幹細胞の分離は、現在の方法を使用した前駆細胞の共分離による主要な課題であり続けています。我々は、静止幹細胞を混合前駆物質から分離するための新しいバイオマーカーフリーアッセイを開発した。このスフェロイドベースのラベル保持アッセイの主な利点は、CFSEまたはファーレッド標識を使用してFACSによって娘の前駆細胞から生きた幹細胞を拡大および分離することができる。
従来の治療法ではほとんどの前立腺癌細胞が根絶されますが、がん幹細胞は治療抵抗のために残り、病気の進行を促進します。幹細胞様細胞分離は、効果的な疾患寛解のために治療的に共同標的化することができる新しい遺伝子の同定を可能にする。当社のラベル保持アッセイは、様々な組織や細胞からの正常な幹細胞分離、および癌幹細胞研究に適用可能です。
重要なことに、このアッセイは、乳癌および大腸癌などの他の上皮細胞癌に適用可能である。100ミリメートルの培養皿を2.5マイクログラムフィブロネクチン溶液の2ミリリットルでコーティングし、室温で一晩インキュベートします。その後、溶液を吸引し、培養皿をバイオセーフティキャビネット内で45分間空気乾燥させます。
前立腺上皮細胞増殖培地をフィブロネクチンコーティング皿に9ミリリットル加え、摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターで温かく保ちます。37°Cの水浴で凍結したヒト前立腺上皮細胞のバイアルを1バイアルで解凍し、10ミリリットルの温かい培地で細胞を再懸濁する。5分間500回gで細胞懸濁液を遠心分離する。
その後、吸引し、上清を捨てます。細胞を温かい培養培地の1ミリリットルに再懸濁し、1ミリリットルの懸濁液を、あらかじめ温めた培地でフィブロネクチンコーティング皿に直接移す。その後、摂氏37度で二酸化炭素インキュベーターに皿をインキュベートします。
細胞に共同標識を付ける場合は、テキスト原稿に記載されている10日間の2D培養でBrdU標識細胞を調製する。その後、5つのマイクロモルCFSEまたはファーレッドを加え、30分間細胞をインキュベートします。インキュベーション後、慎重に色素で培地を吸引し、5ミリリットルの温かいPBSで細胞を2回洗浄する。
次に、原稿の指示に従って05%トリプシンEDTAで酵素消化を行う。500回gで細胞を5分間遠心し、上清を捨てます。細胞を氷冷、1対1の基体膜マトリックスおよび培養培地ミックス中に再懸濁し、3Dプロスフィア形成を行った。
3D基質マトリックスシステムでプロスフィア培養を調製するには、基膜マトリックスを摂氏4度で一晩解凍し、使用前に氷の上に保管します。その後、氷冷基膜マトリックスの1ミリリットルを同量の氷冷培養培地にそっと加えます。ピペットは上下に混ざり、気泡を導入しないように注意してください。
氷冷1対1基膜マトリックスと培養培地ミックス中のヒト前立腺上皮細胞の5倍を50~1/4回再懸濁し、合計体積500マイクロリットルを混合する。各ウェルの下縁に溶液をピペットし、均等に混合物を分配するためにプレートを旋回します。プレートを37°Cの二酸化炭素インキュベーターに30分間置き、マトリックスを固めます。
その後、リングを乱さないように、井戸あたり1ミリリットルの温かい培養培地で覆います。CFSE標識プロスタフェアを収穫するには、2ミリリットルのディスパーゼとピペットを上下に置き換えて数回混合します。37°Cでプレートを30分間インキュベートしてマトリックスを消化し、球体混合物を15ミリリットルの遠心分離管に集めます。
500回gで球を5分間遠心し、上清を捨てます。ペレットを暖かい05%トリプシンEDTAの500マイクロリットルに再懸濁し、1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。37°Cで5分間、球をインキュベートし、10%FBSで500マイクロリットルの温かいPBSを加えます。
26ゲージの針で1ミリリットルの注射器を通して、球体を完全に解体します。5分間500回gで細胞を遠心分離する。その後、吸引し、上清を捨てます。
1ミリリットルの温かい培養培地で細胞を1ミリリットルに再懸濁し、ヨウ化プロピジウム1ミリグラムで死んだ細胞を染色し、室温で1分間インキュベートする。遠心分離を繰り返し、上清を捨てます。その後、1ミリリットルの温かい媒体で細胞を洗います。
遠心分離を繰り返し、上清を捨てます。温かい培養培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁し、35ミクロンの孔サイズの細胞ストレーナースナップキャップを介してそれらを濾過することによって、5ミリリットルポリスチレンラウンドボトムチューブで細胞を収集します。トリプシン分散CFSE標識プロスタ球細胞のFACS分析を行う。
非標識セルを負のコントロールとして使用し、ゲートを設定するための正のコントロールとして CFSE 標識セルを使用して、サンプルを実行して、分数が設定された CFSE 高セルおよび CFSE 低セルのサブオーバジストを並べ替えて収集します。一次正常ヒト前立腺上皮細胞をフィブロネクチンコーティング培養皿に入れ、細胞増殖を2D培養で維持した。基体膜マトリックスを用いた3D培養物に移ると、分化した上皮細胞はゆっくりと消滅し、前立腺幹細胞だけが残った。
2D培養における前立腺上皮細胞の二重標識は、3D培養におけるスフェロイド形成に続いて、同じ標識保持細胞におけるBrdU、CFSE、およびファーレッドの共局在化を示した。二重免疫染色は、標識保持細胞がサイトケラチンタンパク質ケラチン14の低レベルを示し、細胞結合タンパク質E-カドヘリンを減少させ、幹細胞初期マーカータンパク質Wnt10bおよびALDH1A1を増加させ、オートファジータンパク質LC3を増加させ、およびミオシンIIBを増加させることを示した。さらに、スフェロイド系のラベル保持アッセイは、前立腺癌検体における癌幹細胞様細胞の検出に成功した。
CFSE標識保持幹細胞様癌細胞およびヒト前立腺癌検体由来のスフェロイドは、非標識前駆細胞に対してEカドヘリンタンパク質の減少を示した。このプロトコルを試みる際には、培地調製用の液体状のマトリックスを維持することが重要である。4度で一晩保存し、マトリックスを分配する前に氷冷PBSでピペットの先端を冷やします。
スフェロイドベースのラベル保持アッセイを用いた幹細胞の単離後、単細胞RNAシーケンシングおよびプロテオーム解析を行い、幹細胞内の特定の遺伝子および新規バイオマーカーを同定することができる。スフェロイドベースの標識保持アッセイによる生きた癌幹細胞の単離は、研究者が癌幹細胞由来の腫瘍化をインビトロで成長させ、新しい抗癌薬をスクリーニングすることを可能にする。
