Name: novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology
Uploaded: 2016-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
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我々は、迅速なプロトコルを設定し、必要なプラスミドを提供することで、それらの有益な助言のための教授ジェフGerstとボリスSlobodinに感謝します。また、LC-MS / MS分析と彼女の助けをSmolerプロテオミクスセンターからこのプロトコルと博士タマルジブを確立する上で彼女の助けのために博士Avigail ATIR-ランデに感謝します。我々はYEF3抗体について教授TG Kinzy（ラトガーズ）をお願いいたします。この作品は、国間科学財団からの助成金2011013によってサポートされていました。

注：12 MS2結合部位からなる配列を挿入（MS2はループ; MS2L）を希望のゲノム遺伝子座に、通常のオープンリーディングフレーム（ORF）および3 &#39;UTRの間。この統合のための詳細なプロトコルは、他の場所22に設けられています。 PCR、ノーザン分析またはRT-PCR 20,23により適切な挿入および発現を確認してください。統合が3&#39;UTRの合成に介入しなかったことを確認することが重要です。また、誘導性プロモーター（メチオニン枯渇）の発現下SBPに融合プラスミド発現MS2-CPはまた、細胞24に導入されるべきです。導入MS12ループを除く同一の株は、非特異的なシグナルを検出するための対照として使用されるべきです。 1.迅速な精製<ol><li> MS2タグmRNAの20を発現する （目的の遺伝子の発現レベルに応じて酵母細胞の250-1,000 mlで使用）、酵母細胞を500mlの成長と適切な増殖培地（ 例えば 、合成デキストロース（SD）選択培地）中で30°Cの時に1.0 - MS2-CP-GFP-SBP融合タンパク質24は 600 0.8 ODまで。 </li><li> RTで4分間、3000×gで遠心分離細胞と上清を捨てます。 </li><li> MS2の発現を誘導するために30°Cの時60分- 1×リン酸洗浄細胞は、生理食塩水（PBS）、（ステップ1.2）以前のように遠心分離、メチオニンなしのSD等量の（ステップ1.1）で再懸濁し、45インキュベートをバッファリング-CP-GFP-SBP融合タンパク質。 注：長い誘導時間は、GFPの凝集を引き起こす可能性があります。 </li><li>細胞の脇に10ミリリットルを設定し、単純な「ホットフェノール」の方法25を使用して、このサンプルからRNAを抽出します。注意：フェノールは非常に有毒であり、その安全上の指示に従って処理してください。 注：このRNAが単離されたRNA（ 図1A）の品質のために良いの参照です。 </li><li> 500ミリリットルの細胞については、最終的なCに1.35ミリリットル37％ホルムアルデヒドを追加RNA-タンパク質複合体を架橋するために、0.1％のoncentration。 10分間30°Cのインキュベーションを続けます。注意：ホルムアルデヒドは非常に有毒であり、その安全上の指示に従って処理してください。 </li><li> 0.125 Mの最終濃度を2.5 26.5 mlのMグリシンを追加し、架橋を停止する3分間インキュベートします。上のこの段階から、RNA分解を最小限に抑えるために氷の上にすべてをかけます。 </li><li> 4°Cので4分間、3000×gで遠心分離細胞と45ミリリットルの冷1×PBSで洗浄します。 </li><li>最初の細胞培養の100ミリリットル当たり1ミリリットル急速な溶解緩衝液中で細胞を再懸濁し。 </li><li>スクリューキャップマイクロチューブに500μlのアリコートに分割し、各アリコート（約フル0.2ミリリットルのPCRチューブ）に冷却されたガラスビーズの〜400ミリグラムを追加します。 </li><li>ビーズにおける溶解細胞を3分間ビーター。直ちに氷上に溶解液を入れました。 注：RNA分解の主な原因である細胞溶解リリース細胞のRNaseを、。迅速な溶解緩衝液は、RNアーゼINHIを高濃度に含んでいますこのような非特異的RNase阻害剤ヘパリンと特異的阻害剤としてbitors、。素早く作業と冷たいすべてを維持することも推奨されます。 </li><li>新しいチューブにライセートを転送します。ピアースホット針（0.8ミリメートル×40 mm）の各マイクロチューブの底に小さな穴と、15 mlチューブの上にマイクロチューブを配置します。マイクロチューブや15ミリリットルチューブ間のアダプタとして5ミリリットル注射器のヘッドを使用してください。 4 O℃で1分間、3,000×gでチューブアセンブリを遠心</li><li>細胞の破片をクリアするには、4 O℃で10分間万×gで新しい1.5 mlチューブと遠心分離機にフロースルー15mlチューブからの転送。 </li><li>それぞれのプールシングル15ミリリットルチューブにすべての1.5ミリリットルチューブからの上清、および脇RNAとタンパク質を単離するための溶解液の1/50と1/100量を設定し、。 注：これらは、その後の分析のための「入力」のサンプル（ 図1）として機能します。 </li><li>私の500ミリリットル当たりアビジン300μgのを追加します。nitial酵母培養し、一定の圧延（10回転）の下で4°Cの時に（これは10分に短縮することができます）30分間インキュベートします。 注：ストレプトアビジンビーズへの結合からアビジンブロックビオチンおよびビオチン化タンパク質。 </li><li>細胞溶解物とのインキュベーション前に、ストレプトアビジンビーズを事前に洗います。 <ol><li> 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにストレプトアビジンビーズスラリーの約300μLを移し、上部の上清を除去します。これは、ビーズを250μlになります。迅速な溶解用緩衝液1mlで2回ビーズを洗浄してください。各ステップの間に4 O Cで2分間、660×gでストレプトアビジンビーズを遠心します。 </li><li>迅速な溶解緩衝液0.5mlを、10 mg / mlでBSAおよび10mg / mlの酵母tRNAの10μlを0.5mlで1時間インキュベートすることによってビーズを遮断します。必要に応じて、ビーズを回転させながら4°Cのでブロッキング溶液中でO / Nままにすることができます。 </li><li>急速な溶解緩衝液1mlで二回洗浄します。 注：磁気ビーズは、時間とbackgrを減少させるためにも使用することができますound。これらは、しかしながら、セファロースビーズより低い容量を有します。 </li></ol></li><li> （ステップ1.14から）アビジン含有溶解液に予め洗浄したストレプトアビジンビーズの250μlを添加して、一定の回転（10回転）と4℃で1時間インキュベートします。 注：このインキュベーション時間は、十分な結合時間を提供し、RNA分解の可能性を最小限に抑えるとの間の妥協です。 </li><li>ストレプトアビジンビーズを消去し、新しい15mlチューブに上清を移す4 O℃で2分間、660×gで遠心分離します。それぞれ、脇RNAとタンパク質を単離するための溶解液の1/50と1/100量を設定します。 注：これらは、「未結合」のサンプルになります。 </li><li>急速な溶解緩衝液1mlでビーズを洗浄し、軽く振って、新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに移し、ステップ1.17のように遠心分離。この手順を3回繰り返します。 </li><li> 4℃で5分間、1迅速な洗浄緩衝液のmlであり、この時間回転（10回転）でビーズを洗浄します。二回、この手順を繰り返します。 </l私&gt; <li>上記のように1×PBSと遠心1mlでビーズを洗浄します。 </li><li> 1×PBS120μlの再びビーズを洗浄します。遠心分離は、上記のように、そして「ウォッシュ」サンプルとしてRNAとタンパク質抽出のための全体上清を取ります。 注：この最後の洗浄サンプルは、洗浄のストリンジェンシーを示しますし、溶出サンプルと同じボリュームである必要があります。これは、その後のアッセイの処理およびロードを簡素化します。 </li><li>カラムからRNAおよびRNA結合タンパク質を溶出するために、1×PBSで6 mMのビオチンの120μlを添加し、一定の回転（10回転）で4℃で45分間インキュベートします。 </li><li>遠心分離機は、ビーズのように、上記と新しい1.5 mlチューブに溶出された物質を移します。再び溶出された試料をスピンし、ビーズのないキャリーオーバーを確保しないように新しい1.5 mlチューブに上相を転送します。 </li><li> RNAまたはタンパク質抽出のためのサンプルを取ります。 注：撮影したボリュームは、目的のRNAまたはタンパク質の以下のアッセイおよび発現レベルに依存すべき。ガイドラインとしては、ノーザン分析26のために、新しいタンパク質を発見するために29ウエスタンブロット23,27またはRT-PCR 28のために、20％を取り、質量分析のために、サンプルの80％を取る、全体のサンプルを取ります。 </li></ol> 2. RNA抽出<ol><li> 2倍架橋反転バッファーを等量加え、65℃で45分間インキュベートします。 RNA抽出のために直接進みます。 注：架橋反転バッファが大幅にRNA抽出20を向上させるエチレンジアミン四酢酸（EDTA）が含まれています。 </li><li> 「入力」と「未結合」のサンプル（1.13と1.17ステップ）からRNAを抽出するためにクロロホルム法26：標準のフェノールを使用してください。 注：これらのサンプルは、アッセイを利用し、その後の逆転写酵素（RT）を阻害することができるRNase阻害剤ヘパリンを多量に含む（ 例えば 、RT-PCR）、したがって、LiClを沈殿30は、それを取り除くことが推奨されます。 「WASH」と「溶出」サンプル（1.21と1.24ステップ）は、RNAの低量が含まれており、次のような工程を経て沈殿させます。 </li><li> 「洗浄」と「溶出」サンプルに8Mグアニジン塩酸（のGuHCl）と100％の2倍容量のエタノールを等量加えます。少なくとも2時間、-80℃でインキュベートします。 注：グアニジンを効率的にタンパク質を変性し、それによって試料中のRNaseおよびプロテアーゼを阻害します。 </li><li> 30分20,000×gで、4℃で遠心分離し、上清を捨てます。 20,000×gで再び冷たい80％エタノールおよび遠心分離機で15分間、4°Cをペレットを洗浄。 </li><li> RNaseを含まない水400μlの中でRNAペレットを溶解し、残ったのGuHClまたは他の汚染物質を除去するために再び沈殿します。 3 M酢酸ナトリウム、pH 5.2および100％エタノール800μlの40μlのを追加し、少なくとも1時間、-20℃でインキュベートします。 </li><li>遠心分離し、ステップ2.4のように洗浄し、10μlのチップですべてのエタノールを除去。 RNAペルを再懸濁し10μlのRNaseフリー水でら。 RNAペレットは通常表示されないように細心の注意を払ってください。 注：23（ 図1）で説明したように試料をノーザン分析のために使用することができます。 </li></ol> 3.タンパク質ウエスタンブロットまたは質量分析のための準備<ol><li>タンパク質試料に4倍のLaemmliサンプルバッファー（LSB）の1/3量を加え、RNAとタンパク質の架橋を逆に65℃で45分間インキュベートします。 注：サンプルは-20℃で保存することができます。 </li><li> SDSポリアクリルアミドゲル（SDS-PAGE）31上のタンパク質を実行します。分析すべきタンパク質のサイズに応じてゲルの割合を調整します。 注：10％アクリルアミドゲルは、分離の広い範囲を提供し、第一近似として良いです。 </li><li>分離効率（ 図 1C）の制御のための標準的なイムノブロット分析27のように膜にタンパク質を移します。クマシーブルーRのいずれかで染色質量分析の前に、250または銀染色。 注：それはより敏感で、より良い検出（ 図1B）ことができますので、シルバーステインは好ましい選択です。染色は手動で調製した溶液または市販のキットのいずれかで行うことができます。最終的な染料溶液中のゲルのインキュベーション時間は、実験的に決定されるべきです。長いインキュベーションは、低濃度タンパク質を明らかにすることができるが、このようなMS2-CP-SBP-GFPのような高度に発現されたタンパク質は、上で染色すると、その周辺でタンパク質を取り巻く隠すことが発生する可能性があります。さらに、高いバックグラウンドが発生することがあります。慎重に反応を追跡し、適切な時に停止液を追加します。 </li><li>ゲルからバンドを切り取り、1.5 mlチューブに移します。 -20℃で保存サンプルは、またはLC-MS / MS分析32に続いてタンパク質抽出及びトリプシン消化のために送信します。 </li><li>ゲル分離工程を除外するための代替プロテオミクスアプローチとして、そうでステップ1.24から溶出された材料を消化LC-MS / MS分析33にトリプシンと対象を使用してリューション。 注：SDS-PAGE分離を省略すると、プロトコルが単純化され、歩留まりを向上させます。ただし、サンプルは、洗剤NP-40、質量分析を阻害するの痕跡が含まれている可能性があります。この問題を克服するために、次の手順を実行します。 <ol><li> 15分- 10のためにSDS-PAGE 31上のタンパク質を実行します。 </li><li>レーンの全体部分を切り取り（ すなわち 、タンパク質が入っています）。 注：タンパク質試料が少量のタンパク質のシグナルを不明瞭にすることができるMS2-CP-SBPの有意な量のタンパク質が含まれる場合があります。 </li></ol></li></ol>

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-solution+digestion+of+proteins+for+mass+spectrometry.">In-solution digestion of proteins for mass spectrometry.</a> Methods Enzymol. 405, 50-65 (2005).</li><li>Bachler, M., Schroeder, R., von Ahsen, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StreptoTag:+a+novel+method+for+the+isolation+of+RNA-binding+proteins.">StreptoTag: a novel method for the isolation of RNA-binding proteins.</a> RNA. 5, 1509-1516 (1999).</li><li>Oeffinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+steps+forward--one+step+back:+advances+in+affinity+purification+mass+spectrometry+of+macromolecular+complexes.">Two steps forward--one step back: advances in affinity purification mass spectrometry of macromolecular complexes.</a> Proteomics. 12, 1591-1608 (2012).</li><li>Ross, A. F., Oleynikov, Y., Kislauskis, E. H., Taneja, K. L., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+beta-actin+mRNA+zipcode-binding+protein.">Characterization of a beta-actin mRNA zipcode-binding protein.</a> Mol Cell Biol. 17, 2158-2165 (1997).</li><li>Deshler, J. O., Highett, M. I., Schnapp, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+Xenopus+Vg1+mRNA+by+Vera+protein+and+the+endoplasmic+reticulum.">Localization of Xenopus Vg1 mRNA by Vera protein and the endoplasmic reticulum.</a> Science. 276, 1128-1131 (1997).</li><li>Bertrand, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+ASH1+mRNA+particles+in+living+yeast.">Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast.</a> Mol Cell. 2, 437-445 (1998).</li><li>Aizer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+mRNA+targeting+to+P-bodies+in+living+human+cells+reveals+their+dual+role+in+mRNA+decay+and+storage.">Quantifying mRNA targeting to P-bodies in living human cells reveals their dual role in mRNA decay and storage.</a> J Cell Sci. 127, 4443-4456 (2014).</li><li>Gadir, N., Haim-Vilmovsky, L., Kraut-Cohen, J., Gerst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+mRNAs+coding+for+mitochondrial+proteins+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> RNA. 17, 1551-1565 (2011).</li><li>Lopez de Heredia, ., M, R. P., Jansen, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+integrity+as+a+quality+indicator+during+the+first+steps+of+RNP+purifications+:+a+comparison+of+yeast+lysis+methods.">RNA integrity as a quality indicator during the first steps of RNP purifications : a comparison of yeast lysis methods.</a> BMC Biochem. 5, 14 (2004).</li><li>Lee, J. S., Kallehauge, T. B., Pedersen, L. E., Kildegaard, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+integration+in+CHO+cells+mediated+by+CRISPR/Cas9+and+homology-directed+DNA+repair+pathway.">Site-specific integration in CHO cells mediated by CRISPR/Cas9 and homology-directed DNA repair pathway.</a> Sci Rep. 5, 8572 (2015).</li><li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Res. 24, 142-153 (2014).</li><li>Oda, Y., Huang, K., Cross, F. R., Cowburn, D., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantitation+of+protein+expression+and+site-specific+phosphorylation.">Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 6591-6596 (1999).</li><li>de Godoy, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SILAC+yeast:+from+labeling+to+comprehensive+proteome+quantification.">SILAC yeast: from labeling to comprehensive proteome quantification.</a> Methods Mol Biol. 1156, 81-109 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

様々な方法は、関連するタンパク質11,34 35を識別するために、特定のmRNAの単離を使用します。これらの方法は、RNA-タンパク質相互作用を調べるために、in vitroおよびin vivo戦略に適用する。 インビトロ方法は、外因RBPsを捕捉し、RNP複合体36,37を単離するために細胞溶解物を用いてRNAを転写インキュベートします。このタイプの効果的?...

RNA結合タンパク質（RBPs）はSの約10％を占めセレビシエタンパク質1,2および哺乳動物タンパク質3-5の約15％。これらは、mRNAの転写後プロセシングおよび調節、翻訳、リボソーム生合成、tRNAのアミノアシル化と修正、クロマチンリモデリング、およびより多くのような多くの細胞プロセスに関与しています。 RBPsの重要なサブグループは、mRNA結合タンパク質（mRNPs）6,7です。 mRNAの成熟の過程において、異なるRBPsは、転写物と結合し、その核処理、核のうち輸出、細胞内局在、翻訳および劣化6-8を媒介します 。したがって、任意の時点で特定の転写産物に結合しているRBPsの別個のセットは、その処理し、最終的にその運命を決定します。 mRNAと関連RBPsの識別が大幅に転写後調節の基礎をなす過程の理解を向上させることができます。遺伝的多様顕微鏡、生化学およびバイオインフォマティクス方法は、（9-11に概説）mRNAの調節に関与するタンパク質を同定するために使用されてきました。しかしながら、これらの方法のほんの数は、特定の標的mRNAと関連するタンパク質の同定を可能にします。注目すべきは、酵母細胞における発現ライブラリーをスクリーニングするために餌として関心のmRNAを利用した酵母スリーハイブリッドシステム（Y3H）、です。陽性クローンは、通常の成長の選択またはレポーター発現12-14を通して観察されます。この方法の重要な利点は、細胞環境およびRNA-タンパク質相互作用の強さを測定する能力に走査することができる多数のタンパク質です。欠点は、融合タンパク質の餌または餌RNAのミスフォールディングに、部分的に、非特異的結合に起因する偽陽性の結果の比較的大きい数、により偽陰性の結果のために高い可能性を含みます。 遺伝的アプローチに代わるものは親和性purifiですその関連タンパク質とRNAのカチオン。ポリAを含むmRNAは、オリゴdTカラムの使用によって分離することができ、およびそれらの関連タンパク質は、質量分析によって検出されます。 RNA-タンパク質相互作用は、短距離共有結合を作る架橋によってその細胞コンテキストに保存されています。オリゴdTカラムの使用は、任意のポリA-含むmRNA 3,5,15に関連付けられているプロテオーム全体のグローバルな視点をもたらします。しかし、これは、特定のmRNAに関連付けられているタンパク質のリストを提供していません。非常に少数の方法は、このような識別を達成するために利用可能です。 PAIRの方法は、標的mRNAの16,17に対する相補性を有する核酸のトランスフェクションを伴います。核酸はまた、相互作用部位に近接してRBPsに架橋可能ペプチドに付着されます。架橋後、RBP-ペプチド核酸を単離することができ、プロテオミクス分析に供​​しました。最近、アプタマーベースの方法論がありました正常哺乳動物細胞株18からの抽出物に適用されます。ストレプトアビジンへの改善された親和性を有するRNAアプタマーを開発し、（この場合はAUリッチエレメント（ARE））目的の配列に融合させました。アプタマーARE RNAをストレプトアビジンビーズに付着し、細胞溶解物と混合しました。 ARE配列に関連するタンパク質を精製し、質量分析（MS）により同定しました。この方法は、細胞の設定（ すなわち 、 インビトロ ）の外側に発生する関連付けを検出しているが、mRNAに関連するタンパク質の単離をゲノムにアプタマーを導入し、従って、可能なように、将来的に修飾される可能性が高いにある間細胞環境（ すなわち 、in vivoで ）。遺伝子操作は、十分に確立された酵母では、（教授ジェフGerstの研究室で開発された）迅速法は、in vivo団体19のビューを提供します。ラピッド（MS2コートタンパク質の特異的かつ強力な結合を兼ね備えMS2-MS2 RNA配列に、ストレプトアビジン結合ドメイン（SBP）のストレプトアビジン結合ビーズにCP）。これは、ストレプトアビジンビーズを介してMS2-タグ付けされたmRNAの効率的な精製を可能にします。また、MS2は、ループの12のコピーの発現は、RNAに同時に結合し、その分離の効率を高めるために6 MS2-のCPまで使用できます。このプロトコルは、従って、溶出された試料を質量分析によってプロテオミクス分析に供​​された後、新規のmRNA結合タンパク質の同定を可能にするために示唆されました。 我々は最近、酵母PMP1 mRNAを20に関連付けられた新規タンパク質を同定するための迅速を利用した。PMP1 mRNAが以前にER膜と関連することが示され、その3 &#39;非翻訳領域（UTR）は、この関連21の主要な決定要因であることが判明しました。したがって、PMP1 3 &#39;UTRに結合RBPsその局在に重要な役割を果たす可能性があります。 RAPIDは、液体クロマトグラフが続きますY字型質量分析/質量分析（LC-MS / MS）は、PMP1 20と相互作用する多数の新規タンパク質の同定をもたらしました。ここで、我々は急速な方法論、実行する必要がある重要なコントロール、および収量と特異性を向上させることができる技術的なヒントの詳細なプロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>bio-lab</td><td>1981232300</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Phenol (pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P4682</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Phenol: Chloroform (5:1, pH 4.3)</td><td>sigma</td><td>P1944</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>bio-lab</td><td>3080521</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Frutarom</td><td>5551820</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>Soybean Trypsin Inhibitor</td><td>Sigma</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease&amp;nbsp; Inhibitor</td><td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Glass Beads</td><td>Sartorius</td><td>BBI-8541701</td><td>0.4-0.6mm diameter&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mini BeadBeater</td><td>BioSpec</td><td>Mini BeadBeater 16</td><td></td></tr><tr><td>Guanidinium</td><td>Sigma</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Sigma</td><td>A9275</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Beads</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>17-5113-01</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Yeast tRNA</td><td>Sigma</td><td>R8508</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Bacto</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>peptone</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer (LSB)</td><td></td><td></td><td>0.2 M Tris-Hcl pH 6.8, 8% SDS, 0.4 M DTT, 40% glycerol, 0.04% Bromophenol-Blue.</td></tr><tr><td>Hot phenol lysis buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 0.5% SDS&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>3 M Sodium Acetate pH 5.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% and 70% Ethanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RaPID lysis buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.8 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 0.5% NP-40, 5 mg/ml Heparin, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonyl Flouride (PMSF), 10 &amp;micro;g/ml Leupeptin, 10 &amp;micro;g/ml Aprotinin, 10 &amp;micro;g/ml Soybean Trypsin Inhibitor, 10 &amp;micro;g/ml Pepstatin, 20 U/ml DNase I, 100 U/ml Ribonuclease&amp;nbsp; Inhibitor.</td></tr><tr><td>2x Cross-linking reversal buffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS.</td></tr><tr><td>RaPID wash buffer</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl pH 7.5,&amp;nbsp; 300 mM NaCl, 0.5% NP-40</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>161-0449</td><td>For detecting proteins in polyacrylamide gels</td></tr><tr><td>SD selective medium&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>1.7 g/l Yeast nitrogen base with out amino acids and ammonium sulfate, 5 g/l Ammonium sulfate, 2% glucose, 350 mg/l Threonine, 40 mg/l Methionine, 40 mg/l Adenine, 50 mg/l Lysine, 50 mg/l Tryptophan, 20 mg/l Histidine, 80 mg/l Leucine, 30 mg/l Tyrosine, 40 mg/l Arginine</td></tr><tr><td>Anti-eEF3 (EF3A,YEF3)</td><td>Gift from Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School)</td><td>1:5,000</td><td></td></tr><tr><td>Anti GFP antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8334</td><td>1:3,000</td></tr><tr><td>Anti rabbit IgG-HRP conjugated</td><td>SIGMA</td><td>A9169</td><td>1:10,000</td></tr></tbody></table>

novel rna-binding proteins isolation by the rapid methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RAPIDは、その関連タンパク質との特異的標的RNAの単離を可能にします。その成功のために重要なことにより、タンパク質の十分な量を得る、可能な限り無傷のRNAを保っています。 RNAの単離効率と品質を決定するために、ノーザン分析は（ 図1A）が行われます。ノーザン分析は、直接迅速の効率と品質を報告するという利点を有します。したがって、完全?...

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Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

8.9K ビュー.  Technion - Israel Institute of Technology. RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell. 

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Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

生化学

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most cases, the action of noncoding RNAs is mediated by proteins whose functions are in turn regulated by these interactions with noncoding RNAs. Consistent with this, a growing number of proteins involved in nuclear functions have been reported to bind RNA and in a few cases the RNA-binding regions of these proteins have been mapped, often through laborious, candidate-based methods.
Here, we report a detailed protocol to perform a high-throughput, proteome-wide unbiased identification of RNA-binding proteins and their RNA-binding regions. The methodology relies on the incorporation of a photoreactive uridine analog in the cellular RNA, followed by UV-mediated protein-RNA crosslinking, and mass spectrometry analyses to reveal RNA-crosslinked peptides within the proteome. Although we describe the procedure for mouse embryonic stem cells, the protocol should be easily adapted to a variety of cultured cells.

We describe a protocol to identify RNA-binding proteins and map their RNA-binding regions in live cells using UV-mediated photocrosslinking and mass spectrometry.

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA structures and motifs. In this RNA-pulldown protocol, commercially synthesized RNA probes are labeled with a modified form of biotin, desthiobiotin, at the 3' terminus of the RNA strand, which reversibly binds to streptavidin and thus allows elution of proteins under more physiological conditions. The RNA-desthiobiotin is immobilized through interaction with streptavidin on magnetic beads, which are used to pull down proteins that specifically interact with the RNA of interest. Non-denatured and active proteins from the cytosolic fraction of mesothelioma cells are used as the source of proteins. The method described here can be applied to detect the interaction between known RNA binding proteins and a 25-nucleotide (nt) long RNA probe containing a sequence of interest. This is useful to complete the functional characterization of stabilizing or destabilizing elements present in RNA molecules achieved using a reporter vector assay.

Desthiobiotin labeling of a synthetic 25-nucleotide RNA oligo, which contains an adenine-rich element (ARE) motif, allows specific binding of cytosolic ARE-binding protein.

Desthiobiotin ストレプトアビジンの親和性による中皮腫細胞の RNA 結合タンパク質の精製

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

がん研究

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein complexes is essential to understanding mRNA regulation inferred by interacting proteins or non-coding RNAs. Herein, we describe a tandem RNA isolation procedure (TRIP) that enables the purification of endogenously formed mRNA-protein complexes from cellular extracts. The two-step protocol involves the isolation of polyadenylated mRNAs with antisense oligo(dT) beads and subsequent capture of an mRNA of interest with 3&#39;-biotinylated 2&#39;-O-methylated antisense RNA oligonucleotides, which can then be isolated with streptavidin beads. TRIP was used to recover in vivo crosslinked mRNA-ribonucleoprotein (mRNP) complexes from yeast, nematodes and human cells for further RNA and protein analysis. Thus, TRIP is a versatile approach that can be adapted to all types of polyadenylated RNAs across organisms to study the dynamic re-arrangement of mRNPs imposed by intracellular or environmental cues.

A tandem RNA isolation procedure (TRIP) for recovery of endogenously formed mRNA-protein complexes is described. Specifically, RNA-protein complexes are crosslinked in vivo, polyadenylated RNAs are isolated from extracts with oligo(dT) beads, and particular mRNAs are captured with modified RNA antisense oligonucleotides. Proteins bound to mRNAs are detected by immunoblot analysis.

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

遺伝学

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

生物学

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and readily available form of data collection. In many research and disease models however, steady state levels of target gene mRNA does not always directly correlate with steady state protein levels. Post-transcriptional gene regulation is a likely explanation of the divergence between the two. Driven by the binding of RNA Binding Proteins (RBP), post-transcriptional regulation affects mRNA localization, stability and translation by forming a Ribonucleoprotein (RNP) complex with target mRNAs. Identifying these unknown de novo mRNA targets from cellular extracts in the RNP complex is pivotal to understanding mechanisms and functions of the RBP and their resulting effect on protein output. This protocol outlines a method termed RNP immunoprecipitation-microarray (RIP-Chip), which allows for the identification of specific mRNAs associated in the ribonucleoprotein complex, under changing experimental conditions, along with options to further optimize an experiment for the individual researcher. With this important experimental tool, researchers can explore the intricate mechanisms associated with post-transcriptional gene regulation as well as other ribonucleoprotein interactions.

A step by step protocol to isolating and identifying RNA associated complexes through RIP-Chip.

RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と​​同定するための方法

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

RNA-Protein Pull-Down Assay to Isolate RNA-Binding Proteins via Affinity Extraction

Source: Kresoja-Rakic, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/57516">Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates an in vitro RNA pull-down assay to identify RNA-binding proteins (RBPs), which interact with the adenylate-uridylate-rich element (ARE) sequences in mRNA. The target RBPs from a cell lysate are mixed with an RNA probe to form RNA-protein complexes. The complexes are isolated via affinity purification utilizing the affinity of the desthiobiotin label of the RNA probe to a streptavidin-labeled magnetic bead.

アフィニティー抽出による RNA-Binding Protein の単離のための RNA-Protein プルダウンアッセイ

Source: Kresoja-Rakic, J., et al. Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells. J. Vis. ...

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

要約

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オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Desthiobiotin ストレプトアビジンの親和性による中皮腫細胞の RNA 結合タンパク質の精製

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と同定するための方法

アフィニティー抽出による RNA-Binding Protein の単離のための RNA-Protein プルダウンアッセイ

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

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オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Desthiobiotin ストレプトアビジンの親和性による中皮腫細胞の RNA 結合タンパク質の精製

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

細菌におけるタンパク質-RNA結合を定量するためのアッセイ

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

短いビオチン化RNAを用いたRNA結合タンパク質の最適化された定量的プルダウン解析(英語)

RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と​​同定するための方法

アフィニティー抽出による RNA-Binding Protein の単離のための RNA-Protein プルダウンアッセイ

RIP-チップを用いた細胞抽出物からmRNAを、マイクロRNAとリボ核タンパク質複合体のタンパク質成分の分離と同定するための方法