</td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-4629</td><td>Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td>Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4</td></tr><tr><td>ALDEFLUOR Kit</td><td>Stem Cell</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>CD44-APC, human antibody</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-095-177</td><td></td></tr><tr><td>IgG1-APC, human antibody</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-093-189</td><td></td></tr><tr><td>Z1 coulter particle</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605698</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>CKX31</td><td></td></tr><tr><td>SQ20B cell line</td><td>Gift from the John Little&amp;rsquo;s Laboratory</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>FaDu cell line</td><td>ATCC</td><td>HTB-43</td><td></td></tr><tr><td>Low anchorage plates</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>145383</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva software v8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of a head and neck squamous cell carcinoma subpopulation having stem cell characteristics

頭頸部扁平上皮癌（HNSCC）の進行の理解の進歩にもかかわらず、5年生存率は、局所的再発および遠隔転移に低いままです。この再発を説明するための1つの仮説は、固有の化学療法および放射線抵抗性を提示するがん幹細胞様細胞（CSCは）の存在です。新たな治療戦略を開発するためには、標的治療の有効性を検証する実験モデルを有し、したがって、のCSCの同定および単離のための信頼できる方法が必要です。この目的のために、我々は、蛍光活性化細胞選別（FACS）によって実行二つの連続するセルソーティングの組み合わせに依存しているヒトHNSCC細胞株からのCSCを単離するためのプロトコルを提示します。第1は、ヘキスト33342などの重要なDNA色素は細胞が目にソートし、ATP結合カセット（ABC）トランスポータータンパク質を過剰発現するため、除外し、他の人の間でするのCSCのプロパティに基づいていますこの方法は、「サイドポピュレーション」（SP）として識別されています。 SP細胞は親細胞の（&lt;5％）低いパーセンテージを表すように、成長期には、第二の細胞選別の前にそれらの数を増加させるために必要です。次のステップは、他の二つのHNSCC幹細胞の特性は、細胞表面マーカーCD44（ 高 CD44）およびアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現（ALDH 高い ）の高発現レベル、すなわち有する細胞の選択を可能にします。単一のマーカーの使用は、CSCを単離するための多数の制限および落とし穴を有するため、SP、CD44およびALDHマーカーの組み合わせは、生細胞を必要とするさらなる分析および機能的アッセイのためのCSCを単離するための有用なツールを提供します。 CSCの幹のような特性は、最終的にtumorispheresの形成とβカテニンの発現によりin vitroで検証しました。

HNSCC細胞株からのCSCの単離は、理由親細胞株でのCSCの非常に低い割合の2つの連続した​​ソートを必要としました。最初のソートは、薬物排出トランスポーターによるヘキスト色素を排除するためのCSCの能力に基づいていました。このソート全細胞集団（ 図1）の1〜5％の獲得をもたらしました。ヘキスト染料負の細胞選別の間、SSCドットプロット（ <stro...

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Isolation and Characterization of a Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Subpopulation Having Stem Cell Characteristics

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

頭頸部扁平上皮癌の亜集団持つ幹細胞特性の単離とキャラクタリゼーション

Despite advances in the understanding of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC) progression, the five-year survival rate remains low due to local ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

8.5K ビュー.  Université de Lyon. Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

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Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains poor when metastasis has occurred. The Cancer Stem Cell (CSC) theory holds that there is a subset of tumor cells within the tumor that have stem-like characteristics, including the capacity to maintain the tumor and to resist multidrug chemotherapy. Therefore, a better understanding of OS biology and pathogenesis is needed in order to advance the development of targeted therapies to eradicate this particular subset and to reduce morbidity and mortality among patients. Isolating CSCs, establishing cell cultures of CSCs, and studying their biology are important steps to improving our understanding of OS biology and pathogenesis. The establishment of human-derived OS-CSCs from biopsies of OS has been made possible using several methods, including the capacity to create 3-dimensional stem cell cultures under nonadherent conditions. Under these conditions, CSCs are able to create spherical floating colonies formed by daughter stem cells; these colonies are termed &#34;cellular spheres&#34;. Here, we describe a method to establish CSC cultures from primary cell cultures of conventional OS obtained from OS biopsies. We clearly describe the several passages required to isolate and characterize CSCs.

The presence of cancer stem cells (CSCs) in bone sarcomas has recently been linked to their pathogenesis. In this article, we present the isolation of CSCs from primary cell cultures obtained from human biopsies of conventional osteosarcoma (OS) using the ability of CSCs to grow under nonadherent conditions.

がんの確立は、ヒト従来の骨肉腫からの幹細胞培養物

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

がん研究

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been shown to be responsible for tumor initiation, metastasis, and drug resistance. Therefore, it is important to develop specific TIC-targeting therapy in addition to current chemotherapy strategies, which mostly focus on the bulk of non-TICs. In order to further understand the mechanism behind the malignancy of TICs, we describe a method to isolate and to characterize TICs in human sarcomas. Herein, we show a detailed protocol to generate patient-derived xenografts (PDXs) of human sarcomas and to isolate TICs by fluorescence-activated cell sorting (FACS) using human leukocyte antigen class I (HLA-1) as a negative marker. Also, we describe how to functionally characterize these TICs, including a sphere formation assay and a tumor formation assay, and to induce differentiation along mesenchymal pathways. The isolation and characterization of PDX TICs provide clues for the discovery of potential targeting therapy reagents. Moreover, increasing evidence suggests that this protocol may be further extended to isolate and characterize TICs from other types of human cancers.

We describe a detailed protocol for the isolation of tumor-initiating cells from human sarcoma patient-derived xenografts by fluorescence-activated cell sorting, using human leukocyte antigen-1 (HLA-1) as a negative marker, and for the further validation and characterization of these HLA-1-negative tumor-initiating cells.

肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍始発細胞の単離と特徴付け

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

婦人科腫瘍および乳がん腫瘍から癌幹細胞球体を取得する

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident stem cells are relatively quiescent with niche restraints in adult tissues, they enter the cell cycle in anchor-free three-dimensional (3D) culture and undergo both symmetric and asymmetric cell division, giving rise to both stem and progenitor cells. The latter proliferate rapidly and are the major cell population at various stages of lineage commitment, forming heterogeneous spheroids. Using primary normal human prostate epithelial cells (HPrEC), a spheroid-based, label-retention assay was developed that permits the identification and functional isolation of the spheroid-initiating stem cells at a single cell resolution.
HPrEC or cell lines are two-dimensionally (2D) cultured with BrdU for 10 days to permit its incorporation into the DNA of all dividing cells, including self-renewing stem cells. Wash out commences upon transfer to the 3D culture for 5 days, during which stem cells self-renew through asymmetric division and initiate spheroid formation. While relatively quiescent daughter stem cells retain BrdU-labeled parental DNA, the daughter progenitors rapidly proliferate, losing the BrdU label. BrdU can be substituted with CFSE or Far Red pro-dyes, which permit live stem cell isolation by FACS. Stem cell characteristics are confirmed by in vitro spheroid formation, in vivo tissue regeneration assays, and by documenting their symmetric/asymmetric cell divisions. The isolated label-retaining stem cells can be rigorously interrogated by downstream molecular and biologic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, single cell capture, metabolic activity, proteome profiling, immunocytochemistry, organoid formation, and in vivo tissue regeneration. Importantly, this marker-free functional stem cell isolation approach identifies stem-like cells from fresh cancer specimens and cancer cell lines from multiple organs, suggesting wide applicability. It can be used to identify cancer stem-like cell biomarkers, screen pharmaceuticals targeting cancer stem-like cells, and discover novel therapeutic targets in cancers.

Using human primary prostate epithelial cells, we report a novel biomarker-free method of functional characterization of stem-like cells by a spheroid-based label-retention assay. A step-by-step protocol is described for BrdU, CFSE, or Far Red 2D cell labeling; three-dimensional spheroid formation; label-retaining stem-like cell identification by immunocytochemistry; and isolation by FACS.

3次元スフェロイド培養からの幹様細胞の分離

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

CD133の患者由来の細胞培養および分離<sup&gt; +</supメラノーマから&gt;推定されるがん幹細胞

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

医学

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem cells&#8221; (CSCs) responsible for tumor initiation, maintenance and relapse following conventional chemotherapies. Identification of ovarian CSCs is therefore an important goal. A commonly used method to assess CSC potential in vitro is the spheres assay in which cells are plated under non-adherent culture conditions in serum-free medium supplemented with growth factors and sphere formation is scored after a few days. Here, we review currently available protocols for human ovarian cancer spheres assays and perform a side-by-side analysis between commonly used multi cell-based assays and a more accurate system based on single cell plating. Our results indicate that both multi cell-based as well as single cell-based spheres assays can be used to investigate sphere formation in vitro. The more laborious and expensive single cell-based assays are more suitable for functional assessment of individual cells and lead to overall more accurate results while multi cell-based assays can be strongly influenced by the density of plated cells and require titration experiments upfront. Methylcellulose supplementation to multi cell-based assays can be effectively used to reduce mechanical artifacts.

In vitro spheres assays are commonly used to identify cancer stem cells. Here we compare single with multi cell-based spheres assays. The more laborious single cell-based assays or methylcellulose supplementation give more accurate results while multi cell-based assays performed in liquid medium can be highly influenced by cell density.

マルチとシングルセルベース球アッセイを用いてヒト卵巣癌細胞における幹細胞特性の評価

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

ヒト膵臓癌異種移植片由来の幹細胞の分離

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

生物学

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

頭頸部扁平上皮癌の亜集団持つ幹細胞特性の単離とキャラクタリゼーション

要約

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