この研究は、ガスポンプハンドル、遊び場、ATMなど、都市環境でほとんど洗浄されない表面上のSARS-CoV-2を検出するための新しいワークフローを提示する。パンデミックでは、物資が不足しています。簡単に入手できる材料や試薬、装置を基本的な実験室で利用しています。
RNAをコールドチェーンなしで保存する抽出法と、阻害剤に耐性のある検出方法を使用しています。このプロトコルは公衆衛生上の利益です。これは、将来の世界的な流行の間に現在のCOVID-19パンデミックおよび他の感染性薬剤のための環境ウイルス貯留層の評価のためのフレームワークを提供する。
地元やソーシャルメディアを通じてリリースされた行動への直接的かつ明確な呼びかけを使用して市民科学者を募集します。ソーシャル メディア のコンテンツ間でトピックを接続するためのソーシャル メディア ハンドルを作成します。オンラインフォームで指定されたバイオセーフティ関連の質問に答えることによって、個人が環境サンプリングの取り組みに参加するために適用できるように、多言語でナビゲーションを可能にする多言語プラグインを提供し、SMPへのリンクを作成します。
英語とスペイン語のサンプリング セクショングラフィックとオーディオビジュアル プロトコルに含めます。クラウド コンピューター サービス プロバイダーが容易に行う地理空間アプリケーション プログラミング インターフェイスを使用して、地理空間データを視覚化します。SMP を介して LIMS に送信されたデータを保存して、一元化されたストレージ、処理ワークフローの追跡、およびロジスティクスの管理を容易にします。
サンプル キット ID、サンプル ID、日付、時刻、および全地球測位システム座標などの事前読み込み情報により、データ型の準拠を有効にし、エラーを最小限に抑えることができます。参加者の集荷要求リンクのサンプルを含めます。マスクや手袋、サンプリングプロトコル、バイオセーフティ関連情報など、必要な個人用保護具を含むすべてのサンプリング用品を含むキットを構築します。
綿棒は、洗剤で1センチメートルの正方形のポリエステル吸収綿棒を濡らし、10センチメートル平方の表面を振り回すことによって、家庭や都市環境で表面を消毒することはめったにありません。爪楊枝に助けられ、200マイクロリットルのグアニジニウム・チオシアネートを含む事前標識チューブに各サンプル綿棒を沈下させる。クロスコンタミネーションを避けるために、各サンプルの収集用に用意されたマスクと新しい手袋を着用してください。
サンプリングを終了した後、付属の手指消毒剤を使用してください。彼らは実験室に輸送されるまで、4摂氏でチューブを保存します。サンプルが実験室に到着したら、マイナス80度で保管してください。
スクリーニングの速度を上げるには、サンプルをプールで処理します。プールが陽性の場合は、各サンプルのRNAを個別に抽出します。各サンプルサンプルを2つのプールに組み合わせるには、8個のサンプルの50マイクロリットルをマイクロ遠心チューブにプールし、残りのサンプルをマイナス80°Cで保存します。
80マイクロリットルのクロロホルムと渦を15秒間加えます。その後、摂氏4度で20分間インキュベートします。摂氏4度で20分間Gの13,000倍の遠心分離機。
水性層を新しいマイクロ遠心チューブに移します。残りのインターフェースとピンクの液体をマイナス80°Cの冷凍庫に保管してください。これらの画分にはDNAとタンパク質が含まれています。
回収した水層から、グアニジニウム・チオシアネートベースのRNA粗抽出プロトコルを用いてRNAを抽出する。10%の過剰なボリュームで室温でRT-LAMP反応ミックスを準備し、ピペッティングロスを考慮します。サンプル反応に5マイクロリットルのRNAと5マイクロリットルのRNAと合成SARS-CoV-2 RNAの2.5マイクロリットルをスパイク反応に加えます。
2.5マイクロリットルの合成SARS-CoV-2 RNAを正のコントロールに加え、5マイクロリットルの水を陰性対照に加えます。よく混ぜて、反応をスピンダウンします。測色観測では、負の結果はピンクで示され、正の結果は黄色で示されます。
RT-LAMPの後、ゲル電気泳動を行う。サンプルコレクションサイトの分布を以下に示します。キットの大半が完成し、対応するデータがLIMSにアップロードされました。
100%の頻度での検出の限界は、反応の25マイクロリットルあたり500コピーであった。カラーメトリック RT-LAMP では、pH シフトが 8 から 5.5 に変わったため、正のサンプルがピンクから黄色に色を変更しました。低いコピー数では、サンプルをアガロースゲル上で実行し、得られたはしご状のパターンで陽性を確認した。
RT QPCR法は環境試料で試験した。すべてのマスターミックスは、陽性対照の低コピー数濃度で阻害剤に敏感であった。テンプレートの低濃度では、従来のRT PCR法は偽陽性および偽陰性を示した。
最後に、ローリングサークル増幅と呼ばれる技術は、ターゲットシーケンスの少量を検出しました。しかし、RNAテンプレートがない場合にはプローブの増幅を示した。サンプリングは本当にそのコミュニティのすべてのメンバーの暴露のリスクを表すために、コミュニティのすべてのセクターに到達する行動への呼びかけをリリースすることが重要です。
このフレームワークはSARS-CoV-2遺伝物質を検出する。ウイルスの生存率をテストするための研究は、次のステップです。
