このプロトコルは機能アッセイおよび表現型特徴付けを使用して強い方法で癌幹細胞の識別そして単離を可能にする。腫瘍サンプルからの癌幹細胞分離は、個々の腫瘍に対する特定の治療法の臨床応用を導き、抵抗性および結果的な再発を予測するためのプラットフォームとなり得る。非接着性懸濁液培養を調製するには、まずポリHEMAの1ミリリットル当たり15ミリグラムの50マイクロリットル/平方メートルで細胞培養容器をコーティングし、少なくとも2日間37度の摂氏乾燥オーブンに容器を入れます。
容器が完全に乾燥したら、PBSで80〜90%のコンフルエント癌細胞株培養で洗浄し、トリプシンEDTAの1〜2ミリリットルで細胞を剥離する。摂氏37度で5分後、2~4ミリリットルの新鮮な細胞培養培地で反応を阻止し、遠心分離により解約細胞を洗浄する。ペレットをカウント用の新鮮な培養培地で再懸濁し、培養皿濃度当たり500〜2000平方メートルのメチルセルロースを含む新鮮な球培養培地で細胞を希釈した。
球の単一の同一性を保障するために、アンカレッジのない環境で各細胞株を低密度でシードする。その後、ポリHEMAコーティングされたプレートに細胞を播種し、摂氏37度と二酸化炭素を5%で5日間インキュベーションし、表皮成長因子の1ミリリットル当たり10ナノグラム、基本的な線維芽細胞成長因子の1ミリリットル当たり10ナノグラムを2日ごとに細胞培養培地に添加する。めっきの3~12日後、3次元のボール型細胞コロニーは光顕微鏡で観察されるべきである。
派生した付着集団を得るために、元の癌細胞株に対する適切な培養条件下で球体を新しい培養皿に移す。培養の1〜2日後、細胞単層は、起源の細胞系と同様の形態を有する接着球の周りに成長して観察されるべきである。対象となる癌細胞株の球形成能力を決定するために、球形成プロトコルの完成後、遠心分離によって球を集める。
球ペレットを新鮮な培地に静かに再懸濁し、ヘモサイトメーターを使用して直径40マイクロメートルを超える球体数をカウントします。次に、取得した球の割合と最初にめっきされた細胞数の比率を計算します。対象となる細胞株の自己再生能力を決定するには、遠心分離によって球を収集し、トリプシンEDTAの球ペレットを摂氏37度で5分間静かに再懸濁します。
インキュベーションの終了時に、チューブに酵素および活性化培地を加え、ピペット溶液を単一細胞懸濁液を得た。ヘモサイトメーターとトリパンブルー排除法を使用して、懸濁液中の生存細胞を数え、ちょうど実証したように球形成アッセイ用のポリHEMAコーティングプレートの細胞をプレート化する。8日後、ヘモサイトメーターを使用して直径40マイクロメートル以上の球数をカウントし、最初にめっきした細胞の数に対して得られた球の割合を計算します。
球体が占める面積を評価するには、画像取得モジュールを搭載した反転顕微鏡のステージに培養皿を置き、100X~400倍倍を選択します。条件ごとに少なくとも 10 個のランダム フィールドの画像を取得し、適切な画像解析ソフトウェア プログラムを使用して、球の周囲に関心のある領域を描画します。次に、対象となる各領域の面積をピクセル単位で測定し、測定したピクセルの平均面積として球体投影領域を計算します。
癌幹細胞の球形成能力、自己再生、および投影領域の機能的特徴は、それらの遠い系統と起源の組織を比較することを可能にする。球形成プロトコルは、球状コロニーがいくつかの子宮内膜および乳癌細胞株からの懸濁液で得られるか、またはヒト腫瘍サンプルからの組織の穏やかな酵素消化の後に得ることを可能にする。子宮内膜球と乳癌球体の両方が、めっきの1〜2日後に原産地の細胞系と同様の形態を有する細胞単層を生み出す。
これらの代表的な実験では、ホルモン受容体陽性乳癌MCF-7細胞は、トリプルネガティブHCC1806乳癌細胞よりも高い球形成能力、自己再生能力および投影面積を示した。球形成プロトコルを用いたがん幹細胞の濃縮に加えて、フローサイトメトリーなどの相補的な方法を用いて、幹細胞のさらなる評価を行うことをお勧めします。この子宮内膜細胞株から得られた球体の代表的な分析では、癌幹細胞マーカーを発現する細胞の4つの集団が、フローサイトメトリーによって各細胞株で同定された。
他の分子生物学技術による腫瘍球の評価は、幹細胞の確認、および癌幹細胞の可塑性を可能にし、標的療法の開発を促進する。穏やかな球収穫後のウェスタンブロット分析は、インビトロで生成された球体に対する癌幹細胞表現型も明らかにした。この分離プロトコルは、再発、転移、治療抵抗性を理解するために臨床的に翻訳される癌幹細胞の重要性の理解に寄与する。
