This work has been funded in part with Federal funds from the National Institutes of Health, Office of Director, Innovator (No.: DP2OD06514) (PCS) and from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under Contracts (No:HHSN272200900018C, HHSN272200900049C and U19AI110818).

倫理文：ラッサ熱患者はチューレーン大学、ハーバード大学、ブロード研究所、Irrua専門教育病院（ISTH）、ケネマ政府病院（KGH）、健康、イバダンのオヨ州省でのヒト被験者委員会によって承認されたプロトコルを使用して、この研究のために募集されました、ナイジェリアと健康のシエラレオネ省。すべての患者は、彼らが研究に参加することを決めたかどうか、治療の同様の規格で処理し、薬物リバビリン提供されました。ラッサ熱（LF）の患者について、リバビリンによる治療は、現在、推奨ガイドラインに従い、一般的に、すぐにLFが強く疑われたとして提供されていました。 エボラウイルス病（EVD）に深刻な流行に、患者は、当社の標準的なプロトコルを使用して同意することができませんでした。 EVD患者からの臨床過剰サンプルの代わりに使用することは評価され、シエラレオネで、ハーバード大学の制度審査委員会によって承認されました。オフィヒト対象の使用に関するシエラレオネ倫理と科学審査委員会、保健衛生のシエラレオネ省、およびハーバード大学委員会のCEは、シーケンスに同意の放棄を付与しているし、患者と接触したサンプルから得られた公的に利用可能なウイルス配列を作りますシエラレオネエボラ流行中に収集されました。これらの機関はまた、流行の応答の間にケアを受けてすべての疑いのあるEVDの患者から採取匿名化されたサンプルについての臨床および疫学データの使用を認めました。シエラレオネ保健省と衛生にも流行サンプルのゲノム研究のためのシエラレオネからのブロード研究所、ハーバード大学への非感染性、非生物学的サンプルの出荷を承認しました。 サンプルRNAの1 DNアーゼ処理（最大55μlを抽出した全RNAを、〜4時間） <ol><li> 表1に記載されているように安全キャビネットに氷上で96ウェルPCRプレート中のDNase反応を設定します</strong&gt;、1.1（総容量、70μL/ウェル）をステップ。注：マスターミックスを調製することができます。 </li><li>やさしく、徹底的にボルテックスは、その後、1分間室温で280×gで遠心します。 </li><li> 37℃で30分間インキュベートします。 </li><li> RNA固相可逆的固定化（SPRI）ビーズを使用してクリーンアップ。 <ol><li>暖かいRNAビーズを30分間室温に。 </li><li>静かに落ち着いた可能性のある磁性粒子を再懸濁し、RNAビーズボトルを振ります。 DNase処理RNA（70マイクロリットル）へのRNAビーズの1.8倍の容量（126μl）を追加し、ピペットで10回を混合し、（まあ、196μlの総容量）を室温で5分間インキュベートします。 </li><li>磁気ステーションに混合物を置きます。 （ - 10分5）をクリアするためのソリューションを待ちます。 </li><li>ピペットおよび廃棄によってステーション上ながらクリアソリューションを削除します。ステーションの間に、70％エタノールでペレットを被覆することにより、ビーズを洗浄し、1分間インキュベートします。ピペットでエタノールを除去し、廃棄します。 2回の洗浄の合計のために繰り返します。 注：正確には70％新たに調製されたらを使用します&lt;70％エタノールは、サンプル7の損失を引き起こす可能性があり、一方、より高い割合は、より小さなサイズの分子の非効率的な洗浄になりますようhanolは、非常に重要です。 </li><li>ステーションにプレートを維持し、空気乾燥にオープンにしてください。注：ビーズが割れ始めるまでビーズが完全に乾燥することを可能にしてください。 </li><li> RNAを溶出するためにプレートにヌクレアーゼフリー水55μlを添加します。徹底的にピペッティングしてビーズと水を混合するステーションからプレートを取り外します。注：別の方法として、全RNAを濃縮するために、少ない水（≤10μl）を使用します。 </li><li>背面ステーションにプレートを置きます。解決策は、長期保存のための新しいスクリューキャップチューブにピペットで転送するためにクリアするまで待ちます（-80°C）。枯渇のための新しい96ウェルPCRプレートに5μlのRNAを置きます（ステップ2.4​​）。 </li><li>オプション：保存し、rRNAの定量RT-PCRのために19μlの水（1時20分）に1μlのを希釈（ 例えば 、18S、28S rRNAの）（ 表2）およびウイルスマーカー5 &lt;/李&gt; </ol></li></ol>ウイルスRNAサンプルからリボソームとキャリアRNAの2選択的枯​​渇（〜4時間） <ol><li> 表1に記載されているように直鎖状アクリルアミドキャリアと5倍ハイブリダイゼーションおよび10倍のRNase Hの反応緩衝液、およびヌクレアーゼフリー水を作ります。 </li><li> 表1に記載したように、96ウェルPCRプレート中、氷上でのrRNA枯渇オリゴ（ 表3）を用いてRNAを合成し、オリゴ（dT）でハイブリダイゼーション反応をセットアップします。 注：マスターミックスを調製することができます。ユニークな合成RNA（ERCCs 8）の50フェムトグラム（FG）は、ウイルスの配列決定プロセスや潜在的な指標読み交差汚染の両方を追跡するために追加することができます。 <ol><li>やさしく、徹底的にボルテックスは、その後、1分間室温で280×gで遠心します。 毎秒-0.1℃で45℃までゆっくりランプ、2分間95℃でインキュベートします。 45℃でサーモサイクラーを一時停止します。 </li></ol></li><li>説明するように氷上でのRNase H反応ミックスを設定します表1のdは、次に2分間45℃で予熱します。注：マスターミックスを調製することができます。 <ol><li> 45℃でサーモサイクラー中でプレートを維持しながらプレートにハイブリダイゼーション反応に予備加熱されたRNアーゼHミックスを加えます。 </li><li> 8回 - 穏やかにピペッティング6でよく混ぜます。さらに30分間45℃でインキュベートします。氷の上に置きます。 </li></ol></li><li> 表1に記載したように氷上でのDNase反応ミックスを設定注意：マスターミックスを調製することができます。 <ol><li> 、プレート内のRNase H反応に追加やさしく、徹底的にボルテックスし、1分間室温で280×gで遠心します。 37℃で30分間インキュベートします。 </li><li> 5μlの0.5 M EDTAを添加することにより、DNアーゼ反応を停止します。やさしく、徹底的にボルテックスは、その後、1分間室温で280×gで遠心します。 </li></ol></li><li> 1.8倍の容量（144μl）をビーズを用いてRNAビーズを使用してクリーンアップ（ステップ1.3を参照してください）​​。ヌクレアーゼフリー水11μlの溶出。注：安全な低温貯蔵のために、ストアはRNを枯渇しました-80°C O / Nサンプル。 </li></ol> 3. cDNA合成（〜6時間） <ol><li>ミックスのrRNA / 96ウェルPCRプレート中の氷上でランダムプライマーとキャリア枯渇RNA、表1に記載されているように、渦やさしく、徹底的に、その後1分間室温で280×gで遠心します。 <ol><li>サーモサイクラー中で10分間70℃で混合物を加熱します。 5分 - すぐに熱変性した後、1氷上でRNAを置きます。 RNAは、従来の第一鎖の反応により長い5分間（でも、氷上で）放置することはできません。 </li></ol></li><li> 表1に記載したように氷上で第一鎖合成反応ミックスを設定します。 注：マスターミックスを調製することができます。 <ol><li>その後、1分間室温で280×gで遠心し、RNA /プレート内のランダムプライマーミックス、やさしく、徹底的にボルテックスに追加します。 10分間25°C - 22でインキュベートします。 </li><li> 60分間空気インキュベーター中、55℃でインキュベートします。反応を停止し、氷上でプレートを置きます。しませんE：空気インキュベーターの使用は、プライマーのアニーリングおよび第一鎖が細長くし始める時の第一鎖反応の漸進的な温暖化を作成することをお勧めします。 </li></ol></li><li> 表1に記載したように氷上で第二鎖合成反応ミックスを設定します。 注：マスターミックスを調製することができます。 <ol><li> 、プレート内の第一鎖合成反応に追加やさしく、徹底的にボルテックスし、1分間室温で280×gで遠心します。 16°C（25°Cで蓋を保つ）で2時間インキュベートします。温度が16°Cを超えないようにしてください。 </li><li>次いで1分間室温で280×gで遠心分離し、静かによく混ぜ、0.5 M EDTAを5μlを加えて反応を不活性化、氷上にプレートを置きます。 </li></ol></li><li>ビーズの1.8倍の容量（153μl）を用いてDNAビーズ（プロトコルのためのステップ1.3を参照）でクリーンアップ。溶出緩衝液（EB）の9μlの溶出。定量化のための1μLを保存します。 subsequeのcDNA 1ngのを使用しますNTの手順を実行します。 cDNA濃度は、検出tagmentationのcDNAを4μlのを使用することが低すぎる場合（ステップ4.1参照）。 </li><li>長期保存のための安全な冷蔵、C°4°CO / Nまたは-20ストア二本鎖cDNAのため。 </li></ol> 4.ライブラリの準備 - DNAライブラリーの構築（〜4時間） <ol><li> cDNAの転送4μlを96ウェルプレートに、必要な場合は、2番目の試みのために残りのcDNAを保存します。 </li><li> 表1に記載されているように氷上でtagmentation反応を設定します。 注：マスターミックスを調製することができます。背景と全体的なコストを削減するために、tagmentation反応の総容量は、20〜10マイクロリットルから減少されます。 cDNAを制限する要因であるように、反応に用いられるATM（ すなわち、transposome）の量はまた、組み込み部位の数を減少させるために減少されます。 <ol><li> 1分間（室温で）280×gで静かに、徹底的に、プレートにcDNAに渦をtagmentationミックスを追加し、遠心分離機。5分間55℃でインキュベートし、10℃で保持します。 </li><li>いったん10℃で、すぐに反応を終了するために中和するTagmentバッファー（NT）の2.5μlを添加します。その後、1分間（室温で）280×gで遠心し、上下にピペッティングにより混和します。 </li><li>室温で5分間インキュベートします。 </li></ol></li><li> 表1に記載されているように氷上でPCR増幅反応を設定します。 <ol><li>やさしく、徹底的にボルテックスは、その後、1分間室温で280×gで遠心します。 </li><li> 表1に記載の条件を用いて、サーマルサイクラーにPCRを行います。 注：PCRの12サイクルはtagmented cDNAの1 ngのために提案されています。しかし、ウイルスの臨床サンプルは、多くの場合、cDNAの検出不可能な量を持っています。 cDNAを（&lt;1 ngの）低量のために、配列決定のために十分なライブラリーを作成するために、PCRの18サイクルまで使用しています。 </li></ol></li><li>ライブラリの準備 - クリーンアップおよび配列決定のためのプール<ol><li> EB 50μlにサンプルを起動します。 </li><li>とクリーンアップ0.6x量（30μl）をビーズを用いたDNAビーズ（プロトコルのためのステップ1.3を参照してください）​​。 15μlのEBで溶出します。 </li><li>領域分析からプライマーダイマー（〜120 bp）を除く、バイオアナライザソフトウェア9を使用して、領域分析（150〜1,000 bp）を行うことにより、ライブラリーの濃度（ 図3）を決定します 。注：また、定量PCRは、ライブラリ10を定量するために使用することができます。 </li><li> 1 nMもしくはそれ以上の最低のモル濃度でプールライブラリ。ライブラリが1nm未満の場合、これらのライブラリーからの配列情報を取得するために、プール（他のライブラリの〜1倍容量）に、ライブラリの少量を加えます。 </li><li>上記のように0.7倍のDNAビーズとクリーンアッププール（ステップ2を参照）。 15μlのEBで溶出します。注：ビーズのボリュームプールの最終容積に依存するであろう。 </li><li>プール9を分析します。領域分析（150〜1,000 bp）の9を行うことにより、モル濃度を決定します。注：また、定量PCRは、ライブラリープール10を定量するために使用することができます&lt;/ SUP&gt;。 </li><li>デュアルバーコード11を読み取ると10pMの101塩基対を生成するためのライブラリ濃度のロードシーケンサは、ペアエンドを読み込みます。 </li></ol></li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig3.jpg" /> 4代表的なエボラウイルス（EBOV）ライブラリのエボラウイルス臨床サンプル。ゲル画像から構築図3.ライブラリ 。ライブラリとプライマーダイマーの領域が示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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The authors have no competing financial interests.

概説的なアプローチは、堅牢、普遍的、迅速なシーケンシングを可能にし、2014年流行の2,4の間にエボラウイルスの配列を決定するために使用されました。 tagmentationライブラリー構成の選択的枯渇及びcDNA合成を結合することにより、全体の処理時間は、前のアダプターライゲーション方法から1~2日後に減少しました。最近では、このプロトコルは大成功15,16との国際共同研究者らによって採用されたと地元ゲノミクスベースの調査研究および診断17をサポートするために西アフリカのラボに展開されます。 ここで説明するプロトコルは、ウイルスRNA-seqのライブラリのcDNAを準備するために、ランダムプライマーを使用しています。前回のウイルスRNA-seqのアプローチとは異なり、それは特定のウイルスまたはクレードのための配列データや精巧で時間のかかるプライマー設計の事前知識を必要としません。この方法は、任意のウイルスRNA試料に適用することができます。例えば、エボラウイルスの両方からコンテンツを生成するために使用されましたそして、ラッササンプル6。プロトコルは、ホスト・トランスクリプトーム、メタゲノムおよび病原体検出の配列決定プロジェクト1のために使用することができます。 プロトコルの重要なステップは、RNアーゼH消化、高スループット、ウイルスのサンプルから不要なキャリアと宿主RNAを除去するための低コストの方法を対象としています。プロトコルの選択的枯渇のステップは、多くのコンポーネントを使用し、スキルと精度を必要とします。余分な時間とケアは、初期設定時に注意すべきです。 ほとんどの臨床血清および血漿サンプルは、多くの場合、非常に少ない核酸物質を有するので、汚染および試料の損失が一般的です。このプロトコルを使用する場合、これらの問題を回避するために、特別な注意が払われるべきです。まず、RNAが分解に対して非常に敏感です。したがって、すべてのエリアは清潔でヌクレアーゼの自由であるべきです。第二に、このプロトコルで使用するのに適したサンプルを識別するために、宿主RNAとウイルスの両方のためのqRT-PCRアッセイは、定量5,6のために使用されるべきです</suP&gt;。入力を比較すると、少なくとも100 pgのトータルRNAとウイルスの千のコピーを含まれるサンプルと相関プロトコル、シークエンシングの成功（フルウイルス構築のための十分なデータがすなわち、発生）からの配列決定の結果に相当します。第三に、核酸の環境源への曝露を避けるべきです。ここで概説プロトコルは、安全上の注意事項は、環境汚染物質を制限するための安全キャビネットで行われます。また、当社グループなどが市販酵素は、低入力サンプル6,18中の細菌の核酸を汚染する別の源になる可能性があることに気づきました。クリーンな作業領域（ 例えば 、PCRフード、安全キャビネット）および陰性対照（ 例えば 、水または緩衝液）の使用は、それぞれ、軽減と汚染を追跡します。 &lt;全RNAの100 pgの、唯一のポリ（RA）キャリアRNA、ないのrRNAとサンプルについては、材料の損失を制限しながら、高品質の配列決​​定結果を確実にするために枯渇されるべきです。以下のために非常にポリ（RA）キャリアはcDNA合成の前に除去しなければならないが、低入力サンプルは、cDNAの増幅方法は、19より適切であり得ます。 宿主rRNAの枯渇は、配列ライブラリー中のウイルス含有量を富化し、血清又は血漿、及びげっ歯類および非ヒト霊長類5,6からの組織の複数のタイプを含む異なるサンプルのコレクションに適用可能です。ヒト以外の生物では、28S rRNAのに整列させることは28S rRNAのは、人間と他の種6,20間の少ない保存されて示唆し、枯渇した後に残った読み取り。非ヒト分離株で、この方法を使用する場合、特定のホスト3,21の発散rRNA配列に相補的なDNAオリゴと補完する必要があるかもしれません。 プロトコルは公平であるので、ウイルスは、全ライブラリの内容のごく一部を表すことができる読み取ります。 rRNAが宿主RNAの最も豊富な種であるとrRNAのわずかな割合は、（読み込みが0;）1％が選択的枯渇後に発見され、他のすべての宿主RNA（ 例えば 、mRNA）が枯渇した後に残る、多くのシーケンシングは、サンプルからの読み取りを説明することができます。したがって「オーバーサンプリング」（ すなわち 、oversequencing）個々のライブラリは、ウイルスアセンブリおよびバリアントの呼び出しのための十分なカバレッジを持っているために必要とされます。私たちの研究のために、私たちは順番にしよう〜2000万は、ウイルスゲノムおよび関連する変異体の解析のために十分な深さだけでなく、メタゲノムコンテンツ2,5を持っているために、サンプルごとに読み込みます。メタゲノムおよび病原体検出の研究のために、汚染宿主DNAは、DNアーゼ消化によって除去されることに留意することが重要です。したがって、ウイルスおよびDNAゲノムを含む他の病原体は、しかし、RNA中間体がまだ配列決定され得る、プロセスの間に失われることがあります。

臨床情報源からのウイルスの次世代シーケンシングは、送信および感染症の疫学、ならびに診断ヘルプサポート小説、ワクチンや治療の開発に知らせることができます。ランダムプライマーを用いてcDNA合成は、検出およびアセンブリ発散からゲノムの共感染あるいは新規ウイルス1,2を可能にしました。他の公正な方法と同様に、不要な汚染物質は、多くのシーケンシングを読み取って、負の配列決定の結果に影響を与える占めます。ホストおよびポリ（RA）キャリアRNAは、多くの既存のウイルスサンプルのコレクションに存在する汚染物質です。 プロトコルは公平全RNA-seqのに基づいて、深いシーケンシングRNAウイルスのゲノムの効率的かつ費用対効果の高い方法を説明します。この方法は、不要なホストリボソームとキャリアRNAを除去するためのRNase H選択的枯渇のステップ3を利用しています。選択的枯渇は、ウイルスコンテンツ（ 図1）のために豊かにし、配列決定データの全体的な品質を向上させます臨床サンプルから（ 図2）。また、tagmentationは、著しくライブラリー構築時間を低減するようなプロトコルに適用されます。これらの方法は、迅速にエボラおよびラッサウイルスゲノム2,4,5の大規模なデータセットを生成するために使用されており、RNAウイルスの広い範囲を研究するために使用することができます。最後に、このアプローチは、ヒトのサンプルに限定されるものではありません。選択的な枯渇の有用性は、ラッサ感染げっ歯類および非ヒト霊長類疾患モデル5,6から採取した組織サンプルで実証されました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig1.jpg" /> 図1.全RNAのコンテンツは、コンテンツ全体（RNA入力）を開始しています。選択的枯渇を使用したラッサウイルス、コンテンツの充実を反映し、ユニークなラッサウイルス（LASV）の濃縮は、9つの異なる臨床分離株からのrRNA枯渇時（ライブラリコンテンツ）を読み込みます。この図は、6から変更されています<em&gt;。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54117/54117fig2.jpg" /> 図2.品質向上シングキャリアRNA枯渇。ポリシークエンシングサイクル（RA）あたりの中央値ベースの資質は、ラッサウイルスライブラリ（赤）とQCレポート13からの制御（黒ライブラリに観察されなかったキャリアを、）-contaminated 後 。両方が1を読み、ペアエンドの2を読んで、ライブラリのBAMファイルにマージされ、品質スコアは、各ベースで示されている読み込みます。この図は、6から変更されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/54117fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 抽出から直接ライブラリのウイルスRNA-seqのプロトコルの詳細建設RNAは、臨床的および生物学的サンプルから収集します。個人の安全を確保するために、全てのウイルスの血清、血漿および組織サンプルは、RNA抽出前に適切な緩衝液で不活性化されるべきです。いくつかの不活性化および抽出キットにおいて、キャリアポリ（RA）RNAが含まれています。これは初期のRNase H選択的枯渇ステップの間に削除されます。完全な回復に基づいて、キャリアRNAの予想濃度は100 ngの/μlです。プロトコルでは、110 ngの/μlのオリゴdT RNA（1.1倍のキャリア濃度）を枯渇するために使用されます。ポリ（RA）担体が試料中に存在しない場合は、オリゴ（dT）が枯渇する前に添加されるべきではありません。 以下のプロトコルは、（250μlの容量まで）PCRプレート形式で24の反応のために設計されています。このプロトコルの以前のバージョンはMatranga らに報告された。6。

<table><tbody><tr><td>96-well PCR Plates</td><td>VWR</td><td>47743-953</td><td></td></tr><tr><td>Strips of Eight Caps</td><td>VWR</td><td>47745-512</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>50 ml bottle</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td>post RNA extraction step, 2 U/&amp;micro;l, buffer included</td></tr><tr><td>PCR cycler</td><td></td><td></td><td>any PCR cyclers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP SPRI beads&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63987</td><td>beads for RNA cleanup</td></tr><tr><td>Real Time qPCR system</td><td></td><td></td><td>any system</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Skirted Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td>prepare fresh</td></tr><tr><td>qRT-PCR primers</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>see &lt;strong&gt;Table 2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>5 M NaCl&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T2663-1L</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl pH 7.5&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Linear acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Ambion&amp;nbsp;</td><td>AM9520</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligos covering entire rRNA region</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>see &lt;strong&gt;Table 3&lt;/strong&gt;, order lab-ready at 100 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Oligo (dT)</td><td>IDT DNA</td><td></td><td>40 nt long, desalted</td></tr><tr><td>Hybridase Thermostable RNase H&amp;nbsp;</td><td>Epicentre</td><td>H39100</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>post selective depletion step</td></tr><tr><td>SUPERase-In RNase Inhibitor</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Random Primers&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>48190-011</td><td>mostly hexamers</td></tr><tr><td>10 mM dNTP mix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18080-093</td><td>with first-strand buffer, DTT</td></tr><tr><td>Air Incubator</td><td></td><td></td><td>any air incubator cyclers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEBNext Second Strand Synthesis (dNTP-free) Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B6117S</td><td>10x</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0205L</td><td>10 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DNA Polymerase I&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0209L</td><td>10 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0297L</td><td>2 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP SPRI beads</td><td>Beckman Coulter Genomics</td><td>A63881</td><td>beads for DNA cleanup</td></tr><tr><td>Elution Buffer&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td></td><td>10 mM Tris HCl, pH 8.5</td></tr><tr><td>Quant-iT dsDNA HS Assay Kit&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Qubit fluorometer&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32857</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Sample Prep Kit&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1096</td><td></td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Index Kit&amp;nbsp;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2965AA</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer 2100&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Library Quantification Complete kit (Universal)</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4824</td><td>alternative to tapestation, bioanalyzer for library quantification</td></tr></tbody></table>

unbiased deep sequencing of rna viruses from clinical samples

ここでは、 デノボアセンブリおよび臨床的および生物学的供給源から収集されたウイルスゲノムのホスト内のバリアントの呼び出しを可能にする次世代のRNAの塩基配列決定プロトコルの概要を説明します。この方法は、公平かつ普遍的です。それは、cDNA合成のためのランダムプライマーを使用し、ウイルス配列のコンテンツの予備知識を必要としません。含むポリ（RA）キャリアとリボソームRNA - - ウイルスRNAサンプルからライブラリー構築する前に、選択のRNase Hベースの消化は、不要なRNAを枯渇させるために使用されます。選択的枯渇は、データ品質とウイルスRNAシーケンシングライブラリを読み込んでユニークな数の両方を向上させます。それは全体のライブラリー構築時間を低減するようにまた、トランスポザーゼ系」tagmentation」ステップは、プロトコルで使用されています。プロトコルは、血液および組織の両方からの600以上のラッサ熱とエボラウイルスサンプル-を含むコレクションの急速な深いシーケンシングは、隔離、および他の微生物ゲノム研究に広く適用可能である可能となりました。

記載されているプロトコルは、固有のウイルスのコンテンツを充実しつつ、高品質なシーケンシングの発生は、低入力ウイルスRNAサンプルから読み取ることができます。 図1に示すように 、プロトコルは、一意ラッサウイルス含有量が、少なくとも18S rRNAの少なくとも一つ万枚（約100 pgのトータルRNA）を用いて（非枯渇した対照と比較して）すべての試料の5倍濃縮されました。同様に、シークエンシングの成功はまた、与えられた試料中のウイルス量と相関していました。ウイルス量の代用〜ほとんどの場合、完全なアセンブリを作成した1000以上のウイルスゲノムコピーを含有サンプルとして定量RT-PCRを使用して（データは示さず）。また、ポリデプレッション（RA）キャリアクリーナー製剤が得られる、ライブラリー中のAとTのホモポリマー配列を低減し、より高品質の配列決定を確保する（ 図2）を読み出します。低入力から最終的なライブラリーは、ウイルスの臨床サンプルは、多くの場合、150〜1,000塩基対から広い断片長を有します（ 図3）。 配列決定の後、プール12内のライブラリ間のサンプルの誤認やクロストークを低減するために、唯一のインデックスが25（Q25）のベース品質スコアで読み取り、ゼロ不一致が分離プロセス中に保たれていることを確認します。ウイルスゲノムは、発散ウイルス2,4-6のための具体的なバイオインフォマティクスパイプラインを使用して組み立てられています。これらのツールは、https://github.com/broadinstitute/viral-ngsで、または商用クラウドプラットフォーム4を介して使用できます。 <table border="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> ステップ1.1：DNアーゼ反応 </td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td>反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td> 10倍のDNaseバッファー</td><td> 7 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 6 </td></tr><tr><td>抽出されたウイルスRNA </td><td> 55 </td></tr><tr><td> DNアーゼ（2 U /＆＃181;リットル） </td><td> 2 </td></tr><tr><td>全容積</td><td> 70 </td></tr><tr><td> ステップ2.1：5×ハイブリダイゼーションバッファー </td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td> 1ミリリットルのための容量（μL） </td></tr><tr><td> 5 M NaClを</td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 Mトリス-HCl（pH7.4） </td><td> 500 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 300 </td></tr><tr><td>全容積</td><td>千</td></tr><tr><td> ステップ2.1：10倍のRNase H反応バッファー </td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td> 1ミリリットルのための容量（μL） </td></tr><tr><td> 5 M NaClを</td><td> 200 </td></tr><tr><td> 1 Mトリス-HCl（pH7.5） </td><td> 500 </td></tr><tr><td> 1 MのMgCl 2 </td><td> 200 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 500 </td></tr><tr><td>全容積</td><td>千</td></tr><tr><td> ステップ2.1：水のwi番目の直鎖状アクリルアミド</td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td> 1ミリリットルバッファの容量（μL） </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 992 </td></tr><tr><td>直鎖状アクリルアミド（5 mg / mlで） </td><td> 8 </td></tr><tr><td>全容積</td><td>千</td></tr><tr><td colspan="2"> ステップ2.2：選択的枯渇するためのハイブリダイゼーション反応 </td></tr><tr><td>試薬</td><td>反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td> 5×ハイブリダイゼーションバッファー</td><td> 2 </td></tr><tr><td> rRNAを枯渇オリゴミックス（100μM） </td><td> 1.22 </td></tr><tr><td>オリゴ（d）のT（550 NG /μL） </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DNアーゼ処理した総RNA </td><td> 5まで</td></tr><tr><td>スパイクにRNA（これはオプションです） </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> （直鎖状アクリルアミドとの）水</td><td> 10総に持ち出します</td></tr><tr><td>総volu私に</td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> ステップ2.3：選択的枯渇のためのRNase H反応 </td></tr><tr><td>試薬</td><td>反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td> 10倍のRNase H反応緩衝液</td><td> 2 </td></tr><tr><td> （直鎖状アクリルアミドとの）水</td><td> 5 </td></tr><tr><td>耐熱性リボヌクレアーゼH（5 U /μl）を</td><td> 3 </td></tr><tr><td>全容積</td><td> 10 </td></tr><tr><td colspan="2"> ステップ2.4：DNアーゼ反応後の選択的枯渇 </td></tr><tr><td>試薬</td><td>反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td> 10倍のDNaseバッファー</td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> （直鎖状アクリルアミドとの）水</td><td> 44.5 </td></tr><tr><td> RNaseインヒビター（20 U /μl）を</td><td> 1 </td></tr><tr><td> RNaseフリーのDNase I（2.72 U /μl）を</td><td> 2 </td></tr&gt; <tr><td> （RNアーゼHの反応を含む）の合計量</td><td> 75 </td></tr><tr><td colspan="2"> ステップ3.1：cDNA合成、ランダムプライマーハイブリダイゼーション </td></tr><tr><td>試薬</td><td>反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td> rRNA /キャリアが枯渇したRNA </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3μgのランダムプライマー</td><td> 1 </td></tr><tr><td>全容積</td><td> 11 </td></tr><tr><td> 第一鎖cDNA合成反応：3.2手順 </td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td>容量（μL） </td></tr><tr><td> 5Xファーストストランド反応緩衝液</td><td> 4 </td></tr><tr><td> 0.1 M DTT </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 10mMのdNTPミックス</td><td> 1 </td></tr><tr><td> RNaseインヒビター（20 U /μl）を</td><td> 1 </td></tr><tr><td>逆転写酵素（最後の追加） </td><td> 1 </td></tr><tr><td> （上記RNAとの）総容量&lt;/ TD&gt; <td> 20 </td></tr><tr><td colspan="2"> ステップ3.3：第二鎖cDNA合成反応 </td></tr><tr><td>試薬</td><td>容量（μL） </td></tr><tr><td> RNaseフリー水</td><td> 43 </td></tr><tr><td> 10倍の第二鎖反応緩衝液</td><td> 8 </td></tr><tr><td> 10mMのdNTPミックス</td><td> 3 </td></tr><tr><td> 大腸菌 DNAリガーゼ（10 U /μl）を</td><td> 1 </td></tr><tr><td> 大腸菌 DNAポリメラーゼI（10 U /μl）を</td><td> 4 </td></tr><tr><td> 大腸菌のRNase H（2 U /μl）を</td><td> 1 </td></tr><tr><td> （第1鎖反応を含む）全体積</td><td> 80 </td></tr><tr><td> ステップ4.2：Tagmentation反応 </td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td>容量（μL） </td></tr><tr><td>アンプリコンTagmentミックス（ATM） </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tagment DNAバッファー（TD） </tD&gt; <td> 5 </td></tr><tr><td> （cDNAでの）総体積</td><td> 10 </td></tr><tr><td> ステップ4.3：ライブラリーのPCR反応 </td><td></td></tr><tr><td>試薬</td><td>容量（μL） </td></tr><tr><td> PCRマスターミックス（NPM） </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td>インデックス1プライマー（I7） </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td>インデックス2プライマー（I5） </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> （tagmented cDNAでの）総体積</td><td> 25 </td></tr><tr><td> ステップ4.3.2：ライブラリPCR条件 </td><td></td></tr><tr><td> 72℃、3分</td><td></td></tr><tr><td> 95℃、30秒</td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 95℃で18サイクル、10秒、55℃で30秒、30秒まで72℃で</td></tr><tr><td> 72℃、5分</td><td></td></tr><tr><td>永遠に10°C、 </td><td></td></tr></tbody></table>表1：反応セットアップおよびバッファステップバイステップの全てのバッファとの反応混合物の内容を持つテーブル。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> オリゴ名 </td><td> 配列（5 &#39;から3&#39;） </td></tr><tr><td>エボラKGH FW </td><td> GTCGTTCCAACAATCGAGCG </td></tr><tr><td>エボラKGH RV </td><td> CGTCCCGTAGCTTTRGCCAT </td></tr><tr><td>エボラKULESH FW </td><td> TCTGACATGGATTACCACAAGATC </td></tr><tr><td>エボラKULESH RV </td><td> GGATGACTCTTTGCCGAACAATC </td></tr><tr><td>ラッサSL FW </td><td> GTA AGC CCA GCD GYAのAABのCC </td></tr><tr><td>ラッサSL RV </td><td> AAG CCA CAG AAA RCT GGS AGC A </td></tr><tr><td> 18S rRNAのFW </td><td> TCCTTTAACGAGGATCCATTGG </td></tr><tr><td> 18S rRNAのRV </td><td> CGAGCTTTTTAACTGCAGCAACT </td></tr></tbody></tことができます&gt; 表2：定量RT-PCRプライマー配列ホスト（18SリボソームRNA）およびウイルス（エボラおよびラッサ）含量を測定するために使用したプライマー。 「KGHは「エボラプライマーは2を試験したシエラレオネ、中ケネマ政府病院です。 「Kuleshは&#39;プライマーセット14設計研究者です。 表3：リボソームRNA（rRNAの）枯渇オリゴ選択的枯渇のステップ6のためのヒトのrRNAに相補的な195の50ヌクレオチド長の配列が、 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54117/Table_3.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

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Unbiased Deep Sequencing of RNA Viruses from Clinical Samples

This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

臨床サンプルからのRNAウイルスの公平なディープシーケンシング

Here we outline a next-generation RNA sequencing protocol that enables de novo assemblies and intra-host variant calls of viral genomes collected from ...

unbiased-deep-sequencing-of-rna-viruses-from-clinical-samples

Research

JoVE Journal

Medicine

16.9K ビュー.  Broad Institute of MIT and Harvard. This protocol describes a rapid and broadly applicable method for unbiased RNA-sequencing of viral samples from human clinical isolates.

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

免疫・感染学

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below 50-75 copies/ml) is necessary to gain insight to viral dynamics and virus host interactions in patients who naturally control the infection and those who are on combination antiretroviral therapy (cART). 
Here we describe how to amplify viral genomes by single genome sequencing (the SGS protocol) 13, 19 and how to accurately quantify HIV-1 RNA in patients with low viral loads (the single-copy assay (SCA) protocol) 12, 20. 
The single-copy assay is a real-time PCR assay with sensitivity depending on the volume of plasma being assayed. If a single virus genome is detected in 7 ml of plasma, then the RNA copy number is reported to be 0.3 copies/ml. The assay has an internal control testing for the efficiency of RNA extraction, and controls for possible amplification from DNA or contamination. Patient samples are measured in triplicate.
The single-genome sequencing assay (SGS), now widely used and considered to be non-labor intensive 3, 7, 12, 14, 15,is a limiting dilution assay, in which endpoint diluted cDNA product is spread over a 96-well plate. According to a Poisson distribution, when less than 1/3 of the wells give product, there is an 80% chance of the PCR product being resultant of amplification from a single cDNA molecule. SGS has the advantage over cloning of not being subjected to resampling and not being biased by PCR-introduced recombination 19. However, the amplification success of SCA and SGS depend on primer design. Both assays were developed for HIV-1 subtype B, but can be adapted for other subtypes and other regions of the genome by changing primers, probes, and standards.

Quantifying levels of HIV-1 RNA in plasma and sequencing single HIV-1 genomes from individuals with viral loads below the limit of detection (50-75 copies/ml) is difficult. Here we describe how to extract and quantify plasma viral RNA using a real time PCR assay that reliably measures HIV-1 RNA down to 0.3 copies/ml and how to amplify viral genomes by single genome sequencing, from samples with very low viral loads.

標準的な臨床アッセイによる検出限界以下のウイルス量とHIV感染個体におけるHIV - 1 RNAを増幅して定量化

Amplifying viral genes and quantifying HIV-1 RNA in HIV-1 infected individuals with viral loads below the limit of detection by standard assays (below ...

High-throughput, Automated Extraction of DNA and RNA from Clinical Samples using TruTip Technology on Common Liquid Handling Robots

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. The geometry of the monolith can be adapted for specific pipette tips ranging in volume from 1.0 to 5.0 ml. The large porosity of the monolith enables viscous or complex samples to readily pass through it with minimal fluidic backpressure. Bi-directional flow maximizes residence time between the monolith and sample, and enables large sample volumes to be processed within a single TruTip. The fundamental steps, irrespective of sample volume or TruTip geometry, include cell lysis, nucleic acid binding to the inner pores of the TruTip monolith, washing away unbound sample components and lysis buffers, and eluting purified and concentrated nucleic acids into an appropriate buffer. The attributes and adaptability of TruTip are demonstrated in three automated clinical sample processing protocols using an Eppendorf epMotion 5070, Hamilton STAR and STARplus liquid handling robots, including RNA isolation from nasopharyngeal aspirate, genomic DNA isolation from whole blood, and fetal DNA extraction and enrichment from large volumes of maternal plasma (respectively).

TruTip is a simple nucleic acid extraction technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a pipette tip. Consequently, the sample preparation format is compatible with most liquid handling instruments, and can be used for many medium to high-throughput clinical applications and sample types.

共通液ハンドリングロボットでTruTipテクノロジーを使用して臨床検体からのDNAやRNAのハイスループット、自動抽出

TruTip is a simple nucleic acid extraction  technology whereby a porous, monolithic binding matrix is inserted into a  pipette tip. The geometry of the ...

生物工学

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

遺伝学

Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for several different viruses. These approaches utilize an overlapping amplicon-based approach which can be used to target a specific virus or group of genetically related viruses. In addition to confirmation of the virus presence, sequencing can be used for genomic epidemiology studies, to track viruses and unravel origins, reservoirs and modes of transmission. For such applications, it is crucial to understand possible effects of the error rate associated with the platform used. Routine application in clinical and public health settings require that this is documented with every important change in the protocol. Previously, a protocol for whole genome Usutu virus sequencing on the nanopore sequencing platform was validated (R9.4 flowcell) by direct comparison to Illumina sequencing. Here, we describe the method used to determine the required read coverage, using the comparison between the R10 flow cell and Illumina sequencing as an example.

We previously validated a protocol for amplicon-based whole genome Usutu virus (USUV) sequencing on a nanopore sequencing platform. Here, we describe the methods used in more detail and determine the error rate of the nanopore R10 flow cell.

全ゲノムナノポアシーケンシングの検証、例としてUsutuウイルスを用いた

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for ...

Quantification and Whole Genome Characterization of SARS-CoV-2 RNA in Wastewater and Air Samples

Wastewater-based epidemiology has emerged as a promising and efficacious surveillance system for SARS-CoV-2 and other infectious diseases in many nations. The process typically involves wastewater concentration, nucleic acid extraction, amplification of selected genomic segments, and detection and quantification of the amplified genomic segment. This methodology can similarly be leveraged to detect and quantify infectious agents, such as SARS-CoV-2, in air samples. Initially, SARS-CoV-2 was presumed to spread primarily through close personal contact with droplets generated by an infected individual while speaking, sneezing, coughing, singing, or breathing. However, a growing number of studies have reported the presence of SARS-CoV-2 RNA in the air of healthcare facilities, establishing airborne transmission as a viable route for the virus. This study presents a composite of established protocols to facilitate environmental detection, quantification, and sequencing of viruses from both wastewater and air samples.

This protocol aims to quantify SARS-CoV-2 RNA in wastewater and air samples to be used for wastewater-based epidemiology studies and to assess the exposure risk to SARS-CoV-2 in indoor and outdoor aerosols. This protocol also describes a tiled amplicon long-template sequencing approach for SARS-CoV-2 whole genome characterization.

廃水および大気サンプル中のSARS-CoV-2 RNAの定量と全ゲノム特性評価

Wastewater-based epidemiology has emerged as a promising and efficacious surveillance system for SARS-CoV-2 and other infectious diseases in many nations. ...

環境学

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

新しいウイルスのゲノムを発見する感染葉からの RNA の解析とウイルス粒子粗抽出 DNA の結合解析

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries implemented strategies based on direct human testing, face covering, and surface disinfection. Under the assumption that the main route of transmission includes aerosols and respiratory droplets, efforts to detect SARS-CoV-2 in fomites have focused on locations suspected of high prevalence (e.g., hospital wards, cruise ships, and mass transportation systems). To investigate the presence of SARS-CoV-2 on surfaces in the urban environment that are rarely cleaned and&#160;seldomly disinfected, 350 citizens were enlisted from the greater San Diego County. In total, these citizen scientists collected 4,080 samples. An online platform was developed to monitor sampling kit delivery and pickup, as well as to collect sample data. The sampling kits were mostly built from supplies available in pandemic-stressed stores. Samples were processed using reagents that were easy to access despite the recurrent supply shortage. The methods used were highly sensitive and resistant to inhibitors that are commonly present in environmental samples. The proposed experimental design and processing methods were successful at engaging numerous citizen scientists who effectively gathered samples from diverse surface areas. The workflow and methods described here are relevant to survey the urban environment for other viruses, which are of public health concern and pose a threat for&#160;future pandemics.

A citizen science project was designed to recruit San Diego residents to collect environmental samples for SARS-CoV-2. A multilingual web-based platform was created for data submission using a user-friendly mobile device interface. A laboratory information management system facilitated the collection of thousands of geographically diverse samples with real-time outcome tracking.

都市環境のスワッピング - 環境貯留層からのSARS-CoV-2のサンプリングと検出のためのパイプライン

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

生物学

低所得国における狂犬病制御のためのナノポアベースのゲノムアプローチ

Whole Genome Sequencing for Rapid Characterization of Rabies Virus Using Nanopore Technology

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic surveillance remains limited in many low- and middle-income countries (LMICs), where dog-mediated rabies and/or rabies transmitted by wildlife such as vampire bats pose major public health and economic concerns. We present here a rapid and affordable sample-to-sequence-to-interpretation workflow using nanopore technology. Protocols for sample collection and the diagnosis of rabies are briefly described, followed by details of the optimized whole genome sequencing workflow, including primer design and optimization for multiplex polymerase chain reaction (PCR), a modified, low-cost sequencing library preparation, sequencing with live and offline base calling, genetic lineage designation, and phylogenetic analysis. Implementation of the workflow is demonstrated, and critical steps are highlighted for local deployment, such as pipeline validation, primer optimization, inclusion of negative controls, and the use of publicly available data and genomic tools (GLUE, MADDOG) for classification and placement within regional and global phylogenies. The turnaround time for the workflow is 2-3 days, and the cost ranges from $25 per sample for a 96 sample run to $80 per sample for a 12 sample run. We conclude that setting up rabies virus genomic surveillance in LMICs is feasible and can support progress toward the global goal of zero dog-mediated human rabies deaths by 2030, as well as enhanced monitoring of wildlife rabies spread. Moreover, the platform can be adapted for other pathogens, helping to build a versatile genomic capacity that contributes to epidemic and pandemic preparedness.

著者スポットライト:リソースが限られている環境で狂犬病制御を進めるための費用対効果の高いゲノムワークフロー 

Here, we present a rapid and cost-effective workflow for characterizing rabies virus (RABV) genomes using nanopore technology. The workflow is intended to support genomics-informed surveillance at a local level, providing information on circulating RABV lineages and their placement within regional phylogenies to guide rabies control measures.

ナノポア技術を用いた狂犬病ウイルスの迅速な特性評価のための全ゲノムシーケンシング

Genomic data can be used to track the transmission and geographic spread of infectious diseases. However, the sequencing capacity required for genomic ...