この作品は、シンガポールNRFの交わり（NRF-2011NRF-NRFF001-025）ならびにCBRG（NMRC / CBRGは/ 0070/2014）によって賄われていました。

注：この研究の文脈で目的のRNAは、AR 3&#39;UTRの断片です。 ビオチン標識RNAの調製<ol><li> RNAを得るために、市販のキットを用い、製造業者の指示11を以下のインビトロ転写に続いて、PCRによってT7-AR-オリゴを増幅します。 注：PCR用プライマーは、表4に記載されています：T7-AR-FおよびT7-AR-R。 </li><li>非特異的結合を制御するために、 インビトロ転写、続いpsiCHECK-2プラスミドからPCRによってホタルルシフェラーゼ（FL）、DNAの部分配列を増幅します。 注：PCR用プライマーは、表4に記載されています：hluc（+） - T7-プローブ-Fとhluc（+） -プローブ-R 表4 PCR増幅のための鋳型とプライマーの配列。。。 </li><li> 50μlのPCR反応のために、50 ngのDNAを（オリゴまたはプラスミド）を混ぜて、4μlのdNTPを（各個々のdNTP 2.5 mMの）、5μlの10×反応緩衝液、1μlの2.5 U /＆＃181;リットルのDNAポリメラーゼ、2μlの10μMのフォワードプライマー、2μlの10μMのリバースプライマー、およびヌクレアーゼフリー水。 <ol><li>以下のプログラムを使用して、サーマルサイクラーでのPCR増幅を実行します。 STEP1：2分間95℃での一回; STEP2：30秒（AR）または60秒（FL）のための30秒、72℃30秒間、95℃の35サイクル、55°C; STEP3：10分間72℃での一回。 </li></ol></li><li>製造元の説明書11以下のin vitro転写キットを用いてビオチン化RNAを合成します。この実験では、RNA合成のための鋳型としてPCR産物を使用します。 20μlのin vitro転写反応のために、200 ngのPCR増幅されたDNAは、各個々のNTPの2μlを、1μlの10mMのビオチンCTP、2μlの10×反応緩衝液、および2μlのT7 RNAポリメラーゼを混ぜます。 4時間37℃で混合物をインキュベートします。 </li><li> インビトロ転写に続いて、37＃で1μlの2 U /μlのDNaseで反応混合物を処理176; Cは、15分間鋳型DNAを分解する。最後に、その後の精製のために60μlの総体積にビオチン化RNAを希釈します。 </li><li>製造業者の説明書12以下の精製カラムを用いて、塩および取り込まれなかったヌクレオチドを除去するために、ビオチン化RNAを精製します。その後のプルダウンアッセイのために-80℃でRNA濃度とストアを測定します。 </li><li> 2分、2分間氷上で寒さのために90℃でRNA-タンパク質相互作用、熱50μlのビオチン化RNA（50 PM）への関心のRNAのための適切な二次構造を確保するために、その後、50μlの2倍のRNA構造のバッファ（ 表と供給3）30分13,14 RTで折りたたみRNAを可能にします。 </li></ol> RNA結合ビーズの調製注：磁気ビーズと上清を分離するための磁気スタンドを使用してください。 <ol><li>簡単なvorteによって、元のバイアル中のストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを再懸濁し製造者の指示に従って興。 1.5mlチューブにビーズを再懸濁し、150μlのを転送します。 1分間磁石上にチューブを置きます。上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 注：RNAプルダウンアッセイでは、元のバイアルから再懸濁ビーズを分取、MSが続くアッセイのためにウェスタンブロッティングに続いて、アッセイのための50μlのビーズ、および200μlのビーズを使用します。 </li><li>再懸 ​​濁し、製造元の推奨1xのW＆Bの1mlでビーズペレットを（結合および洗浄）バッファー（ 表3）によって一度ビーズを洗浄し、ローテーターで、室温で5分間チューブを回転させることによって行いました。上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 </li><li> 400μlの緩衝液A緩衝液Aでビーズペレットを再懸濁することにより、毎回、ビーズ上のRNaseを不活化二回ビーズを洗浄するには、0.1M NaOHおよび0.05 M NaClを（ 表3）を含むアルカリ性溶液です。ローテーターで、室温で2分間チューブを回転させます。上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 </li> &lt;李&gt;は回転子に室温で2分間、チューブを回転させることで、その後再懸濁し、400μlの緩衝液Bでビーズペレットを（ 表3）、によって、二回ビーズを洗浄し、ビーズから毎回のNaOHを削除します。上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 </li><li> 300μlの2倍のW＆B緩衝液で再懸濁ビーズペレットは、スプリットビーズ均等と3 1.5ミリリットルのチューブ（チューブあたり100μlのビーズ）に移します。 100μlのRNaseフリー水でビーズを含有するチューブを供給し、FLのRNAとそれぞれ、AR 3&#39;UTR RNAをビオチン化し、100μlのビオチン化を100μl。 </li><li>回転させながら室温で1時間各ビーズ混合物をインキュベートします。 1分間磁石上にチューブを入れます。すべての上清を捨てます。ビーズペレットを保管してください。 </li><li> 400μlの1×W＆B緩衝液を用いて各ビーズペレットを再懸濁することにより、二回毎回ビーズを洗浄し、ローテーターで室温で5分間、チューブを回転させることによって行いました。 </li><li> 1分間磁石上にチューブを入れます。すべての上清を捨てます。再懸濁し、各ビーズPELLE50μlの核単離緩衝液（ 表3）でトン。 </li></ol> 3.前脂肪細胞の単離と脂肪生成誘導<ol><li>以前の刊行物5に記載したように、肩甲骨間の褐色脂肪パッド（3週齢C57BL6野生型マウス）からの前脂肪細胞を分析。 </li><li>成長し、in vitroで前脂肪細胞5を区別します 。細胞は4-5日分化の開始後に下流側のアプリケーションのための準備が整いました。 </li></ol>プライマリ脂肪細胞からの細胞溶解物の4準備注：細胞溶解物の準備のすべての手順を確認し、氷上で行われ、すべてのバッファを氷上で冷却されています。氷上でプレチルダウンスガラスホモジナイザー。 <ol><li>成長すると15cmの皿5（セクション3.2を参照）で前脂肪細胞を分化します。各皿には、1つのRNAプルダウンアッセイのための適切な細胞を提供します。分化の4日目または5日目に、細胞培養培地、および洗浄CEを破棄する1×PBSで一度LLS。 </li><li>収穫細胞に、細胞を10〜15 mlの1×PBSを追加し、室温で5分間、200×gでの遠心分離によって50mlチューブ中の細胞を収集するためにこすり、ペレット細胞。 1ミリリットルピペットを使用して、上清を捨てます。 </li><li> 2ml中に再懸濁細胞ペレットを低張緩衝液（ 表3）、そして氷上で15分間細胞をインキュベートします。転送15ミリリットルダウンスガラスホモジナイザーに細胞、および機械的に氷上で20ストロークでせん断セル。 </li><li> 4℃で15分間、3300×gでの遠心分離によってペレットは、細胞核。さらに使用するために氷上で核ペレットにしてください（セクション4.6を参照）。 1.5ミリリットルチューブに上清を移し、150mMのの最終濃度を得るために、上清に3MのKClを追加し、4℃で15分間20,000×gでスピン。 </li><li>遠心分離後、慎重に1ミリリットルピペットを用いて、トップlipidlayeron削除、および細胞質細胞溶解物として上清を収集します。 </li><li>核ペレットを再懸濁1ミリリットル核単離緩衝液中（4.4節を参照）。 Transfer核機械的に100ストロークで、氷上で15ミリリットルダウンスガラス1ミリリットルピペットを用いて、ホモジナイザー、およびせん断核へ。 4℃で15分間20,000×gで遠心分離することによって、核破片をペレット化し、そして核細胞溶解物として上清を収集します。 </li><li>核と細胞質の細胞溶解物を組み合わせ、または下流プルダウンアプリケーションのために、個別に各画分のいずれかを使用します。このデモ実験では、細胞溶解物のこれら2つの画分1の体積比で混合した：1。 </li><li> 0.5 U /μlの最終濃度を得るために、この未分画の細胞溶解物にRNase阻害剤を加えます。ウェスタンブロッティング15のための入力制御として、細胞溶解物の脇に100μLを設定します。 </li></ol> 5.結合およびRBPの溶出<ol><li>スプリットセル3つの等しいアリコートに溶解液（1.5mlチューブで1ミリリットルの細胞溶解物）、およびブランクでインキュベートは、FL RNA結合型およびAR 3&#39;UTR RNA結合ビーズは4℃で3時間、それぞれ、（2.8節を参照してください） C言語回転に。 </li><li> 1分間磁石上にチューブを入れます。 RNAの完全性を確認するために、上清からのRNAの単離に続いて1ミリリットルピペットを使用して、上清を収集します。製造業者の説明書（ 表2）は、以下の酸グアニジニウムチオシアネート-フェノール溶液を用いてRNAを単離します。リボソームRNAの28Sおよび18Sサブユニットを分析することによって、RNAの完全性を評価します。氷の上にビーズペレットを保管してください。 </li><li>ローテーターで、室温で2分間、チューブを回転させることにより、続いて40 UのRNase阻害剤と0.25％IGEPALを含む1ミリリットルの核単離緩衝液を用いて各ビーズペレットを再懸濁することにより磁気ビーズを6回、毎回洗浄します。磁気ビーズと上清を分離するための磁気スタンドを使用してください。すべての上清を捨てます。氷の上にビーズペレットを保管してください。 </li><li>ウェスタンブロッティングのためのビーズからRNA-タンパク質複合体を溶出するには、次の手順を使用します。まず、75μlの核単離緩衝液中の各ビーズペレットを再懸濁。その後、25μlの4倍ウェスタンブロットローディングBUFを追加FERは、（SDSを含む）を100μlの総容積を得ました。最後に、5分間、95℃で100μlの溶液中のビーズを沸騰。 注：使用は、MSのためのビーズからRNA-タンパク質複合体を溶出するための手順を以下に示します。 STEP1：100μlの溶出バッファー（ 表3）の各ビーズペレットを再懸濁。 STEP2：回転させながら室温で2-3時間、ビーズのサンプルをインキュベート。 STEP3：遠心分離機とタンパク質含有上清を回収。 STEP4：MSの提出前に20〜30μlにタンパク質溶液を濃縮します。 </li><li> 4℃で30秒間12,000×gで遠心分離ビーズサンプルの各100μlを、上清を集めます。ウエスタンブロット分析のためにアリコート15μlの上清（セクション6.1と6.2を参照してください）​​。プローブ希釈HuRのマウスモノクローナル抗体で得られた膜（1：1,000希釈）を、一晩。 </li></ol> RBPの検証6.ウェスタンブロッティング<ol><li>標準的な技術を用いてSDS-PAGEで区切りRBPs。 </li><li>私たちを実施船尾目的のRNAに関連したRBPsのためにプローブすることによって、標準的な技術を用いてブロッティング。 注：このデモ実験では、HuRのマウスモノクローナル抗体のHuRタンパク質の免疫検出のために使用しました。 </li><li> 、脱脂粉乳、1×TBS w / vの5％に：（千希釈1）希釈HuRの抗体と得られた膜をインキュベート 0.1％ トゥイーン- 4で20 一晩、穏やかに振盪しながらC°。 1×TBSTで膜を3回洗浄します。室温で1時間二次抗体（ヤギ抗マウスIgG-HRP）を用いて膜をインキュベートします。ウォッシュ膜。開発し、信号を記録します。 </li></ol>

<ol>
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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+Polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq.">Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li></ol>

利害の衝突が宣言されていません。

lncRNAsとRBPsが健康と病気に重要な役割を持っている、しかし、これらの分子の分子メカニズムはあまり理解されていません。 lncRNA分子と相互作用するタンパク質の同定は、調節機構の解明に向けた重要なステップです。 RNAプルダウンアッセイシステムによってRBPsの濃縮は、溶液内の細胞溶解物からのタンパク質は選択的にストレプトアビジン磁気ビーズに結合したビオチン化RNAベイトを用いて抽出することができるように、複雑な相互作用の捕捉に基づいています。このようなチャープ、CHARTとRAPのようないくつかの他の方法は、しかし、これらの方法は、RNAプルダウン技術の16,17,18よりも設定する手間がかかり、同じ目標を達成することができます。 RNAプルダウンの主な強みは、比較的単純なプロトコル及び実行が容易であることです。両方CHIRPとRAPは、RNA-タンパク質複合体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドのフルセットの設計を天然に存在する保存する架橋工程を伴う（90 nucleotides長いRAPで、および20ヌクレオチド長チャープで）ターゲット全体RNA 16,17,18をタイリングします。 RNAの折り畳みは、RNAプルダウンアッセイにおける重要なステップです。このプロトコルの主な制限は、標的RNAをin vitroで合成され、正しく適切なそのRBP（複数可）との結合を可能にするために天然構造に折り畳まれないことです。誤って折り畳まれた非ネイティブのRNAは、RNA -タンパク質相互作用を形成し、唯一の非生理学的条件の下で、in vitroで起こる機能アッセイ、またはフォームの相互作用を無効にするために失敗するかのいずれかであり得ます。ここで説明するプルダウンプロトコルは13,14の折りたたみRNAについて十分に認識された手順を採用しているが、それは他のRNA転写物のための適切な折り畳みを保証するものではない、（セクション1.7を参照）。 RNAプルダウンは、多くの場合、関心19のRBPによって結合したRNA（複数可）を検出するための補完的なアプローチとして、RIPに結合されています。このプロトコルでもう一つの重要なステップは、全細胞から脂質画分を除去することです溶解液の成熟脂肪細胞における高脂質豊富で、主要な技術的課題を提示しているため（セクション4.5を参照）。ここで説明するプロトコルは、特に、脂肪細胞での使用のために開発されています。しかしながら、このプロトコルと使用されるすべてのバッファのストリンジェンシーの基本的な構成要素は、変更され、他の細胞培養モデルへの適用のために適合させることができる。内因性RNアーゼの高いレベルを有する組織は、異なるRNAプルダウンプロトコルが適用されてもよいです。 関連するRBPsを識別するために、関心のRNAを使用するRNAのプルダウンが、lncRNAsの中枢機能とメカニズムを調査するための効果的かつ効率的な技術である、ヒト細胞における役割の広い範囲を持っています。 RNAプルダウンなどのRNAベースのキャプチャの将来の発展は、RNA-タンパク質複合体の構成要素、アセンブリ、および機能を定義するだけでなく、MSのための低豊富なRNA-タンパク質複合体から十分RBPsを生成するとの課題に対処するために必要とされるであろう。

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Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPsは、細胞内で二本鎖または一本鎖RNAに結合し、RNA-タンパク質複合体の形成に関与するタンパク質です。 RBPsは、mRNAと長い非コードRNA（lncRNAs）を含むRNA種の多様性を結合し、転写後のレベルで自分の影響力を発揮することができます。 RBPsとlncRNAsの両方が脂肪の発達と機能1,2,3における新規調節因子として浮上しています。細胞経路のRBP-とlncRNA媒介調節のメカニズムを理解するためには、RNAのタンパク質パートナーの完全なスペクトルを識別するために、時々、特定のRNA分子および1つまたはいくつかのRBPsの間の相互作用を検出することがしばしば必要であり、かつ転写産物。しかし、実験が原因脂肪細胞中の脂質の含有量が高いに挑戦することができます。ここで説明するRNAプルダウンプロトコルは、初代培養4,5の脂肪細胞溶解物から特定 ​​のRNAのタンパク質パートナーを取得するために使用することができます。 このプロトの根拠次のようにcolが要約されています。 RNAの餌は、DNAテンプレートから転写された試験管 、ビオチン標識したストレプトアビジンをコーティングした磁気ビーズ4に共役です 。 RNAの餌は、その後、磁気スタンド上にプルダウンされているRNA-タンパク質複合体の形成を可能にするために、細胞溶解物と共にインキュベートします。具体的には、RNAプルダウンプロトコルは、以下に記載のHuRタンパク質、初代培養のtheadipocytelysateから、mRNAを6,7の3&#39;UTRに結合された普遍的に発現RBPを取得するために餌としてAR 3&#39;UTRからRNA断片を使用します。このアッセイの結合特異性を試験するために、非関連RNAasだけでなく、空白のストレプトアビジンビーズを対照として含まれています。このプロトコルは、特定のRBPのキャプチャを確認したり、撮影しRBPs、それぞれ8の完全なレパートリーを識別するために、ウエスタンブロッティングまたは質量分析法（MS）と互換性があります。 いくつかの技術は、RNA-タンパク質相互作用を研究するために利用可能です秒。所与RBPによって拘束RNAを明らかにするために、RIP（RNA免疫沈降）及びCLIP（UV架橋及び免疫沈降）を適用することができます。対照的に、与えられたRNA、RNAプルダウン、チャープ（RNA精製によってクロマチン分離）、グラフ（RNA標的の捕獲ハイブリダイゼーション分析）のタンパク質パートナーを識別し、RAP（RNAアンチセンス精製）を適用することができます。それ以降のものと比較して、RNAプルダウン技術が設定する労力がかかります。 in vitroおよびin vivoでタンパク質を捕捉するために使用することができます。技術的に困難なそのin vitro対応物よりもRNAプルダウンのインビボでのアプローチは、細胞内で架橋することによりRNA-タンパク質相互作用を維持し、細胞からの目的のアプタマータグ付きRNAを捕捉し、その後、結合したRBPsを検出します。 RNAプルダウンは低豊富RBPsを濃縮するために使用することができ、細胞調節9,10を制御することで、多様な機能的役割を有するRNA-タンパク質複合体を単離し、同定するために</s&gt;アップ。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Major materials used in this study.</td>
			<td style="width:177px;"></td>
			<td style="width:109px;"></td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript kit</td>
			<td>&#160;Ambion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin-14-CTP&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NucAway spin columns&#160;</td>
			<td>Ambion</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads M-280 Streptavidin&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261)&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005)&#160;</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free)&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffer Saline (1&#215;PBS)</td>
			<td>&#160;HyClone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease inhibitor&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pfu Turbo DNA polymerase&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TRIsure</td>
			<td>&#160;Bioline</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Major equipment used in this study.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend Micro 21R centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorvall Legend X1R centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bio-Rad T100 thermal cycler&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BOECO rotator Multi Bio RS-24&#160;</td>
			<td>BOECO,Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protein gel electrophoresis and blotting apparatus&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2 magnet&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of rna-binding proteins by in vitro rna pull-down in adipocyte culture

RNA結合タンパク質（RBPs）は、脂肪の発達と機能における規制層として浮上しています。 RBPsは、標的mRNAの安定性および翻訳効率に影響を与えることにより、転写後レベルでの遺伝子発現の調節において重要な役割を果たす。 RNAプルダウン技術が広く機構RBP​​s &#39;ならびに長い非コードRNA」（lncRNAs）機能の根底に解明する必要があるRNA-タンパク質相互作用を研究するために使用されています。しかし、脂肪細胞における高脂質存在量は、この実験を行う際の技術的な課題を提起します。ここで詳細なRNAプルダウンプロトコールは、一次脂肪細胞の培養のために最適化されています。脂肪細胞lystateからアデニル酸ウリジル酸が豊富な、そのRBPパートナーを取得する方法を示すために例として使用elementwas、HuRのタンパク質を含むアンドロゲン受容体の（AR）3 &#39;非翻訳領域（3&#39;UTR）からのRNA断片。ここで説明する方法は、間の相互作用を検出するために適用することができますRBPsおよび非コードRNA、ならびに間RBPsとコーディングRNA。

このデモ実験において、AR RNA断片は、結合タンパク質HuRのを捕捉するために餌として使用しました。両方のHuRタンパク質に非関連であるFLのRNAの餌、およびコンジュゲートされていない空白のストレプトアビジンビーズのアリコートを陰性対照としました。 RNA-タンパク質相互作用は、核または細胞質のいずれかで発生することができ、このプルダウンプロトコールは、全または分画（核または細胞質）細胞溶解物のいずれにも適用することができます。ウェスタンブロッティングによるタンパク質の分析は、15μlの未分画の細胞溶解物のサンプルは、（セクション4.8を参照）、無ビーズ入力制御としてのHuRタンパク質を用いてマウス初代培養の脂肪細胞溶解物中で検出されたことを示す、陽性の結果を与えたことを示しモノクローナル抗体。 ARのRNAの溶出画分は、HuRのタンパク質がRNAプルダウンアッセイのためにAR RNA結合ビーズを用いて、脂肪細胞の溶解物中で検出されたことを示す、陽性の結果が得られました。 FL RNA溶出画分とbの両方痩せ細ったビーズのサンプルは、FL RNA断片とのHuRタンパク質との間だけでなく、ブランクビーズとHuRのタンパク質との間の非特異的な相互作用は、このRNAプルダウンアプローチによって検出されないことを示す、否定的な結果を与えました。これら2つの負の対照の結果はまた、AR RNA断片とのHuRタンパク質との間の特異的な相互作用が正常にここで説明するRNAプルダウンプロトコルによって検出されることを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54207/54207fig1.jpg" /> 図1： のHuRのウエスタンブロット検証RNAプルダウンアッセイによってキャプチャ入力 ：再構成された細胞溶解物（細胞質+核溶解液）。ビーズ：空白のストレプトアビジン被覆磁気ビーズからのサンプル。 FLのRNA：FL mRNAと結合したストレプトアビジンビーズ; AR 3&#39;UTR RNA：AR 3&#39;UTR mRNAと結合したストレプトアビジンビーズ;一次抗体：HuRのマウスモノクローナル抗体。二次抗体：ヤギ抗IgG-HRPを-mouse。略称、FL：ホタルルシフェラーゼ、AR：アンドロゲン受容体; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54207/54207fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>遠心</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td></tr><tr><td>分光光度計</td></tr><tr><td>回転子</td></tr><tr><td>タンパク質ゲル電気泳動およびブロッティング装置</td></tr><tr><td>磁石</td></tr></tbody></table> 表1：本研究で用いた主要設備本研究で用いた主な設備。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> インビトロ転写キットで </td></tr><tr><td>ビオチン化RNA </td></tr><tr><td> DNAやRNA断片を回収するためのコラムスピン</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン磁気ビーズ</td></tr><tr><td> HuRのマウスモノクローナル抗体</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG-HRP </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリーの分子生物学グレードの水</td></tr><tr><td>リン酸緩衝食塩水</td></tr><tr><td> RNaseインヒビター</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td> Pfu DNAポリメラーゼ</td></tr><tr><td>酸グアニジンチオシアネート - フェノール溶液</td></tr></tbody></table> 表2：本研究で使用される主要な試薬本研究で使用される主要な試薬。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 2X RNA構造バッファ </td></tr><tr><td> 20mMのトリス-HCl（pH7.4） </td></tr><tr><td> 0.2 MのKCl </td></tr> &lt;TR&gt; <td> 20のMgCl 2 </td></tr><tr><td> 2 mMのDTT </td></tr><tr><td> 0.8 U /μlのRNase阻害剤</td></tr><tr><td> 緩衝液A </td></tr><tr><td> 0.1 MのNaOH </td></tr><tr><td> 0.05 MのNaCl </td></tr><tr><td> 緩衝液B </td></tr><tr><td> 0.1MのNaCl </td></tr><tr><td> 1×W＆B（結合および洗浄）バッファ </td></tr><tr><td> 5 mMのトリス-HCl（pH7.4の） </td></tr><tr><td> 1MのNaCl </td></tr><tr><td> 1×低張緩衝液 </td></tr><tr><td> 10mMのトリス-HCl（pH7.4） </td></tr><tr><td> 10のKCl </td></tr><tr><td> 2のMgCl 2 </td></tr><tr><td> 1mMのDTT </td></tr><tr><td> 1mMのPMSF </td></tr><tr><td> 1×プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td> 1×原子力分離バッファ </td></tr><tr><td> 25mMのトリス-HCl（pH7.4）で</td></tr><tr><td> 150のKCl </td></tr><tr><html><td> 2のMgCl 2 </td></tr><tr><td> 1mMのDTT </td></tr><tr><td> 0.5％IGEPAL（またはRBPsの溶出のための0.25％IGEPAL） </td></tr><tr><td> 1mMのPMSF </td></tr><tr><td> 1×プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td> 0.4 U /μlのRNase阻害剤（または40 U / mlのRNase阻害剤RBPsの溶出のため） </td></tr><tr><td> 1×溶出バッファー </td></tr><tr><td> 1×PBS中2mMのビオチン</td></tr></tbody></table> 表3：本研究で使用した主なソリューション 2xのRNA構造バッファ（セクション1.7を参照）。緩衝液A（2.3節を参照）。緩衝液B（2.4節を参照）。 1×W＆B（結合および洗浄）バッファ（セクション2.2、2.5、2.7を参照のこと）。 1×低張緩衝液（4.3節を参照）。 1xの核単離緩衝液（5.4、5.3、セクション2.8、4.6を参照のこと）。 1×溶出バッファー（注以下のセクション5.4を参照してください）​​。 &gt; &quot;lways <tbody><tr><td> テンプレートとプライマー </td><td colspan="2"> シーケンス </td></tr><tr><td> T7-AR-オリゴ</td><td colspan="2"> 5&#39;- TCT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCT GGG CTT TTT TTT TCT CTT TCT CTC CTT TCT TTT TCT TCT TCC CTC CCT AGC TTA TGA CCG TGG CAG TCT -3 &#39; </td></tr><tr><td> T7-AR-F </td><td colspan="2"> 5&#39;- CTA ATA CGA CTC ACT ATA G -3 &#39; </td></tr><tr><td> T7-AR-R </td><td colspan="2"> 5&#39;- AGA CTG C​​CA CGG TCA TAA GC -3 &#39; </td></tr><tr><td> hluc（+） - T7-プローブ-F </td><td colspan="2"> 5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGGAGCCCCTGCTAACGACATTTACAACGAG-3 &#39; </td></tr><tr><td> hluc（+） - プローブ-R </td><td colspan="2"> 5&#39;-CATAATCATAGGGCCGCGCACACAC-3 &#39; </td></tr></tbody></table> 表4：PCR増幅のための鋳型とプライマーの配列 T7-AR-オリゴ：PCR増幅のためのDNAテンプレート（セクション1を参照してください。0.1）; T7-AR-F：PCR増幅のためのフォワードプライマー（1.1節を参照）。 T7-AR-R：PCR増幅のための逆方向プライマー（1.1節を参照）。 hluc（+） - T7-プローブ-F：PCR増幅のためのフォワードプライマー（セクション1.2を参照）。 hluc（+） - プローブ-R：PCR増幅のための逆方向プライマー（セクション1.2を参照）。

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Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNAプルダウンプロトコルは、RNA結合タンパク質（RBPs）および非コードだけでなく、コーディングRNA間の相互作用の検出のためにここに最適化されています。アンドロゲン受容体（AR）からのRNA断片は、一次褐色脂肪細胞のlystateから、そのRBPを取得する方法を示すために例として使用しました。

RNA結合タンパク質の検出によって、<em&gt;インビトロ</em脂肪細胞培養における&gt; RNAプルダウン

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

23.5K ビュー.  Duke-NUS Medical School.  RNAプルダウンプロトコルは、RNA結合タンパク質（RBPs）および非コードだけでなく、コーディングRNA間の相互作用の検出のためにここに最適化されています。アンドロゲン受容体（AR）からのRNA断片は、一次褐色脂肪細胞のlystateから、そのRBPを取得する方法を示すために例として使用しました。 

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PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR -クリップ - RNA結合タンパク質のトランスクリプトーム全体の結合部位を同定する方法

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

生物学

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

シトクロムの細胞質マイクロインジェクションによるアポトーシスの活性化 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Pull-down of Calmodulin-binding Proteins

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the calcium-binding protein known as calmodulin (CaM)1,2. CaM is involved at multiple levels in almost all cellular processes, including apoptosis, metabolism, smooth muscle contraction, synaptic plasticity, nerve growth, inflammation and the immune response. A number of proteins help regulate these pathways through their interaction with CaM. Many of these interactions depend on the conformation of CaM, which is distinctly different when bound to Ca2+ (Ca2+-CaM) as opposed to its Ca2+-free state (ApoCaM)3.
While most target proteins bind Ca2+-CaM, certain proteins only bind to ApoCaM. Some bind CaM through their IQ-domain, including neuromodulin4, neurogranin (Ng)5, and certain myosins6. These proteins have been shown to play important roles in presynaptic function7, postsynaptic function8, and muscle contraction9, respectively. Their ability to bind and release CaM in the absence or presence of Ca2+ is pivotal in their function. In contrast, many proteins only bind Ca2+-CaM and require this binding for their activation. Examples include myosin light chain kinase10, Ca2+/CaM-dependent kinases (CaMKs)11 and phosphatases (e.g. calcineurin)12, and spectrin kinase13, which have a variety of direct and downstream effects14.
The effects of these proteins on cellular function are often dependent on their ability to bind to CaM in a Ca2+-dependent manner. For example, we tested the relevance of Ng-CaM binding in synaptic function and how different mutations affect this binding. We generated a GFP-tagged Ng construct with specific mutations in the IQ-domain that would change the ability of Ng to bind CaM in a Ca2+-dependent manner. The study of these different mutations gave us great insight into important processes involved in synaptic function8,15. However, in such studies, it is essential to demonstrate that the mutated proteins have the expected altered binding to CaM.
Here, we present a method for testing the ability of proteins to bind to CaM in the presence or absence of Ca2+, using CaMKII and Ng as examples. This method is a form of affinity chromatography referred to as a CaM pull-down assay. It uses CaM-Sepharose beads to test proteins that bind to CaM and the influence of Ca2+ on this binding. It is considerably more time efficient and requires less protein relative to column chromatography and other assays. Altogether, this provides a valuable tool to explore Ca2+/CaM signaling and proteins that interact with CaM.

Calmodulin (CaM) pull-down assay is an effective way to investigate the interaction of CaM with various proteins. This method uses CaM-sepharose beads for efficient and specific analysis of CaM-binding proteins. This provides an important tool to explore CaM signaling in cellular function.

プルダウンカルモジュリン結合タンパク質の

Calcium (Ca2+) is an ion vital in regulating cellular function through a variety of mechanisms. Much of Ca2+ signaling is mediated through the ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

HeLa細胞のトランスフェクションに続いてGaussiaルシフェラーゼmRNA のインビトロ転写とキャッピングの

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA精製によってクロマチンの単離（チャープ）

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

天然のタンパク質からアミロイドの迅速な生成<em&gt;インビトロ</em

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures (MAAC)

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments for T2D, more physiologically relevant in vitro adipocyte models are required. This study describes a new technique to isolate and culture mature human adipocytes. This method is entitled MAAC (membrane mature adipocyte aggregate culture), and compared to other adipocyte in vitro models, MAAC possesses an adipogenic gene signature that is the closest to freshly isolated mature adipocytes. Using MAAC, adipocytes can be cultured from lean and obese patients, different adipose depots, co-cultured with different cell types, and importantly, can be kept in culture for 2 weeks. Functional experiments can also be performed on MAAC including glucose uptake, lipogenesis, and lipolysis. Moreover, MAAC responds robustly to diverse pharmacological agonism and can be used to study adipocyte phenotypic changes, including the transdifferentiation of white adipocytes into brown-like fat cells.

Isolation and Culture of Human Mature Adipocytes Using Membrane Mature Adipocyte Aggregate Cultures MAAC

Membrane mature adipocyte aggregate culture (MAAC) is a new method to culture mature human adipocytes. Here we detail how to isolate adipocytes from human adipose and how to set up MAAC.

膜成熟性アディポサイト凝集培養(MAAC)を用いたヒト成熟性の単離と培養

White adipose tissue (WAT) dysregulation plays a central role in development of insulin resistance and type 2 diabetes (T2D). To develop new treatments ...